专利名称：一种体外保存/培养卵母细胞以维持卵母细胞减数分裂停滞的方法
技术领域：
本发明属于生殖生物学领域，是一种利用生理性成分维持生发泡期(Germinal Vesicle, GV)卵母细胞减数分裂停滞、抑制卵母细胞生发泡破裂(Germinal Vesicle Breakdown, GVBD)的方法。
背景技术：
体外成熟的卵母细胞发育能力显著低于体内成熟的卵母细胞。卵母细胞在进行核成熟的同时发生胞质成熟，从而支持随后成功发育到期。体内卵母细胞发生一系列的事件包括减数分裂前期的转录和翻译胞质逐渐成熟，然而体外从卵泡中获取的卵母细胞在转入培养液中后还没获得胞质成熟就提前发生减数分裂恢复。为了提高体外成熟卵母细胞的质量，目前主要采取药理学的方法维持减数分裂停滞，主要包括使用蛋白合成抑制剂或者磷酸化抑制剂(Fulka等，Mol Reprod Dev, 29 :379-384(1991) ；Lonergan 等，J Reprod Fertil, 109 :355-365(1997) ；Avery 等，Mol Reprod Dev，50 :334-344(1998) ；Li 等，Acta Zoologial Sinica，47(6) :684-690(2001)； Le Beux 等，Theriogenology，60 :1049-1058^003))以及 cAMP 转导抑制剂(Sirard 等， Theriogenology, 49 :483-497 (1998))。然而，药物虽然能够有效抑制卵母细胞生发泡破裂 (GVBD)发生，却往往对卵母细胞有一定的毒性。理论上低温下培养可以维持卵母细胞减数分裂停滞。然而较低温显著降低正常减数分裂纺锤体的形成OVu等，Mol Reprod Dev, 54 388-395(1999))并且低温保存的卵母细胞经体外受精显著降低受精率。由此我们需要寻找一个适度的温度条件来保存卵母细胞，并且能够维持其减数分裂停滞状态。有报道在培养液中添加部分卵泡液(Leibfried和First，Bio r印rod，23 :699-704(1980))可以用来维持卵母细胞的减数分裂停滞，但维持时间很短。因此，目前还缺少一种可以在较长时间内维持卵母细胞的减数分裂停滞的有效方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种体外保存/培养卵母细胞的方法及其应用。本发明的另一个目的是提供全血清的在卵母细胞体外保存/培养中的应用。本发明的又一个目的是提供含全血清的制剂及其应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。—方面，本发明提供一种体外保存/培养卵母细胞的方法，所述方法采用全血清作为卵母细胞体外保存/培养的保存液或培养液，以维持卵母细胞减数分裂停滞。优选地，所述维持卵母细胞减数分裂停滞的保存/培养温度为20-30°C，进一步优选为 27-28 0C ο优选地，所述方法中每10 100 μ 1全血清保存/培养1 10个卵母细胞；优选为每10 μ 1全血清保存/培养1个卵母细胞。 优选地，所述方法还包括在用全血清保存/培养卵母细胞之前，用TCM-199培养液
漂洗卵母细胞，并用全血清清洗卵母细胞的步骤。 优选地，所述全血清选自胎牛血清和新生牛血清。优选地，所述卵母细胞选自生发泡期的猪卵母细胞。另一方面，本发明提供了上述方法在卵母细胞的体外保存/培养、在卵母细胞体外成熟的控制和优化以及改进人和动物辅助生殖技术中的应用。优选地，所述应用中的卵母细胞选自猪卵母细胞，优选为生发泡期的猪卵母细胞。此外，本发明还提供了全血清在体外保存/培养卵母细胞中作为保存液或培养液，以维持卵母细胞减数分裂停滞的应用，其中所述的全血清选自胎牛血和新生牛血清。又一方面，本发明提供一种用于保存卵母细胞的制剂，所述制剂包含全血清。优选地，所述全血清选自胎牛血清和新生牛血清。本发明还提供所述制剂在保存卵母细胞中的应用。优选地，所述卵母细胞为生发泡期的猪卵母细胞。综上所述，本发明首次尝试了完全采用胎牛血清或新生牛血清作为保存液结合不同的温度来保存和培养猪卵母细胞，得到了非常令人满意的结果，能够有效抑制猪卵母细胞GVBD发生。与现有技术相比，本发明至少具有以下优点1、本发明的方法可以大大提高卵巢卵母细胞在科研和畜牧业生产上的利用率，为利用屠宰场卵巢解除了时间上的限制，便于体外操作时间的安排；2、本发明的方法可以将生发泡(GV)期卵母细胞在常温下保存和培养，有助于提高卵母细胞体外成熟质量，促进核成熟和胞质成熟同步，是一种最佳的不依赖于抑制剂的生理学控制核成熟进程的方法，对于动物胚胎工程以及人类辅助生殖技术研究和应用都有
重要意义；3、胎牛血清或新生牛血清作为猪卵母细胞的常温培养液，不用添加其他任何成分，高效、廉价、方便、来源容易以及对细胞没有毒性，可以取得很好的临床效果；4、本发明的方法也可以用于其它物种的卵母细胞体外保存或者体外成熟的控制和优化，对细胞没有任何毒性。胎牛血清或新生牛血清作为猪卵母细胞常温保存液，不添加其他任何成分，温度控制在20到30°C之间能够有效抑制部分卵母细胞在GV期，27. 5°C抑制效果最好，保存三天大部分的卵母细胞停滞在GV期，且成熟培养后排出第一极体，成熟率略低于新鲜卵母细胞。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述。应当理解给出的实施例仅为了对制备和使用本发明的特定方法和产品进行说明，而不是为了限制本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所使用的试剂均购自Sigma (St. Louis, MO)公司。实施例1 :GV期猪卵母细胞的获取和保存选择北京第五肉联厂刚刚屠宰的3-5个月龄的青年母猪，在宰杀后立即获取卵巢，并确定卵巢上不带有黄体。将卵巢盛于含有75 μ g/ml青霉素和50 μ g/ml链霉素的 25-30°C生理盐水中，在池内运到实验室。在JJ-CJ-IFD型洁净工作台(净化等级为100级，吴江市净化设备总厂生产)上， 采用固定有18号针头的20ml —次性注射器(上海米沙瓦伊科工业有限公司生产)从中等直径的卵泡内抽取卵泡液，并在沉降后吸去上清，将沉降的沉淀用TCM-199清洗两遍，沉淀中即包含卵丘卵母细胞复合体。在C-DS型显微镜(Nikon公司生产)下用口吸管选择卵丘细胞包裹紧密、卵母细胞胞质颗粒分布均勻的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，用 TCM-199漂洗3遍，然后在胎牛血清(FCS，购自Gibco公司，货号1600-044)中洗三遍。A.采用胎牛血清培养滴和TCM-199培养滴在不同温度下保存GV期的猪卵母细胞的对比实验以200 μ 1胎牛血清/滴的量制备FCS培养滴；配制TCM-199，以200 μ 1制备的 TCM-199/滴的量制备TCM-199对照培养滴，然后将两种培养滴放在SPX-50型20-30°C生化培养箱(宁波江南仪器厂生产)中提前预热2小时。将准备好的卵丘-卵母细胞复合体分别放入两种培养滴中，每个滴放入约20个 COCs。将含有卵丘-卵母细胞复合体的培养滴置于培养皿中，然后放置于Hera Cell 150 型细胞培养箱(Thermo公司生产)中，在不同温度下保存3天。保存3天后检测卵丘-卵母细胞复合体减数分裂受到抑制的情况。将卵丘-卵母细胞复合体置于载玻片上并在新配制的固定液(醋酸甲醇=1 3)中，室温下固定 48-72小时，固定后的细胞在(w/v)地衣红(溶于45%醋酸)中染色5分钟，然后在 400X相差显微镜下观察。根据细胞核膜是否完整，将卵母细胞分为生发泡期(GV)和生发泡破裂期(GVBD)。结果见表1。表1 不同温度下保存GV期猪卵母细胞3天
权利要求
1.一种体外保存/培养卵母细胞的方法，其中，所述方法采用全血清作为卵母细胞体外保存/培养的保存液或培养液，以维持卵母细胞减数分裂停滞。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述维持卵母细胞减数分裂停滞的保存/培养温度为 20-30°C，优选为 27-280C ο
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法中每10 100μ 1全血清保存/培养 1 10个卵母细胞；优选为每10 μ 1全血清保存/培养1个卵母细胞。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在用全血清保存/培养卵母细胞之前，用TCM-199培养液漂洗卵母细胞，并用全血清清洗卵母细胞的步骤。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述全血清选自牛血清，优选为胎牛血清和/或新生牛血清；优选地，所述卵母细胞选自生发泡期的猪卵母细胞。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法在卵母细胞的体外保存/培养、在卵母细胞体外成熟的控制和优化以及改进人和动物辅助生殖技术中的应用。
7.如权利要求6的应用，其中，所述卵母细胞为猪卵母细胞，优选为生发泡期的猪卵母细胞。
8.全血清在体外保存/培养卵母细胞中作为保存液或培养液，以维持卵母细胞减数分裂停滞的应用；优选地，所述全血清选自牛血清，优选为胎牛血清和/或新生牛血清。
9.一种用于保存/培养卵母细胞的制剂，所述制剂包含全血清；优选地，所述全血清选自牛血清，优选为胎牛血和/或新生牛血清。
10.如权利要求9所述制剂在保存卵母细胞中的应用；优选地，所述卵母细胞为猪卵母细胞，优选为生发泡期的猪卵母细胞。
全文摘要
本发明提供了一种体外保存/培养卵母细胞以维持卵母细胞减数分裂停滞的方法。本发明提供的方法采用全血清作为卵母细胞体外保存/培养的保存液或培养液，在20至30℃之间在体外保存/培养卵母细胞，使其维持卵母细胞减数分裂停滞。这种方法可以大大的提高卵巢卵母细胞在科研和畜牧业生产上的利用率，为科研上利用屠宰场卵巢解除了时间上的限制，便于体外操作时间的安排；生发泡期卵母细胞的常温保存/培养有助于提高卵母细胞体外成熟质量，促进核成熟和胞质成熟同步，是一种最佳的不依赖于抑制剂的生理学控制核成熟进程的方法，对于动物胚胎工程以及人类辅助生殖技术研究和应用都有重要意义。
文档编号A01N1/02GK102258005SQ20101019306
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者侯毅, 孙青原, 张清华, 杨彩荣, 欧阳迎春, 王震波, 苗德强, 郭磊 申请人:中国科学院动物研究所