专利名称：利用生物反应器培养铁皮石斛圆球茎的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种利用生物反应器培养铁皮石斛圆球茎 的方法。
背景技术：
铁皮石斛(Dendrobium candidum Kimura et Mi go)为兰科气生草本植物。它因 表皮呈铁绿色而得名，俗称铁皮枫斗，因其老茎节外呈褐色，又名黑节草，铁皮石斛为石斛 之极品。分布于安徽、浙江、江西、广东、广西、云南、贵州等省区。铁皮石斛对生长环境和气 候条件要求十分苛刻，它生长于海拔500 1000m，相对湿度在60% 75%，林间透光度在 60%左右，生长季节温度20 25°C，冬季气温9 12°C，在无霜多雾，年降雨量为1100 1500mm的常绿阔叶林中及石灰岩上。铁皮石斛常年饱云、雾、雨、露滋润，受天地之灵气，吸 日月之精华，一般生长在人迹罕至的深山老林和悬崖峭壁上的阴面崖缝间。铁皮石斛通过 风及虫媒传播繁殖，从种子萌发进入商品阶段需2 3年才能采收。由于铁皮石斛特殊的生 长环境和自身繁殖极其困难，以及人们的过度采挖，目前铁皮石斛的野生资源已日趋减少， 至1987年，被列为国家重点保护野生植物，在《中国植物红皮书》中被列为濒危种，现已成 为国家二级保护植物。挽救和保护铁皮石斛野生种质资源并实现其可持续利用具有极其重 要的意义。铁皮石斛具有独特的药用价值，秦汉时期的《神农本草经》记载铁皮石斛具有“主 伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃”的功效；成书于一千多年前的道家医 学经典《道藏》将铁皮石斛、天山雪莲、三两重人参、百二十年首乌、花甲之茯从、深山灵芝、 海底珍珠、冬虫夏草等列为“中华九大仙草”，铁皮石斛位“九大仙草”之首；铁皮石斛为千百 年来历代帝皇梦寐以求的宝物，素有“千金草”之称，驰名中外，被国际药用植物界称为“药 界大熊猫”，民间称其为“救命仙草”。铁皮石斛茎的鲜品或干品皆可作中药石斛单独使用， 也可用在复方配伍中。其质硬而脆，断面较平坦，味苦，具有养胃生津、滋阴除热、明目及强 腰膝的作用。石斛、人参、山药、茯芩等26种中药配伍而成的石斛夜光丸具有平肝，滋肾，明 目的功效。在列入药典的石斛中，只有铁皮石斛才具有主治五脏虚弱赢瘦、强阴益精、久服 厚肠胃、定志除惊、轻身延年、健阳、补肾益力、壮筋骨等功效。以铁皮石斛正气处方为配方 的，有脉络宁静脉注射液、石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛浸膏溶液、石斛轻胃散等产品，对 咽喉疾病、肠胃疾病、白内障、心血管疾病、糖尿病等均有显著疗效。现代医学还证明铁皮石 斛具有抗疲劳、增强机体免疫力、抗肿瘤、抗血小板聚集、降血糖等作用。由于铁皮石斛为附生植物，多生于温凉高湿阴坡或半阴坡的岩层峭壁或密林的树 杈上，生境十分狭窄，且多年来对其过度采挖，加之试管苗的移栽成活率低，造成了石斛药 源供需之间的紧张状态。目前，铁皮石斛的野生资源已濒临枯竭。圆球茎是铁皮石斛离体 培养产生的胚性组织，同样具有植株物质代谢和形态发育的潜能。利用植物细胞培养技术 获得组织培养物，并以组织培养物代替其原植株成为药源，是实现野生石斛资源可持续利 用的有效方式之一，这对拯救野生石斛资源有着极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用生物反应器培养铁皮石斛圆球茎的方法，以铁皮 石斛无菌播种所获得的圆球茎为材料，通过生物反应器诸理化参数的调控，探明在反应器 内圆球茎生长的优化条件，并对有效成分含量进行分析，为铁皮石斛的开发利用提供新的 方法。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案—种利用生物反应器培养铁皮石斛圆球茎的方法，在3L生物反应器中注入2L液 体培养基，接种20g圆球茎、光照强度为1600LUX、空气注入量为0. 20vvm时进行完全浸没培 养30d，增殖铁皮石斛圆球茎。所述的培养基是由1/2MS+BA 2mg L^+NAA 0. 5mg 椰汁 lOOmL 蔗糖 30g I71 构成，pH 5. 8。所述的生物反应器为气升式生物反应器。根据本发明，铁皮石斛圆球茎多糖产量以及生物碱产量均在同样条件下达到最 高，且均高于栽培苗和组培苗。利用气升式生物反应器对铁皮石斛圆球茎进行培养可以提 高增殖速度，在短期内获得大量的外植体。同时从成本角度考虑，生物反应器培养可减少 培养基成本(琼脂使用费)，另一方面又可以减少操作人员数，从而降低劳动强度和生产成 本。因此，利用生物反应器培养可为商业化生产提供一种新的途径，解决石斛药源供需之间 的紧张。
图1铁皮石斛圆球茎在3L生物反应器中的增殖生长情况。
图2培养密度对多糖含量及产量的影响。
图3培养密度对生物碱含量及产量的影响。
图4光照强度对多糖含量及产量的影响。
图5光照强度对生物碱含量及产量的影响。
图6通气量对多糖含量及产量的影响。
图7通气量对生物碱含量及产量的影响。
图8生物反应器中不同培养时期多糖含量及产量的变化。
图9生物反应器中不同培养时期生物碱含量及产量的变化。
图10铁皮石斛不同来源材料多糖及生物碱含量的比较。
图11气升式生物反应器结构示意图。
具体实施例方式利用气升式生物反应器培养铁皮石斛圆球茎方法的具体实施步骤如下一种利用生物反应器培养铁皮石斛圆球茎的方法，在3L气升式生物反应器中注 入2L液体培养基，所述的培养基是由l/2MS+BA2mg L^+NAAO. 5mg I/1—椰汁lOOmL 蔗糖30g L-1构成，pH 5. 8，接种20g圆球茎、光照强度为1600Lux、空气注入量为0. 20vvm 时进行完全浸没培养30d，增殖铁皮石斛圆球茎。
以上最佳方案由下列实验对比得出。(一 )材料与方法1.铁皮石斛圆球茎生物反应器培养及有效成分积累的研究①.培养密度的筛选在3L气升式生物反应器中，2L液体培养基(1/2MS+BA 2mg L^+NAA 0. 5mg 椰汁lOOmL L、蔗糖30g pH 5. 8)在温度121 °C，压力1. 2kg cm_2的条件下高 压灭菌30min，冷却后注入反应器中，每个反应器内分别接种10、20和30g圆球茎，注入 0. 20vvm(air volume/culture volume/min.)的空气，在温度 25士2°C，光照强度 1600Lux, 每天光照16h的条件下培养30d后调查圆球茎的鲜物重、干物重以及多糖和生物碱的含量。②.光照强度的筛选依据上述试验结果，每个反应器内接种20g圆球茎，光照强度分别设置为黑暗、 1600LUX、用环状日光灯调节光照强度2400LUX下进行，其它条件同上，培养30d后调查圆球 茎的鲜物重、干物重以及多糖和生物碱的含量。③.空气注入量的筛选依据上述试验结果，每个反应器内接种20g圆球茎，光照强度为1600LUX，通气量 设置为0. 10,0. 20,0. 30vvm,其它条件同上，培养30d后调查圆球茎的鲜物重、干物重以及 多糖和生物碱的含量。2.铁皮石斛圆球茎不同培养时期有效成分含量的分析反应器内接种20g圆球茎，光照强度为1600LUX，通气量设置为0. 20vvm，其它条件 同上。接种后10d，20d，30d，40d测定圆球茎多糖以及生物碱含量。3.铁皮石斛不同来源材料有效成分含量的比较比较铁皮石斛一年生栽培苗、固体培养基中培养6个月的组培苗以及反应器培养 30d圆球茎多糖和生物碱的含量。( 二 )结果与分析1.铁皮石斛圆球茎生物反应器培养及有效成分积累的研究①.接种量的筛选当反应器内接种密度为20g时鲜物重和干物重显著多于10g和30g处理，分别为 167. 5g 和 15. 0g。培养密度对铁皮石斛圆球茎多糖以及生物碱积累的影响见图2和图3，由图2可 看出，反应器中接种10g铁皮石斛圆球茎时，多糖含量较高，达到217.41mg g—1 ；接种量为 20g时多糖产量较高，为1. 59g化―1。由图3可看出，接种量为20g时生物碱含量较高，为到 3. 61mg g-1 ；生物碱产量也在接种量为20g时较高，为27. 08mg L-1。②.光照强度的筛选光照强度对生物反应器内铁皮石斛圆球茎增殖存在一定的影响，铁皮石斛圆球茎 在1600LUX条件下生长最旺盛，鲜物重达到179. 8g。光照强度对铁皮石斛圆球茎多糖及生物碱积累的影响见图4和图5，当光照强 度为2400LUX时，圆球茎多糖含量较高，为228. 92mg g—1 ；铁皮石斛圆球茎多糖产量在 1600Lux条件下达到最高值，为1. 72g L—1。在黑暗条件下，圆球茎生物碱含量较高，为 3. 92mg g—1，生物碱产量在1600Lux条件下达到最高值，为29. 57mg L—1。
③.通气量的筛选通气量对生物反应器内铁皮石斛圆球茎增殖有影响，当通气量为0. 20vvm时圆球 茎生长健壮，颜色鲜绿，鲜物重和干物重分别为180. lg和16. 5g，适宜铁皮石斛圆球茎的增
殖。 铁皮石斛圆球茎多糖含量和生物碱含量在给予不同通气量条件下存在一定的 差异，由图6和图7可看出，当通气量为0. 2vvm时，铁皮石斛圆球茎多糖含量较高，为 ZUJSmg'g—1，多糖产量也相应的在通气量为0.2vvm时达到最大值，其值为1. 75g化人与 多糖相似的是，生物碱含量和产量均在通气量为0. 2vvm时达到最大值，分别为3. 74mg g—1 和 30. 86mg I71。2.铁皮石斛圆球茎不同培养时期有效成分含量的分析铁皮石斛圆球茎中多糖含量和生物碱含量亦与其生长密切相关(图8和图9)，在 培养十天至20天内，多糖含量有所增加，20天至30天内，多糖含量增加较快，并在培养至 30d时达到最大值，为214. 18mg g—1，三十天后多糖含量有所下降；铁皮石斛圆球茎多糖产 量也相应的在30天时达到最大值，为1.768*1^。而生物碱含量则在十天至二十天内增长 速度较快，三十天时达到最大值，其值为3. 78mg g—1，三十天后稍有回落；生物碱产量在30 天时达到最大值，为30. 99mg L-1。3.铁皮石斛不同来源材料有效成分含量的比较铁皮石斛一年生栽培苗、固体培养基中培养6个月的组培苗以及反应器培养30d 圆球茎多糖和生物碱的含量的比较见图10，由图可看出，这三种材料中，铁皮石斛圆球茎多 糖含量和生物碱含量均为最高，分别为214. 18mg g-1和3. 78mg 均高于栽培苗和组培
田o生物反应器是为生物体生长和代谢提供优化的理化环境，使生物体能够更好地生 长，得到更多的生物量或代谢产物的设备，具有生产规模大、周年生产、不受季节及区域性 影响、自动化程度高、生产成本低等特点.生物反应器分为机械搅拌式、气动式、固定化及 其它类型，本发明实施例中所采用的反应器为气升式生物反应器，结构如图11所示，图中 a 插头b 气泵c 空气流量计d 过滤膜e 多孔喷嘴(孔径15 y m) f 出气口，箭头表示空 气流动方向。气升式生物反应器是气动式反应器中的一种，其流动性均勻，提供低剪切力 环境，结构简单，没有其他生物反应器(如搅拌式反应器)所具有的如泄漏点和死角多等缺 点。如图1，铁皮石斛圆球茎在3L气升式生物反应器中的增殖生长情况。气升式生物反应器的主要工作原理为气体由反应器底部的流量计和过滤膜进入 反应器，通过气体分布装置(喷嘴)雾状喷入反应器内培养基中，经过气液分离后在反应器 上部排除，从而带动液体和培养物在反应器的循环流动，达到搅拌目的。气升式反应器搅 拌速度和混合程度由(1)通气速率，如通入反应器的气体体积；(2)气体喷泄气的位置和构 型，如喷嘴和烧结口 ；(3)容器的高度与直径比；(4)培养液的黏度和流变性。
权利要求
一种利用生物反应器培养铁皮石斛圆球茎的方法，在3L生物反应器中注入2L液体培养基，接种20g圆球茎、光照强度为1600Lux、空气注入量为0.20vvm时进行完全浸没培养30d，增殖铁皮石斛圆球茎。
2.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器培养铁皮石斛圆球茎的方法，其特征在 于所述的培养基是由 1/2MS+BA 2mg L^+NAA 0. 5mg 椰汁 lOOmL 蔗糖 30g L—1 构成，pH 5. 8。
3.根据权利要求1所述的一种利用生物反应器培养铁皮石斛圆球茎的方法，其特征在 于所述的生物反应器为气升式生物反应器。
全文摘要
本发明公开了一种利用气升式生物反应器大量增殖铁皮石斛圆球茎的方法，在3L生物反应器中注入2L液体培养基，接种20g圆球茎、光照强度为1600Lux、空气注入量为0.20vvm时进行完全浸没培养30d后，鲜物种可达180.1g，适宜铁皮石斛圆球茎的增殖。本发明铁皮石斛圆球茎多糖产量以及生物碱产量均在同样条件下达到最高，且均高于栽培苗和组培苗。本发明可以提高增殖速度，在短期内获得大量的外植体。同时，生物反应器培养可减少培养基成本，又可以减少操作人员数，从而降低劳动强度和生产成本。因此，生物反应器培养可为商业化生产提供一种新的途径，解决石斛药源供需之间的紧张。
文档编号A01H4/00GK101849507SQ20101019366
公开日2010年10月6日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者孙丹, 尹成日, 廉美兰, 朴炫春 申请人:延边大学