一种四倍体不结球白菜的有性多倍化育种方法

专利名称：一种四倍体不结球白菜的有性多倍化育种方法
技术领域：
本发明属农作物育种领域，涉及一种四倍体不结球白菜的有性多倍化育种方法， 专用于四倍体不结球白菜的选育。
背景技术：
自然界物种进化过程中有两条多倍化途径。一是有性多倍化，二是无性多倍化，前 者是自然界植物多倍体形成的主要途径，即通过2n配子的形成，然后参与有性交配。2n配 子的有性多倍化比无性多倍化具有更多的生物学优点，更高的发生频率，更高的杂合度。从 来自近缘二倍体的基因渗入，创造遗传多样性及得到基因杂合的多倍群体。用2n配子进行 多倍体育种，能使不同的基因型在提高了的倍性水平上相结合，为从低倍性亲本向高倍性 子代传递杂合性和有利基因组合提供了可能性，增大了杂种优势潜力，且新类型可由多倍 体遗传保存；此外，在结实性提高方面效果明显。人为操作的有性多倍化已成为植物种质创 新的重要手段。不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis Makino)俗称小白菜、白菜、 青菜，我国北方称“油菜”，原产中国。是我国南方最大众化的蔬菜，在蔬菜周年供应中占有 举足轻重的地位。其天然种及各栽培种都是二倍体，即2n = 2x = 20。现有技术中有本 发明人在国内外首次人工诱变四倍体不结球白菜“南农矮脚黄”新品种(南京农业大学学 报，1990，13(2) :P.33 40)；利用二个四倍体自交不亲和系杂交育成四倍体杂交种“暑优 1号”(发明专利ZL01137325.3)；创制四倍体不结球白菜雄性不育系及保持系(发明专利 ZL03113283. 9)；利用四倍体不结球白菜雄性不育系和四倍体父本系生产&代杂交种(即 杂种优势最优化的杂交制种手段)可使h代杂种率达到100%。但四倍体不结球白菜资源 有限，制约了四倍体杂种优势的利用。2n配子是自然界的普遍现象，有性多倍化是自然界多倍体形成的主要途径。在马 铃薯中研究最为深入，马铃薯2n配子自然发生频率为1. 3% (屈冬玉.1988. 2n配子在马 铃薯育种中的应用.马铃薯杂志，2(2) :102-105.)，在十字花科植物中黑芥2n配子自然发 生频率为0.05% 2. 17% (孟金陵.1997.植物生殖遗传学.北京科学出版社，83-84.)， 大白菜2n配子自然发生频率为9. 17% 20. 06% (张成合，申书兴，尚爱芹，王子欣，任 清.2007.大白菜2n配子发生的遗传分析.园艺学报，27 (4) :295_296.)。关于利用秋水 仙素诱导2n配子获得多倍体的研究已有报道(赵雁，刘武林，郑思乡，肖亚琼.2006.秋水 仙素诱导郁金香有性多倍化研究.北方园艺，(6) 135-136.王世敏，郑思乡，赵雁.2008. 月季配子诱变及杂交后代种子萌发研究初报.云南农业大学学报，23 (3) =426-430.杨晓 伶，程舟，李珊，北岛宣，长谷川耕二郎.2006.秋水仙碱诱导文旦柚2n配子获得自交三倍 体.园艺学报，33 (5) =1045-1047.)。目前国内外现有技术中还没有利用秋水仙素诱导二倍 体不结球白菜产生2n雄配子，再与四倍体不结球白菜胞质雄性不育系杂交，获得新四倍体 的有性多倍化育种技术。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种四倍体不结球白菜的有性多 倍化育种方法。本发明的另一目的是提供该方法选育新型四倍体不结球白菜品种。本发明的目的通过如下技术方案实现一种四倍体不结球白菜的育种方法在二倍体不结球白菜抽薹期使用秋水仙素溶 液处理花蕾诱导产生2n雄配子；以四倍体雄性不育系为母本，以所述的秋水仙素诱导得到 的含2n雄配子的二倍体为父本在花期进行人工有性多倍化杂交育种，获得Fi代四倍体白 菜即为所述的四倍体不结球白菜。所述的育种方法优选包含如下步骤l)2n雄配子的诱导诱变二倍体不结球白菜产生2n花粉的秋水仙素溶液浓度为 0. 05 % (g/ml，下文同)、0. 10 %和0. 20 %，在二倍体不结球白菜抽薹期处理花蕾，每天两 次，花蕾大小2. 5 3. 5mm,采用微量注射法，每个花蕾注射5 10 y L，每隔6h处理一次， 每个浓度处理2次，以未处理植株为对照，然后套袋隔离，2n花粉特征为广椭圆形，平均长 度为165. 27微米，平均宽度为103. 72微米，染色体数为2x = 20 (而未处理的二倍体植株 产生的n花粉为椭圆形，长149. 70微米，宽76. 58微米，染色体数为x = 10)；2)人工有性多倍化杂交以四倍体雄性不育系为母本，以秋水仙素诱导含2n配子 的二倍体材料为父本，及未处理的为父本对照在花期分别进行人工蕾期授粉杂交，共配30 株，第3天重复授粉1次。夏初收获&四倍体种子。其中，所述的秋水仙素溶液处理花蕾的时间为春天二倍体不结球白菜抽薹期早晨 8:00-9:00和下午2:00-3:00，处理温度分别为20°C _25°C，和不低于18°C。所述的经秋水仙素诱变2n花粉及有性多倍化杂交获得的四倍体不结球白菜&为 四月白春化型，株型直立束腰，株高28 31厘米，开展度28 34厘米，叶片近圆形，黄绿 色、叶柄白色、扁平，单株重0. 5 0. 6千克，与二倍体对照父本相比表现出巨大性，植 株生长势强，叶片近圆形，叶片皱缩，叶脉清晰，菜头粗、单株质量、株高、开展度、叶片数、 叶片宽、十片叶总质量、叶片长、叶柄质量、叶柄长、叶柄宽、十片叶总厚度和叶柄厚比二倍 体分别增加 33. 81 %U16. 95%,55. 68%,41. 54%,46. 15%、13. 43%,32. 18%、19. 81
15. 91%,87. 24%,27. 55%U29. 79%和97. 72%，花瓣颜色加深，形状变圆，长和宽分别增 加82. 61 %和103. 28%，气孔长和宽分别增加93. 95%和71. 07%，角果长、横宽、和喙长分 别增加45. 33%,63. 33%、和132. 14%，但气孔密度减少49. 58%,以上形状差异达极显著 水平；经细胞学鉴定，该有性多倍化四倍体其体细胞染色体数为2n = 4x = 40，而二倍体父 本体细胞染色体数为2n = 2x = 20。所述的四倍体雄性不育系优选按照中国专利ZL03113283. 9制备的四倍体雄性不育系。所述的二倍体不结球白菜优选二倍体不结球白菜“亮白叶”(中国农业科学院蔬菜 花卉研究所主编，中国蔬菜品种志(上卷)，北京2001中国农业出版社，353页)。一种利用本发明所述的育种方法获得的四倍体不结球白菜品种，由该品种的四倍 体不结球白菜为四月白春化型，株型直立束腰，株高28 31厘米，开展度28 34厘米， 叶片近圆形，黄绿色、叶柄白色、扁平，单株重0. 5 0. 6千克，与二倍体对照父本相比表现出巨大性，本发明四倍体不结球白菜植株生长势强，叶片近圆形，叶片皱缩，叶脉清晰，菜 头粗、单株质量、株高、开展度、叶片数、叶片宽、十片叶总质量、叶片长、叶柄质量、叶柄长、 叶柄宽、十片叶总厚度和叶柄厚比二倍体分别增加33. 81%U16. 95%,55. 68%,41. 54%, 46. 15 %U3. 43 %,32. 18 %U9. 81 %U5. 91 %,87. 24 %,27. 55 % ,129. 79 % 和 97. 12%, 花瓣颜色加深，形状变圆，长和宽分别增加82. 61 %和103. 28 %，气孔长和宽分别增加 93. 95%和71. 07%，角果长、横宽、和喙长分别增加45. 33%,63. 33%、和132. 14%，但气孔 密度减少49. 58%，以上形状差异达极显著水平；经细胞学鉴定，该四倍体其不结球白菜体 细胞染色体数为2n = 4x = 40。本发明的有益效果本发明首次采用四倍体不结球白菜雄性不育系作母本，既四倍体不结球白菜雄性 不育系(本身产生2n配子)X 二倍体不结球白菜(诱变产生2n配子)的有性多倍化育种 途径，获得四倍体不结球白菜新种质。与无性多倍化的同源四倍体相比具有更广泛的遗传 多样性，更高的结实率(结实率低是人工多倍体难以应用的最大障碍)。在国内外多倍体研究中，有性多倍化杂交母本无论是二倍体还是四倍体都必须人 工去雄，费工费时，其杂种后代难免有原来母本的自交种子，影响试验结果。采用雄性不育 系作母本(本身没有花粉，不能自交)，不用人工去雄，有性杂交后，在雄性不育系上收获的 种子一定是杂交种。排除了母本自交种或假杂种的干扰。本发明采用不同浓度秋水仙素诱导二倍体不结球白菜产生2n配子作父本，再与 四倍体不结球白菜雄性不育系作母本杂交。获得新四倍体的机率大。本发明新四倍体具有多倍体的巨大性、抗病性、耐寒性，品质好，还具有二倍体父 本的性状，如晚抽薹(长江流域2 3月份，大多数小白菜都已抽薹开花，该四倍体在4月 初抽薹开花，以补晚春缺菜)，及束腰等商品性好的特点(一般情况下四倍体外形不如二倍 体)。


图1. n花粉粒，染色体数x = 10 (未经处理的二倍体不结球白菜对照)；图2. 2n花粉粒2x = 20与n花粉粒(经秋水仙素诱导的二倍体不结球白菜内的 两种花粉粒)；图3.四倍体FJ四倍体雄性不育系与二倍体杂交)根尖有丝分裂中期染色体数 (2n = 4x = 40)；图4. 二倍体对照的气孔(X100)；图5.四倍体的气孔(X100)；图6.花器官比较(左为二倍体对照，右为四倍体印；图7.角果比较(左为二倍体对照，右为四倍体；图8.叶片比较(左为四倍体雄性不育系母本，中为四倍体&，右为诱导的二倍体 父本)；图9.植株比较(左为四倍体雄性不育系母本，中为四倍体&，右为诱导的二倍体 父本)；图10.有性多倍化杂交父、母本及&形态解剖学比较；
图11.有性多倍化杂交父、母本及&农艺性状比较。
五具体实施例方式实施例11材料与方法1. 1 材料试验于2006年10月-2008年11月在南京农业大学园艺实验站进行。二倍体不 结球白菜“亮白叶”(中国农业科学院蔬菜花卉研究所主编，中国蔬菜品种志(上卷)，北京 2001中国农业出版社，353页)，四倍体不结球白菜雄性不育系08P76为人工无性多倍化获 得，获得方法参见中国专利ZL03113283. 9，以四倍体“南农矮脚黄”(中国农业科学院蔬菜 花卉研究所主编，中国蔬菜品种志(上卷)，北京2001中国农业出版社，353页)为对照， 以上材料均由南京农业大学园艺学院白菜课题组提供。1.2 2n雄配子的诱导与鉴定在春天不结球白菜抽薹期晴天上午8:00-9:00和下午2:00-3:00 (白天 20°C _25°C，夜间不低于18°C )处理二倍体不结球白菜花蕾，花蕾大小2. 5 3. 5mm(小孢 子母细胞减数分裂前期I)，秋水仙素处理浓度为0. 05%,0. 10%和0. 20%，采用微量注射 法，每个花蕾注射5 10 y L，每隔6h处理一次，每个浓度处理3次，每个处理1株，每株处 理主枝和第1侧枝(80 90个花蕾)，以未处理植株为对照，套袋隔离。待花蕾开花当天每 个处理及对照取两朵花的花粉分别混合均勻，制成5个涂片，每个涂片随机观察10个视野， 每个视野分别测量3个n和2n花粉粒并统计花粉变异情况。总变异率=(总花粉数_n花 粉数)/总花粉数；2n配子频率=2n花粉数/总花粉数。1. 3人工有性多倍化杂交及杂交后代的鉴定以四倍体雄性不育系为母本，以秋水仙素诱导含2n雄配子的二倍体材料为父本， 及未处理的为父本对照在花期分别进行人工蕾期杂交，共配30株，第3天重复授粉1次。5 月中旬收获种子，9月15日播种父、母本及&进行鉴定。形态学、解剖学鉴定参照张振超的 方法(张振超，张蜀宁，张伟，张红亮，四倍体不结球白菜的诱导及染色体倍性鉴定，西北植 物学报，2007，27 (1) =0028-0032)，调查形态学指标有叶形、叶色、叶厚、植株形状、花器官、 角果等，解剖学指标有气孔、花粉粒，所获数据采用SPSS软件进行统计。染色体直接鉴定参 照张红梅的方法(张红梅，张蜀宁，孔艳娥，张丽丽，利用青花菜幼嫩雌蕊进行染色体核型 分析，园艺学报，2009，36 (5) =727-730) 2结果与分析2. 1秋水仙素诱导2n配子效果按照不同浓度及处理次数进行统计(表1)表明，0. 05% 0. 20%秋水仙素均可使 花粉总变异频率(12. 06% 24. 92%)和2n配子频率(9. 52% 20. 20%)提高，但花成活 率下降(98. 6% 70. 0% )。以浓度0. 20%处理1次的诱导效果最好，花成活率为86. 0%， 总变异频率为24. 92%, 2n配子频率达20. 20%，为对照的22倍。表1秋水仙素诱导不结球白菜2n配子效果
权利要求
一种四倍体不结球白菜的育种方法，其特征在于在二倍体不结球白菜抽薹期使用秋水仙素溶液处理花蕾诱导产生2n雄配子；以四倍体雄性不育系为母本，以所述的秋水仙素诱导得到的含2n雄配子的二倍体为父本在花期进行人工有性多倍化杂交育种，获得F1代四倍体白菜即为所述的四倍体不结球白菜。
2.根据权利要求1所述的四倍体不结球白菜的育种方法，其特征在于所述的方法具体 包含如下步骤1)2n雄配子的诱导诱变二倍体不结球白菜产生2n花粉的秋水仙素溶液浓度为 0. 05 % (g/ml，下文同)、0. 10 %和0. 20 %，在二倍体不结球白菜抽薹期处理花蕾，每天两 次，花蕾大小2. 5 3. 5mm,采用微量注射法，每个花蕾注射5 10 y L，每隔6h处理一次， 每个浓度处理2次，以未处理植株为对照，然后套袋隔离，2n花粉特征为广椭圆形，平均长 度为165. 27微米，平均宽度为103. 72微米，染色体数为2x = 20 ；2)人工有性多倍化杂交以四倍体雄性不育系为母本，以秋水仙素诱导含2n配子的二 倍体为父本，及未处理的为父本对照在花期分别进行人工蕾期杂交，共配30株，第3天重复 授粉1次，夏初收获&四倍体种子。
3.根据权利要求2所述的四倍体不结球白菜的育种方法，其特征在于所述的秋水仙素 溶液处理花蕾的时间为春天二倍体不结球白菜抽薹期早晨8:00-9:00和下午2:00-3:00， 处理温度分别为20°C -25°C，和不低于18°C。
4.根据权利要求1或2所述的四倍体不结球白菜的育种方法，其特征在于所述的经 秋水仙素诱变2n花粉及有性多倍化杂交获得的四倍体不结球白菜&为四月白春化型，株 型直立束腰，株高28 31厘米，开展度28 34厘米，叶片近圆形，黄绿色、叶柄白色、扁 平，单株重0. 5 0. 6千克，与二倍体对照父本相比表现出巨大性，F1植株生长势强，叶片 近圆形，叶片皱缩，叶脉清晰，菜头粗、单株质量、株高、开展度、叶片数、叶片宽、十片叶总质 量、叶片长、叶柄质量、叶柄长、叶柄宽、十片叶总厚度和叶柄厚比二倍体分别增加33. 81%, 116. 95 %,55. 68 %Al. 54 % A6. 15 %A3. 43 %,32. 18 %U9. 81 %U5. 91 %,87. 2427. 55 %,129. 79 %和97. 72 %，花瓣颜色加深，形状变圆，长和宽分别增加82.61 % 和103. 28%，气孔长和宽分别增加93. 95%和71. 07 %，角果长、横宽、和喙长分别增加 45. 33%,63. 33%、和132. 14%，但气孔密度减少49. 58%,以上形状差异达极显著水平；经 细胞学鉴定，该有性多倍化四倍体其体细胞染色体数为2n = 4x = 40，而二倍体父本体细胞 染色体数为2n = 2x = 20。
5.根据权利要求1或2所述的四倍体不结球白菜的育种方法，其特征在于所述的四倍 体雄性不育系选择按照中国专利ZL03113283. 9制备的四倍体雄性不育系。
6.根据权利要求1或2所述的四倍体不结球白菜的育种方法，其特征在于所述的二倍 体不结球白菜选择二倍体不结球白菜“亮白叶”。
7.一种利用权利要求1所述的育种方法获得的四倍体不结球白菜品种，其特征在于 由该品种的四倍体不结球白菜为四月白春化型，株型直立束腰，株高28 31厘米，开展 度28 34厘米，叶片近圆形，黄绿色、叶柄白色、扁平，单株重0. 5 0. 6千克，与二倍体 对照父本相比表现出巨大性，本发明四倍体不结球白菜植株生长势强，叶片近圆形，叶片 皱缩，叶脉清晰，菜头粗、单株质量、株高、开展度、叶片数、叶片宽、十片叶总质量、叶片长、 叶柄质量、叶柄长、叶柄宽、十片叶总厚度和叶柄厚比二倍体分别增加33. 81%U16. 95%, ·55. 68 %Al. 54 % A6. 15 %A3. 43 %,32. 18 %U9. 81 %U5. 91 %,87. 24 %,27. 55 129. 79%和97. 72%，花瓣颜色加深，形状变圆，长和宽分别增加82. 61%和103. 28%，气孔 长和宽分别增加93. 95%和71. 07%，角果长、横宽、和喙长分别增加45. 33%,63. 33%、和 132. 14%，但气孔密度减少49. 58%，以上形状差异达极显著水平；经细胞学鉴定，该四倍 体不结球白菜体细胞染色体数为2n = 4x = 40。
全文摘要
本发明属农作物育种领域，公开了一种四倍体不结球白菜的有性多倍化育种方法。该育种方法是在二倍体不结球白菜抽薹期使用秋水仙素溶液处理花蕾诱导产生2n雄配子；以四倍体雄性不育系为母本，以所述的秋水仙素诱导得到的含2n雄配子的二倍体为父本在花期进行人工有性多倍化杂交育种，获得所述的四倍体不结球白菜。本发明首次采用四倍体不结球白菜雄性不育系×诱变产生2n配子的二倍体不结球白菜的有性多倍化育种途径，获得四倍体不结球白菜新种质，与无性多倍化的同源四倍体相比具有更广泛的遗传多样性，更高的结实率。本发明新四倍体具有多倍体的巨大性、抗病性、耐寒性，品质好，还具有二倍体父本的性状。
文档编号A01H5/00GK101946696SQ20101052985
公开日2011年1月19日 申请日期2010年11月3日 优先权日2010年11月3日
发明者于旭红, 侯喜林, 刘惠吉, 张蜀宁, 李式军, 李英, 钟程 申请人:南京农业大学