专利名称：在干旱条件下提高黑麦草抗氧化酶活性的方法
技术领域：
本发明属于环境保护技术领域，涉及城市生活垃圾堆肥的合理使用。更具体的说是一种在干旱条件下采用细微生活垃圾堆肥提高黑麦草抗氧化酶活性的方法。
背景技术：
草坪对城市绿化、环境保护和生态平衡起着重要的作用。草坪草的种植和保养需 要大量的水分；而草坪对灌溉用水的大量需求使得草坪的养护成本极高，这对于淡水资源 相对贫乏的中国来说无疑是一个承重的负担，也限制了草坪业的发展。草坪传统节水方式 是通过抗旱品种的选育、草坪经济灌溉量及灌溉方式的选择等方法；目前，草坪节水技术有 了新的发展保水肥料的引进在一定程度上促进了草坪的节水能力。焦晋川等研究了钾肥 对黑麦草抗旱性的影响，以黑麦草种子的发芽率、叶片厚度和根冠比为评价指标，来筛选出 适宜草坪草生长的钾肥施量，提高其抗旱能力。王生银等研究了硅肥对草地早熟禾抗旱性 的效应及机制影响。薛波等研究了氯化钙、水杨酸和保水剂对珙桐幼苗抗旱性的影响。生 活垃圾堆肥的资源化利用方式多种多样。城市生活垃圾堆肥用作草坪基质的研究有一些报道(多立安等，2000 ；李艳霞 等，2002 ；赵树兰等，2009)。此外，国内外把生活垃圾堆肥作为一种肥料来改善草坪草 观赏特征和质量特征，这方面也有较多报道(Baker A V, 2001 ；HadaS A et al.，2004)。 Mishra等(2009)研究了生活垃圾堆肥与土壤不同比例组配后对植物的长势和体内元素 含量变化的影响。从以前的研究来看，无论是有机物质还是矿物质，因种类和颗粒大小不 同，其理化性质与土壤中养分及作用方式都存在很大差异(章明奎，2006 ；王岩等，2000)。 Christensen (1998)研究发现，3种不同土壤施用堆肥后，其不同粒径中的含氮量发生了变 化。Eary(1990)和Hinds(1989)的研究也发现，由于细颗粒具有较大的比表面积，因此，养 分、重金属及微量元素等优先浓集于土壤细颗粒组分中。目前，城市生活垃圾堆肥作为基质用于草坪建植的研究有一定的报道。此外，未经 处理的城市生活垃圾粗堆肥在草坪抗旱中应用已有报道，但效果不佳，没有从根本上解决 问题。从已有的研究来看，以前对于垃圾堆肥的研究多集中在粗堆肥的整体利用上，这样粗 放的做法如果长期应用于土壤或植物的生长，不但会破坏土壤的微环境，而且对于提高资 源的利用效率也是不利的。如果将生活垃圾堆肥经过粉碎机处理形成不同的粒径，从而去 除堆肥某些粒径中积累过多的有害物质，保留为植物生长提供养分以及改善土壤理化性质 的堆肥颗粒，将经过处理的堆肥用于草坪抗旱节水，可以发挥堆肥特定颗粒中有机质和营 养元素丰富的优势，调节土壤的物理结构，达到优化土壤理化性质，改良土壤的作用。有关 这一方法目前国内外尚无文献报道。
发明内容
本发明提供了一种在干旱条件下提高黑麦草抗氧化酶活性的方法(1)将城市生活垃圾堆肥先去除各类杂物，然后在105°C条件下烘干至恒重，筛分出1700nm粒径的堆肥；将1700nm粒径堆肥在24000转/分下粉碎，制备出1200nm、600nm 和300nm不同粒径的垃圾微肥；(2)采用直径7cm，高IOcm的塑料盆，每盆150g 土壤，播种草坪植物0. 5g/盆，将 粒径分别为1200nm、600nm和300nm的垃圾微肥均勻撒于土壤表面，其中粒径与土壤的重量 份数比为1 60-80倍。(3)控制温度为20 26°C，相对湿度为40% 60%，光照为透入室内的自然光； 播种初期，充分浇水，保证种子能顺利萌发和幼苗初期的生长，两个星期以后按照田间持水 量的55% -65%浇水，以后每一至两天称重浇水，以维持在胁迫范围内，第44d开始测定各 指标；其堆肥中有机质含量22. 00 %，容重0. 79g. cm"3, pH值7. 62，孔 隙度67. 98 %，饱和 含水量66. 58%，全氮0. 57%，全磷0. 34%，全钾1. 21%。植物在受到逆境胁迫时会产生活性氧类物质，为防御活性氧的伤害作用，植物体 内存在着抗氧化酶防御系统，使活性氧的产生与清除维持在一个动态平衡，活性氧不会累 积，对植物起保护作用。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)是组 成抗氧化酶系统的重要酶，其活性的高低反应植物受逆境胁迫的程度及植物自身抵御外界 胁迫的能力。因此，本实验着眼于不同粒径垃圾堆肥对整个土壤-草坪植物系统的影响，通过 细微堆肥在土壤干旱条件下对草坪植物黑麦草POD、SOD和CAT活性的影响进行研究。探讨草坪植物对不同细微粒径城市生活垃圾堆肥的响应机制，为细微粒径城市生 活垃圾堆肥应用于草坪建植体系提供技术支撑。本发明的详细方法如下1.1 材料本实验选自北方比较常见的多年生黑麦草(Festuca-arundinacea.)实验材料。 实验采用杯栽的方法，杯子规格为250ml。供试垃圾堆肥取自天津市小淀生活垃圾堆肥处 理厂，先由人工捡去垃圾堆肥中的各类木头、塑料、玻璃、金属等杂物，然后在105°C条件 下烘干8h至恒重，采用不同孔径的标准筛进行筛分，选出粒径为60目的堆肥。其基本理 化性质为有机质含量22. 00 %，容重0. 79g. cm—3，pH值7. 62，孔隙度67. 98 %，饱和含水 量66. 58%，全氮0. 57%，全磷0. 34%，全钾1.21%。供试土壤取自天津师范大学实验地 0 20cm深的表层土壤。其土壤性质为pH7. 44，有机质含量4. 68%，全氮0.21%，有效磷 22. 03mg. kg、饱和含水量0. 58ml. g4，土壤质地为砂质粘土。1. 2不同粒径堆肥制备及其粒径电镜分析实验所用堆肥先去除其中的各类木头、塑料、玻璃、金属等杂物，然后在105°C条件 下烘干至恒重，筛分出1700nm粒径的堆肥.将1700nm粒径堆肥在24000转/分下粉碎， 时间分别为lmin、2min和3min，以制备出不同粒径的垃圾微肥，用S4800场发射扫描电镜 (S4800, JAPAN)微细城市生活垃圾堆肥粒径分别为1200nm、600nm和300nm。1.3草坪植物建植利用不同细微的堆肥进行植物培养，草坪植物培养基质重量为每盆180g底土(用 直径7cm，高IOcm的塑料盆)，然后将3g打磨的城市生活垃圾堆肥均勻撒于土壤表面，最后 在其上均勻覆盖20g 土。每盆播种黑麦草0.5g，每个处理重复4次。试验在天津师范大学 实验室进行，温度为20 26°C，相对湿度为40% 60%，光照为透入室内的自然光。
其次是水量的控制本实验共持续44天。播种初期，每盆充分浇水，保证种子 能顺利萌发和幼苗初期的生长，两个星期以后按照胁迫程度定量给水。田间持水量为 55% -65%，以后每一至两天称重浇水，以维持在胁迫范围内，水量的控制采用称重法。第 44d开始测定各指标生物量、叶绿素、保护酶、脯氨酸、丙二醛以及基质含水量。1. 4指标测定方法1.4. 1保护酶含量测定粗酶液提取准确称取0. 2g样叶，用磷酸缓冲液(PBS，pH7. 8)冰浴研磨提取，定容 25ml，取10ml于离心管中，lOOOOrmir^EPPENDOFF离心机离心20min，上清液为粗酶提取液。P0D活性测定采用愈创木酚法取3ml反应混和液于比色皿中，对照以pH = 7. 8 磷酸缓冲液代替，向比色皿中加0. lmL粗酶提取液，立即开启秒表计时，用UV-1700型紫外 分光光度计于470nm下测量吸光值，每分钟读1次数，共读3次。以每分钟AA47(/变化0.01 为一个过氧化物酶活性单位。反应混和液成分为50mL pH = 6. 0的磷酸缓冲液加28 y L愈 创木酚和19iiL过氧化氢。S0D活性测定采用NBT法。3ml反应混和液包括pH = 7. 8的磷酸缓冲液， 0. ImMEDTA, 13mM蛋氨酸，75 u MNBT, 2uM核黄素和0. lmL得酶提取液，不加酶液的为对照。 在人工气候箱中照射15min，不加酶液和无光照得作为空白对照。然后用UV-1700型紫外分 光光度计于560nm下测定吸光值。以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位。CAT活性测定采用紫外分光光度法。于试管中加入1. 5mlpH = 7. 8磷酸缓冲液、 lml蒸馏水、0. 2ml酶提取液，对照用缓冲液代替酶液。然后在测定管中加0. 3ml浓度为 0. lmol. L—1过氧化氢，同时立即计时，用UV-1700型紫外分管光度计于240nm下测量吸光值， 每分钟读1次数。以每分钟A A24(i变化0. 1为一个过氧化氢酶活性单位。1. 4. 2 土壤需水量的测定每天早上定点测一下盆栽的重量，然后按照胁迫的持水量定量浇水，到第二天早 上定点再测量盆栽的重量，来确定盆栽每天的耗水量。每十天为一个时间段，测定浇水量， 取其平均值。2数据处理数据分析采用EXCEL和SPSS11. 5分析软件进行处理。3研制结果分析3. 1细微堆肥对干旱胁迫下黑麦草植株POD、SOD和CAT活性的影响POD、SOD、CAT是保护酶系统的主要酶，植物的抗性及对环境的适应与其保护酶含 量密切相关。不良环境能诱发植物产生大量的自由基，其对植物膜系统及蛋白质有伤害作 用，但生物体内的保护系统能清除产生的自由基。P0D是植物抗性生理中研究较多的一种酶，它能分解植物体内过多的过氧化物。通 过表4可以看出随着干旱胁迫强度的增大，黑麦草植株P0D活性比正常供水时低；而施肥 的黑麦草植株比不施肥植株的酶活性都有所升高。其中，施用3min堆肥的黑麦草植株P0D 活性最高，比对照高出67. 8%。其次是打磨2min的堆肥，也比对照高出45. 6%。另外，通 过显著性分析可知，这3种处理的黑麦草的P0D活性存在差异。这说明在干旱胁迫下，加入 细微堆肥对黑麦草P0D活性的升高有明显的影响，其顺序为3min > 2min > lmin > 60目， 这种效应与施堆肥的粒径大小基本呈正相关趋势。
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SOD是防护氧自由基对细胞膜系统伤害的防护酶。通过表4可以看出在干旱胁 迫下，除60目植物的SOD比没加肥的低夕卜，其它都比对照高；其中3min和2min植物的SOD 活性分别比对照升高了 65.8%、10. 1%。在干旱胁迫下，加入细微堆肥时，对黑麦草SOD活 性的升高有明显的影响，其顺序为3min > Imin > 2min > 60目。过氧化氢酶广泛分布于土壤中，在微生物代谢过程中起着重要作用，它参与了土 壤中许多重要的生物化学过程，是较好的土壤微生态环境指示因子。从表1可以看出在干 旱胁迫下，不同的处理都产生了大量的CAT以阻止植物体内-OH的伤害。各个处理的CAT 含量也都高于对照，其中尤以3min细化堆肥的最高，比对照高出38. 0%。但是通过显著分 析，五种不同处理的CAT活性不存在显著差异。表1细微堆肥对草坪植物保护酶活性的影响 3. 2基质含水量的变化情况表2的试验结果可以看出，土壤需水量随干旱天数的增加而逐渐升高，控水处理 造成了明显的土壤水分胁迫。施用3min堆肥的土壤需水量在胁迫处理20d、30d时比对照 分别降低了 36. 8%U8. 2% ；施用2min堆肥的土壤需水量在胁迫处理20d、30d时比对照分 别降低了 15. 8%、13. 6%。从表6也可以看出各处理的需水量明显低于对照，并且4种处理植物的土壤含水 量变化趋势基本一致，且没有明显的差异，说明干旱胁迫处理是一致的。因此，本次试验测 定的其它生理指标之间的差异应是由植物所施用的细化程度不同的堆肥所引起的。表6基质含水量的变化 4研制结论植物本身通过抗氧化物酶保护系统来消除或减少植物生长过程中产生的活性氧 带来的伤害，主要涉及的酶有S0D、P0D、CAT等。研究发现不同的逆境胁迫下，SOD,POD,CAT 会采取不同的应答方式。鲁平等的研究表明，飞机草在高温、低温、干旱胁迫下SOD活性增 力口，POD在高温和干旱下活性升高，在低温胁迫下降低，CAT在高温胁迫下升高，在低温和干 旱胁迫下酶活性降低。王齐等的研究表明，施加土壤改良剂后SOD、POD和CAT活性值初期 低于对照，而后又能高于对照，具有敏感的反应机制，这可能是施加土壤改良剂后在一定程 度上能提高植物抗旱性的主要原因。本研究发现，在干旱胁迫下黑麦草SOD与POD活性在 放入细微堆肥后有明显升高，结合生物量与MDA含量的结果可以看出，细微堆肥促进了黑 麦草的生长，降低了 MDA含量，SOD与POD活性也随之升高；在干旱胁迫下细微堆肥可以减 轻垃圾堆肥逆境条件对植物膜脂过氧化的伤害，提高了植物的抗旱能力。干旱胁迫下，施用 2min和60目堆肥植株的CAT活性有所降低，而施用3min和Imin堆肥植株的CAT活性则有 所升高，CAT活性的提高有利于H2O2的消除，有效地保护细胞膜结构免受损伤。
具体实施例方式为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的 细节影响对本技术方案的描述。以下结合实例对本发明做进一步的说明。实施例1(1)将生活垃圾堆肥先去除其中的各类木头、塑料、玻璃、金属等杂物，然后在 105°C条件下烘干至恒重，筛分出1700nm粒径的堆肥.将1700nm粒径堆肥在24000转/分 下粉碎，时间分别为lmin、2min和3min，以制备出不同粒径的垃圾微肥，用S4800场发射扫 描电镜(S4800，JAPAN)微细城市生活垃圾堆肥粒径分别为1200nm、600nm和300nm。然后 在105°C条件下烘干至恒重，采用不同孔径的标准筛进行筛分，筛分出1700nm粒径的堆肥； 将1700nm粒径堆肥在24000转/分下粉碎，制备出1200nm、600nm和300nm不同粒径的垃 圾微肥；其中堆肥中有机质含量22. 00%，容重0. 79g. cm"3,pH值7. 62，孔隙度67. 98%，饱 和含水量66. 58%，全氮0. 57%，全磷0. 34%，全钾1. 21%.(2)在每盆180g 土壤中，分别将3g，1200nm、600nm或300nm的垃圾微肥均勻撒于
土壤表面，最后在其上均勻覆盖20g 土 ；(3)每盆播种黑麦草0. 5g，控制温度为20°C，相对湿度为60%，光照为透入室内的自然光；播种初期，充分浇水，保证种子能顺利萌发和幼苗初期的生长，两个星期以后按照 田间持水量的55%浇水，以后每一至两天称重浇水，以维持在胁迫范围内，第44d开始测定 各指标；实施例2其他同实例1然后在每盆180g 土壤中，分别将3g，1200nm、600nm或300nm的垃 圾微肥均勻撒于土壤表面，最后在其上均勻覆盖20g 土；每盆播种黑麦草0. 5g，控制温度为 26°C，相对湿度为40%，光照为透入室内的自然光；播种初期，充分浇水，保证种子能顺利 萌发和幼苗初期的生长，两个星期以后按照田间持水量的65%浇水，以后每一至两天称重 浇水，以维持在胁迫范围内，第44d开始测定各指标。实施例3
(1)将城市生活垃圾堆肥先去除各类杂物，然后在105°C条件下烘干至恒重，筛分 出1700nm粒径的堆肥；将1700nm粒径堆肥在24000转/分下粉碎，制备出1200nm、600nm 和300nm不同粒径的垃圾微肥；(2)采用直径7cm，高IOcm的塑料盆，每盆150g 土壤，播种草坪植物0. 5g/盆，将 粒径分别为1200nm、600nm和300nm的垃圾微肥均勻撒于土壤表面，其中粒径与土壤的重 量份数比为1 60倍。然后播种黑麦草0.5g，控制温度为20 26°C，相对湿度为40% 60%，光照为透入室内的自然光；播种初期，充分浇水，保证种子能顺利萌发和幼苗初期的 生长，两个星期以后按照田间持水量的55% -65%浇水，以后每一至两天称重浇水，以维持 在胁迫范围内，第44d开始测定各指标；其堆肥中有机质含量22. 00 %，容重0. 79g. cm"3, pH值7. 62，孔隙度67. 98 %，饱和 含水量66. 58%，全氮0. 57%，全磷0. 34%，全钾1. 21%。
权利要求
在干旱条件下提高黑麦草抗氧化酶活性的方法，其特征在于，(1)将城市生活垃圾堆肥先去除各类杂物，然后在105℃条件下烘干至恒重，筛分出1700nm粒径的堆肥；将1700nm粒径堆肥在24000转/分下粉碎，制备出1200nm、600nm和300nm不同粒径的垃圾微肥；(2)采用直径7cm，高10cm的塑料盆，每盆150g土壤，播种草坪植物0.5g/盆，将粒径分别为1200nm、600nm和300nm的垃圾微肥均匀撒于土壤表面，其中粒径与土壤的重量份数比为1∶60-80倍。(3)控制温度为20～26℃，相对湿度为40％～60％，光照为透入室内的自然光；播种初期，充分浇水，保证种子能顺利萌发和幼苗初期的生长，两个星期以后按照田间持水量的55％-65％浇水，以后每一至两天称重浇水，以维持在胁迫范围内，第44d开始测定各指标；其堆肥中有机质含量22.00％，容重0.79g.cm-3，pH值7.62，孔隙度67.98％，饱和含水量66.58％，全氮0.57％，全磷0.34％，全钾1.21％。
2.权利要求1所述的在干旱条件下提高黑麦草抗氧化酶活性的方法，其中的土壤质地 为壤土。
全文摘要
本发明涉及一种在干旱条件下采用细微生活垃圾堆肥提高黑麦草抗氧化酶活性的方法。它是将粒径分别为1200nm、600nm和300nm的垃圾微肥均匀撒于土壤表面，其中粒径与土壤的重量份数比为1∶60-80倍；然后播种高羊茅0.5g，控制温度为20～26℃，相对湿度为40％～60％，光照为透入室内的自然光；播种初期，充分浇水，两个星期以后按照田间持水量的55％-65％每一至两天称重浇水，以维持在胁迫范围内，第44d开始测定各指标。为细微粒径城市生活垃圾堆肥应用于草坪建植体系提供技术支撑。
文档编号A01G1/00GK101869032SQ201010191260
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者多立安, 赵树兰 申请人:天津师范大学