专利名称：锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法
技术领域：
本发明涉及修复植物伴矿景天的茎段、茎尖或叶片离体培养高频率植株再生技 术，属于植物组织培养方法。
背景技术：
随着工业的发展和农业生产的现代化，土壤_植物_环境系统中重金属污染问题 日趋严重。重金属污染不仅降低农作物产量和品质，导致土壤功能和质量的退化，影响农业 生产的健康持续发展，而且通过径流和淋洗作用污染地表水和地下水，恶化水文环境，并可 能通过直接接触、食物链等途径危及人类的生命和健康。目前我国的农田土壤受重金属污 染的治理应该受到重视。采用的物理化学修复技术(包括隔离包埋技术，固化稳定技术，化学稳定技术和 电动修复技术等)治理重金属土壤污染，从根本上来说并没有达到清除污染的目的，只是 将重金属转移或固定在土壤中，减少重金属进入植物生态系统的量。而且，应用这些物理化 学方法的往往耗资巨大，而且所用到的化学药剂还可能造成土壤的二次污染。而植物修复 是利用重金属超积累或耐性植物治理土壤污染的一种新的环境生物技术，它是一种费用低 廉、无继发污染，节约土地资源、环境友好和可持续发展的绿色途径。植物修复的关键在于 寻找或培育出能够忍耐和超积累一种或多种重金属、生物量较大、适应性较广而且繁殖快 速的特异种质资源。修复植物伴矿景天(Sedum plumbizincicola X. H. Guo et S. B. Zhou sp. nov.)，是我国刚发现的一种重金属耐性和超富集植物，喜生于富含Pb、Zn矿地区，多年 生肉质草本。其生长习性与其它景天的生长习性基本相似，自然分布于浙江等地，在我国大 部分地区均可正常生长，适应性广，生物量大，生长速度快。适用于污染环境植物修复技术， 但是其重金属耐性和超富集的分子生物机理尚未研究，分子生物学技术的日趋成熟为研究 其重金属耐性和超富集的分子机理开辟新的途径，本方法用于其微繁殖和体细胞突变体筛 选及分子生物学研究。至今，组织培养技术在伴矿景天上尚未见报道，因此发明该修复植物 伴矿景天的组织培养方法，对研究伴矿景天重金属耐性和超富集的分子机理具有重要的意 义，同时对促进污染环境植物修复技术推广应用具有重要意义。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种修复植物伴矿景天组织培养的高频率植株再 生技术，为阐述伴矿景天重金属耐性和超富集的分子生物机理开辟新的途径。本发明的修 复植物伴矿景天组织培养技术，有茎尖组织培养、叶片愈伤组织诱导、茎段愈伤组织诱导等 三种方案。技术方案本发明技术方案为锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法， 采用茎尖组织诱导分化法，将伴矿景天消毒后取带有腋芽的0. 3 0. 5cm茎段或茎尖，接种 到诱导培养基上，每天保持光强为3000勒克司的光照16小时的培养箱中培养20 40天 后，取出长有簇生芽的茎尖，选取大芽，转接到壮苗培养基上，每天保持光强为3000勒克司的光照16小时的培养箱中培养3 8周，得到含有许多2 3cm长幼根的组培苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，浇灌蒸馏水放置2 3天后，用水洗去培养基，移栽至pH 6. O 8.0的全营养素有机质基质中，2 4周得到组培苗。上述诱导培养基是含有(0. 05 0. 15) mg/L 6-BA和(1. 5 2. 5)mg/L NAA的MS培养基。上述壮苗培养基是V2MS培养基，其中 含有浓度为(0. 1 0. 5)mg/L6-BA、(1. 5 2. 0)mg/L NAA、5ymol/L Cd (NO3)2 禾口(0. 1 1.5) mg/L IBA。锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法，采用茎段愈伤组织诱导法，将伴 矿景天茎消毒，切去叶和侧芽与顶芽，切成0. 3 0. 5cm的小段，接种到诱导培养基上，无光 照的培养箱中3 6周诱导愈伤组织，然后将愈伤组织转移至分化培养基中，每天保持光强 为3000勒克司的光照16小时的培养箱中培养40 50天，得到3 5cm高并带有Icm以 上幼根的组培苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，浇灌蒸馏水放置2 3天后，用水洗去 培养基，移栽至PH 6.0 8.0的全营养素有机质基质，2 4周得到组培苗。上述诱导培养 基是MS培养基，其中含有浓度为(0. 1 0.5) mg/L 6-BA和(1.5 2.0) mg/L 2，4_D。上述 分化培养基是MS培养基，其中含有浓度为(0. 1 0. 5) mg/L 6-BA和(0. 1 0. 5) mg/L 2， 4-D。锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法，采用叶片愈伤组织诱导法，将伴 矿景天叶片消毒，切去叶缘、叶脉和叶柄，切成0. 2 0. 3cm2的小片，接种到诱导培养基上， 无光照的培养箱中4 8周诱导愈伤组织，然后将愈伤组织转移至分化培养基中，每天保持 光强为3000勒克司的光照16小时的培养箱中培养50 70天，得到3 5cm高并带有Icm 以上幼根的组培苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，浇灌蒸馏水放置2 3天后，用水洗 去培养基，移栽至PH 6.0 8.0的全营养素有机质基质，2 4周得到组培苗。上述诱导培 养基是MS培养基，其中含有浓度为(2. 5 3. 5) mg/L NAA和(0. 5 1. 0)mg/L TDZ。上述 分化培养基是MS培养基，其中含有浓度为(0. 1 0. 5) mg/L 6-BA和(0. 1 0. 5) mg/L 2， 4-D。上述培养基均为已灭菌的培养基，在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整PH值至 5. 5 5. 8 ；在离体培养过程中培养温度为25士 1°C。有益效果本发明分别取修复植物伴矿景天的茎段、茎尖、叶片进行组织培养扩 繁，同时分别建立了茎段、茎尖、叶片高频再生体系。由于繁殖时直接选取伴矿景天的茎段、 茎尖、叶片，取材容易，拓宽了伴矿景天繁殖的取材范围，繁殖方法快速，高效，为生理生化、 分子生物学研究提供了条件。本发明目的是通过分别建立茎尖、茎段或叶片的高频植株再 生体系的方法，适宜用作体细胞突变体的筛选和微繁殖以及农杆菌介导法转基因转化材 料，为阐述其重金属耐性和超富集的分子生物机理提供基础条件。
具体实施例方式下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进行 说明，并不构成对权利要求范围的限制，本领域技术人员可以想到的其他替代手段，均在本 发明权利要求范围内。说明书中1/2MS培养基的含义是MS培养基中的所有成分减半。本发明所说的MS培养基组成见表1
表IMS培养基组成成分 实施例1
将取自锌镉矿上修复植物伴矿景天带腋芽的茎段或茎尖用自来水冲洗干净，用 70%vt乙醇浸泡50秒，再用0. 1% (g/mL)升汞浸泡10分钟，倒掉升汞后用无菌水清洗5次 后，得到无菌苗后在超净工作台上取带有腋芽的0. 3 0. 5cm茎段或茎尖，接种到已高压灭 菌并冷却后的200mL玻璃培养瓶装的50mL pH为5. 8诱导培养基，100瓶的诱导培养基(成 份为MS培养基，其中含有浓度为(0. 05 0. 15)mg/L 6-BA和(1. 5 2. 5)mg/L NM)每瓶接 种3个茎段或茎尖，将培养瓶放至温度为25 士 1°C，每天保持光强为3000勒克司(Lux)的光 照16小时的培养箱中培养25天后，取出长有簇生芽的茎尖，选取大芽，转接到已灭菌的玻璃 培养瓶装的50mL的壮苗培养基上，壮苗培养基是pH为5. 8的1/2MS培养基，其中含有浓度为 0. 1 0. 5)mg/L 6-BA、(1. 5 2. 0)mg/L ΝΜ、5 μ mol/L Cd (NO3)2 禾口(0· 1 1. 5)mg/L IBA, 再将培养瓶放入温度为25士 1°C，每天保持光强为3000勒克司(Lux)的光照16小时的培养 箱中培养5 8周，得到含有许多2 3cm长幼根的组培苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶 口，加入少许蒸馏水放置2 3天后，用水洗净根部培养基，分别移栽至全营养素的有机质基 质(安徽省无为县花卉肥料厂生产)，2 4周后得到粗壮的地上部约5cm组培苗。实施例2:将取自锌镉矿上修复植物伴矿景天茎段用自来水冲洗干净，用70% Vt乙醇浸泡 50秒，再用0. 1% (g/mL)升汞浸泡10分钟，倒掉升汞后用无菌水清洗5次后，得到无菌苗 后在超净工作台上将茎段切去叶片和侧芽后，切成0. 3 0. 5cm的小段，接种到已高压灭菌 并冷却后的200mL玻璃培养瓶装的50mL pH为5. 5 5. 8诱导培养基上，诱导培养基成份 为MS培养基，其中含有浓度为(0. 1 0.5)mg/L 6-BA和(1.5 2.0)mg/L 2，4_D，将培养 瓶放入温度为25士 1°C，无光照的培养箱中3 6周后得到愈伤组织，将愈伤组织转移至已 灭菌的玻璃培养瓶装的50mLpH为5. 8分化培养基中，其中50瓶分化培养基的成份是MS培 养基，其中含有浓度为(0. 1 0. 5)mg/L 6-BA和(0. 1 0. 5)mg/L 2，4_D，再将培养瓶放 入温度为25士 1°C，每天保持光强为3000勒克司(Lux)的光照16小时的培养箱中培养40 天，得到3cm高带有Icm以上幼根的组培苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，加入少许蒸 馏水放置2天后，用水洗去培养基后分别移栽至全营养素的有机质基质(安徽省无为县花 卉肥料厂生产)，4周后得到粗壮的地上部约5cm组培苗。实施例3:将取自锌镉矿上修复植物伴矿景天叶片用自来水冲洗干净，用70 % Vt乙醇浸泡 50秒，再用0.1% (g/mL)升汞浸泡10分钟，倒掉升汞后用无菌水清洗5次后，得到无菌苗 后在超净工作台上将叶片，切去叶缘后，切成0. 3 0. 5cm2的小片，接种到已高压灭菌并冷 却后的200mL玻璃培养瓶装的50mL pH为5. 5 5. 8诱导培养基上，诱导培养基成份为MS 培养基，其中含有浓度为(2. 5 3. 5)mg/L NAA和(0. 5 1. 0)mg/L TDZ，将培养瓶放入温 度为25士 1°C，无光照的培养箱中4 8周后得到愈伤组织，将愈伤组织转移至已灭菌的玻 璃培养瓶装的50mLpH为5. 8分化培养基中，其中50瓶分化培养基的成份是MS培养基，其 中含有浓度为(0. 1 0. 5)mg/L 6-BA和(0. 1 0. 5)mg/L 2，4-D，再将培养瓶放入温度为 25士 1°C，每天保持光强为3000勒克司(Lux)的光照16小时的培养箱中培养50 70天， 得到3cm高带有Icm以上幼根的组培苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，加入少许蒸馏 水放置2天后，用水洗去培养基后分别移栽至全营养素的有机质基质(安徽省无为县花卉 肥料厂生产)，4周后得到粗壮的地上部约5cm组培苗。
权利要求
锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法，其特征是采用茎尖组织诱导分化法将伴矿景天消毒后取带有腋芽的0.3～0.5cm茎段或茎尖，接种到诱导培养基上，每天保持光强为3000勒克司的光照16小时的培养箱中培养20～40天后，取出长有簇生芽的茎尖，选取大芽，转接到壮苗培养基上，每天保持光强为3000勒克司的光照16小时的培养箱中培养3～8周，得到含有许多2～3cm长幼根的组培苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，浇灌蒸馏水放置2～3天后，用水洗去培养基，移栽至pH 6.0～8.0的全营养素有机质基质中，2～4周得到组培苗。
2.根据权利要求1所述的锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法，其特征在于 所说的诱导培养基是含有(0. 05 0. 15)mg/L 6-BA和(1. 5 2. 5)mg/LNAA的MS培养基。
3.根据权利要求1所述的锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法，其特征在于 所说的壮苗培养基是1/2MS培养基，其中含有浓度为(0. 1 0. 5)mg/L6-BA、(1. 5 2. 0) mg/L NAA、5ymol/L Cd(NO3)2 禾口(0. 1 1. 5)mg/L IBA。
4.锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法，其特征是采用茎段愈伤组织诱导 法将伴矿景天茎消毒，切去叶和侧芽与顶芽，切成0. 3 0. 5cm的小段，接种到诱导培养基 上，无光照的培养箱中3 6周诱导愈伤组织，然后将愈伤组织转移至分化培养基中，每天 保持光强为3000勒克司的光照16小时的培养箱中培养40 50天，得到3 5cm高并带 有Icm以上幼根的组培苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，浇灌蒸馏水放置2 3天后， 用水洗去培养基，移栽至pH 6. 0 8. 0的全营养素有机质基质，2 4周得到组培苗。
5.根据权利要求4所述的锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法，其特征在于 所说的诱导培养基是MS培养基，其中含有浓度为(0. 1 0.5)mg/L 6-BA和(1. 5 2. 0) mg/L 2，4-D。
6.根据权利要求4所述的锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法，其特征在于 所说的分化培养基是MS培养基，其中含有浓度为(0. 1 0.5)mg/L 6-BA和(0. 1 0. 5) mg/L 2，4-D。
7.锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法，其特征是采用叶片愈伤组织诱导 法将伴矿景天叶片消毒，切去叶缘、叶脉和叶柄，切成0. 2 0. 3cm2的小片，接种到诱导培 养基上，无光照的培养箱中4 8周诱导愈伤组织，然后将愈伤组织转移至分化培养基中， 每天保持光强为3000勒克司的光照16小时的培养箱中培养50 70天，得到3 5cm高并 带有Icm以上幼根的组培苗，然后将培养瓶移到室外，打开瓶口，浇灌蒸馏水放置2 3天 后，用水洗去培养基，移栽至pH 6. 0 8. 0的全营养素有机质基质，2 4周得到组培苗。
8.根据权利要求7所述的锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法，其特征在于 所说的诱导培养基是MS培养基，其中含有浓度为(2.5 3. 5) mg/L NAA和(0.5 1.0)mg/ L TDZ。
9.根据权利要求7所述的锌镉超积累植物伴矿景天的组织培养育苗方法，其特征在于 所说的分化培养基是MS培养基，其中含有浓度为(0. 1 0.5)mg/L 6-BA和(0. 1 0. 5) mg/L 2，4-D。
10.上述任一权利要求中的培养基均为已灭菌的培养基，在高压灭菌前用氢氧化钠和 盐酸调整PH值至5. 5 5. 8 ；在离体培养过程中培养温度为25 士 1°C。
全文摘要
本发明的目的是提供一种修复植物伴矿景天组织培养的高频率植株再生技术，分别取修复植物伴矿景天的茎段、茎尖、叶片进行组织培养扩繁，同时分别建立了茎段、茎尖、叶片高频再生体系。由于繁殖时直接选取伴矿景天的茎段、茎尖、叶片，取材容易，拓宽了伴矿景天繁殖的取材范围，繁殖方法快速，高效，为生理生化、分子生物学研究提供了条件。本发明目的是通过分别建立茎尖、茎段或叶片的高频植株再生体系的方法，适宜用作体细胞突变体的筛选和微繁殖以及农杆菌介导法转基因转化材料，为阐述其重金属耐性和超富集的分子生物机理提供基础条件。
文档编号A01H4/00GK101869077SQ201010228740
公开日2010年10月27日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者吴龙华, 王松凤, 谭维娜, 贲爱玲, 骆永明 申请人:中国科学院南京土壤研究所