专利名称：优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体的制作方法
技术领域：
本发明属于海藻资源高值化开发利用技术领域，具体是涉及一种利用在优化的调控培养条件情况下，培养出具有高含量藻红蛋白的紫菜丝状藻体的技术方法。
背景技术：
海洋藻类资源及天然活性产物的高值化开发和利用是当今海洋生物科学研究的重要主题。在海洋生态系统中，光合色素对于所有光合作用的自营养型生物是至关重要的。 各种海洋植物、藻类能通过自身存在的光合系统，有效地利用环境中的CO2,即海藻的光合色素能把(X)2转化为有机物并释放氧气，它们是海洋中其它生物赖以生存、持续发展的基础。海洋红藻和蓝藻，除了含有植物常见的叶绿素a外，还含有一类特殊的辅助性采光色素，称为藻胆蛋白(Wiycobiliprotein)，主要包括藻红蛋白(Wiycoerythrin，PE)，藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)和别藻蓝蛋白(Allo-phycocyanin，APC)。红藻和蓝藻所特有的藻胆蛋白，最早是由henbeck于1836年首次发现的。长期以来，国内外的许多科研人员已对各种海洋藻类藻胆蛋白的分子结构特点、光谱吸收特征、光合生理以及它们在光合过程中的作用等方面进行过大量的理论性研究，而且在探索藻胆蛋白的应用性研究方面也做了许多的探索。相关的研究表明，藻胆蛋白在临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域具有广泛的应用价值。它们可作为单克隆物与特异的抗体发生耦合作用，当这种结合态抗体附到细胞或组织的特异受体位点时，很容易通过它们发出的特异性荧光而进行跟踪观察，可作为效果良好的生物性示踪物，而且这种结合态物对生物体本身无任何毒性副作用和损害，这是放射性物以及其他一些化学染料示踪法所根本无法相比的，其它潜在的应用还包括DNA探针的荧光标志，分子物和细胞的荧光免疫测试。藻胆蛋白也可和其它生物性大分子物或非生物性大分子物耦合，例如酶，其它蛋白质物，多肽， 激子，核酸，药物，维生子等，因此在分子或细胞水平上，对研究分子的转移、代谢，疾病的诊断和治疗方面，具有重要的开发、应用价值。最近的研究表明，藻胆蛋白可作为有效的光敏剂，用于治疗肿瘤、癌症等。已有许多报道指出，藻胆蛋白能有效清除体内的各种有害自由基，提高机体免疫力，具有抗辐射、 抗衰老、抗肿瘤作用，其产品市场大，是目前极有发展潜力的健康保健品。另外，藻胆蛋白也可作为添加剂，广泛应用于各类食品和化妆品行业。根据全球生物化学产品最大的供应商 Sigma公司的标价，高纯度的藻胆蛋白目前的市场售价已达75-500美元/毫克不等，而某些生物分子与藻胆蛋白结合物的现成品的售价更高。据统计，这类产品目前在国际市场上大约有超过100亿美元的市场机会。因此，随着藻胆蛋白的价值逐步为人们所认识，藻胆蛋白的开发利用已成为研发的热点，但昂贵的价格成为制约其开发利用的瓶颈。如何高效获取藻红蛋白主要取决于如下几个方面用于分离提取藻红蛋白所需的藻源材料是否容易得到，藻源材料的藻红蛋白含量高低，分离提取方法步骤的难易程度，藻源材料中存在的干扰分离纯化成分量的多少等方面。目前，能利用于分离提取藻红蛋白的藻源材料虽然有许多种，例如紫菜叶状体，红毛藻，石花菜，麒麟菜，江篱，叉枝藻，角叉藻，多管藻等，但这些藻普遍存在藻红蛋白含量较低、干扰物多等问题，而且几种藻胆蛋白的混杂存在，加大了获取单一型藻红蛋白的困难，造成藻红蛋白分离纯化的程序和步骤繁琐复杂，且萃取、回收率低，成本高。有些用于分离提取藻红蛋白的藻源材料很不容易获取，例如珊瑚藻。紫菜叶状体作为分离提取藻红蛋白的材料，虽然来源方便，但紫菜经加工后本身就已经是一种好商品，若用来分离提取藻红蛋白，就要耗费大量紫菜(因紫菜叶状体藻红蛋白含量低)，分离提取藻红蛋白后，紫菜就失去利用价值，而且大量的废渣容易造成环境问题，另外，紫菜叶状体存在的大量胞外产物(例如粘多糖等)，也很不利于藻红蛋白的分离提取。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是针对上面所述的背景技术，采用适宜的处理程序和条件，使成熟的坛紫菜叶状体释放果孢子，果孢子萌发后生长成丝状藻体；通过正交实验设计方案[采用正交表L27 (313)]，考察三因子(温度、光照、盐度)及各个因子三水平(低、 中、高)的调控培养条件下，丝状藻体藻红蛋白含量的数值变化，从而确定优化的调控培养条件。通过优化的调控培养条件的培养，获得高含量藻红蛋白的丝状藻体。本发明采用的方法具有简便易行，效果好的优点，使用获得的高藻红蛋白含量的丝状藻体作为藻源材料， 可用于进一步分离提取藻红蛋白，达到藻类材料高值化利用的目的，具有广泛的应用价值。 目前，尚无采用优化调控培养条件，获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体的相关报道。本发明采用的研究材料和方法紫菜果孢子释放与萌发的操作过程为于紫菜收成季节从现场海区采收成熟的紫菜叶状体。用镊子夹纱布，蘸灭菌海水小心清洗叶状体表面，然后用灭菌海水淋洗3-5遍， 置于10-18°C环境阴干4-10小时。用灭菌剪刀剪下叶状体的成熟部位，放于装有灭菌海水的500-2000毫升的烧杯中。IO-M小时后，取出叶状体。在已有果孢子释放的烧杯中加入灭菌过的f/2营养液，盐度范围在10-30ppt，置于10-20°C，光照强度lOO-lOOOlux，光照周期(L:D = 16:8)的培养箱培养，直至培养长出具有簇棕红色的丝状体藻丝。果孢子萌发长成的初期丝状体藻丝按正交实验方案设置的条件下调控培养， PH保持适宜的数值，采用适宜的经改良后的f/2营养液，配方成分为NaN03，NaH2PO4H2O, FeCl36H20, FeSO4, Na2EDTA. 2H20, NaHCO3, NaMoO4. 2H20, ZnSO4. 7H20, CuSO4. 5H20, MnCl2. 4H20, CoCl2. 6H2O, VitaminB1, VitaminB2, VitaminB6, VitaminB12, VitaminC, VitaminD, Biotin。 丝状藻体为全时光照的静态培养。培养15-30天后，取出丝状体藻丝，用滤纸吸去水分， 丝状体藻丝放入研钵研磨成藻浆状，加入0. 05M的磷酸盐冲液置于暗处4°C萃取10-20小时，样品液用离心机10000-12000rpm离心20-30分钟，取上层藻红蛋白萃取液，用分光光度计测定其在565、620、730nm波长的吸光值，同时测定滤纸吸去水分的丝状体藻丝的重量以及置于80°C干燥12小时后的藻体干重，确定出湿藻体和干藻体重量比值，最后按 Sampath-Wiley and Neefus方法Q007)计算丝状体藻丝的藻红蛋白含量，表达为毫克藻红蛋白/克干重藻体(mg/g. dw)。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为采用了三因子、三水平并具有可做交互作用分析的正交实验设计(正交表 L27 (313))，设置调控培养实验，同时运用方差分析方法，重点考察关键性因子温度、光照强度和盐度对丝状藻体藻红蛋白含量的影响，分析这些关键性因子的主次顺序、交互作用的影响及确定优化的调控培养条件。以下是实验设计、实验结果及分析。 表一、丝状藻体藻红蛋白含量实验因子水平表
权利要求
1.一种优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体，其特征在于通过采收成熟的紫菜叶状体，得到释放的果孢子，果孢子萌发后生长成丝状体。采用正交实验设计方案，考察多因子水平的调控培养条件下，丝状藻体藻红蛋白含量的数值变化，从而确定可达到获得高含量藻红蛋白的丝状藻体的优化调控培养条件。
2.按照权利要求1所述的一种优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体，其特征是所述的紫菜种类为坛紫菜，但也可适用于其它形式的紫菜种类。
3.按照权利要求1所述的一种优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体，其特征是所述的紫菜果孢子释放与萌发的操作过程为于紫菜收成季节从现场海区采收成熟的紫菜叶状体。用镊子夹纱布，蘸灭菌海水小心清洗叶状体表面，然后用灭菌海水淋洗3-5遍，置于10-18°C环境阴干4-10小时。用灭菌剪刀剪下叶状体的成熟部位，放于装有灭菌海水的500-2000毫升的烧杯中。IO-M小时后，取出叶状体。在已有果孢子释放的烧杯中加入灭菌过的f/2营养液，盐度范围在10-30ppt，置于10-20°C，光照强度 lOO-lOOOlux，光照周期(L:D= 16:8)的培养箱培养，直至培养长出具有簇棕红色的丝状体藻丝。
4.按照权利要求1所述的一种优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体，其特征是所述的可达到获得高含量藻红蛋白的丝状藻体的优化调控培养条件的确定，是通过通过相应的正交实验设计方案获得的。
5.按照权利要求1或4所述的一种优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体，其特征是所述的高含量藻红蛋白的丝状藻体的优化调控培养条件的温度范围值为 8-30 "C。
6.按照权利要求1或4所述的一种优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体，其特征是所述的高藻红蛋白含量的丝状藻体的优化调控培养条件的光照强度范围值为 lOO-lOOOlux。
7.按照权利要求1或4所述的一种优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体，其特征是所述的高藻红蛋白含量的丝状藻体的优化调控培养条件的盐度范围值为 10-30ppt。
8.按照权利要求1或4所述的一种优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体，其特征是所述的高藻红蛋白含量的丝状藻体的优化调控培养条件的PH范围值为 7. 0-8. 5。
9.按照权利要求1或4所述的一种优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体，其特征是所述的高藻红蛋白含量的丝状藻体的优化调控培养条件是采用静态培养。
10.按照权利要求1或4所述的一种优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体，其特征是所述的高藻红蛋白含量的丝状藻体的优化调控培养条件是采用适宜的经改良后的f/2营养液，配方成分为NaNO3, NaH2PO4H2O, FeCl3. 6H20, FeSO4, Na2EDTA. 2H20, NaHCO3, NaMoO4. 2H20, ZnSO4. 7H20, CuSO4. 5H20, MnCl2. 4H20, CoCl2. 6H20, VitaminB1, VitaminB2, VitaminB6, VitaminB12, VitaminC, VitaminD, Bioitn。
全文摘要
本发明涉及一种采用优化调控培养条件，获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体。属于海藻资源高值化开发利用技术领域.具体操作过程为采用适宜的处理程序和条件，使成熟的坛紫菜叶状体释放果孢子，果孢子萌发后生长成丝状藻体；通过正交实验设计方案[采用正交表L27(313)]，考察三因子(温度、光照、盐度)及各个因子三水平(低、中、高)的调控培养条件下，丝状藻体藻红蛋白含量的数值变化，从而确定优化的调控培养条件。在优化的调控培养条件下，丝状藻体藻红蛋白含量值高，最高可达64.73毫克/克干重藻体(平均值±标准偏差SD为58.24±5.07)。本发明采用的方法具有简便易行，效果好的优点，使用获得的高藻红蛋白含量的丝状藻体作为藻源材料，可用于进一步分离提取藻红蛋白，达到藻类材料高值化利用的目的，具有广泛的应用价值。
文档编号A01G33/02GK102334443SQ201010229370
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者林汝榕, 柯秀蓉, 邢炳鹏 申请人:国家海洋局第三海洋研究所