提高种子产量和促进植物生长的方法

文档序号:114367阅读:693来源:国知局
专利名称:提高种子产量和促进植物生长的方法
技术领域
本发明涉及一种提高种子产量和促进单子叶植物和双子叶植物生长的方法,其通过在同基因或转基因植物细胞中过表达TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白或其同源物或其类似物而实现。本发明还涉及与野生型相比具有提高种子产量和促进生长的特性的转基因植物,所述转基因植物包括编码TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白的核苷酸序列以及可操作地与其连接的调控核苷酸序列,所述调控核苷酸序列用于控制转基因植物的植物细胞中TMT蛋白的增加的基因表达。本发明还涉及所述转基因植物在栽培及生产栽培植物和有用植物或由其产生的生物质、油或蛋白质中的应用。本发明还涉及一种基因构建体,其包括编码拟南芥((Arabidopsis thaliana)TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白TMTl的核苷酸序列。
背景技术
许多植物被用作获得油和蛋白质的基础,因此代表着食品工业的重要原料载体。在这方面,首先提到的是油菜(甘蓝型油菜(Brassicanapus)),其在世界农业经济上具有重要意义,其种子中储存着大量油和蛋白质。2009年,仅德国就收获了 620万吨油菜籽。由于其油的储存质量,这种植物尤其适于农业上生产油和蛋白质,这被许多增加油菜籽的产量和该植物生产的产品产量 的尝试所证明。油菜籽的油产量居全球第三位,位于大豆油和棕榈油之后(Jaworski等人,1993,油菜种子产量与收获方法有关(Canola seed yield inrelation to harvestmethods) ;Janick, JE Simon编著,新作物(New Crops) ;ffiley,纽约(New York), p.330-301)。油菜籽的主要成分为大量的油(约35-45%)和蛋白质(20-22%)。因而油是该成熟籽粒的主要能量储存。油菜的近亲为模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana),其被用作遗传研究,是高等植物生理机能的优秀代表。为此,在模式植物拟南芥中获得的结果也可以转用于其他植物物种。由于植物作为油和蛋白质提供者的能力,相当长的时期以来人们一直尝试在栽培过程中提高植物产量和其种子产量,以最终提高生产中产出的油或蛋白质的产量。如果能够成功地提高种子的产量,那么相应就有可能提高每公顷收获的油和蛋白质的产量。在W02008/092935A2中公开了这样的方法。该说明书描述了一种通过调控编码YEP(产量增加蛋白)蛋白的核酸表达来提高植物收获物的方法。所述YEP选自一组细胞蛋白,尤其是核小体样蛋白1-样多肽(NAP1-样)、LikeSm多肽(Lsm蛋白)、截短的eyeIinH(CycHTr)多肽、Remorin多肽和DREB蛋白。用YEP转染植物细胞使得植物和植物部位如种子的生长率增加。该方法相应地基于外源基因的引入及其在转基因植物中的表达。但是,其没有提到糖从细胞液进入到植物液泡中的运输。为了使种子在生长时能储存油和蛋白质,首先必须在绿色光合有效的叶子和储存器官之间存在交流;也即,将光合作用产物从叶子运送至种子,并在那里组装成油脂和蛋白质。光合作用是将光能转变为生物化学能的过程,并最终在叶子中产生糖、淀粉、氨基酸和有机酸。特别是如果糖没有快速及时地从叶子中转移出去,其会在单独的光合作用细胞中发生积累。这种糖的积累向叶子发出光合作用足够有效的信息,然后在遗传水平上进行下调(Rolland等人,2002,植物中糖的传感和信号转导(Sugar sensing and signaling inplants),植物细胞(PlantCell) 14:185-205)。这意味着细胞液中的高糖分浓度使对有效光合作用必要的基因的表达降低,从而导致光合作用效率下降(Koch,1996,植物中碳水化合物调控的基因表达(Carbohydrate-modulated geneexpression in plants), Ann RevPlant Physiol Plant Mol Biol 47:509-540)。从而得出结论是可达到的最大光合作用被高糖分浓度抑制,这里尤其指在光合有效细胞的细胞液中的葡萄糖。在各种单子叶植物和双子叶植物中,如苜蓿(Nedicago)(鉴定号N0.AC131026)、葡萄(Vitis vinifera)(鉴定号 Νο.ΑΑΧ47312)和水稻(Oryza sativa)(鉴定号N0.0s02gl3560),发现了一种负责将糖从植物细胞的细胞质中运送至液泡的蛋白。植物液泡在长期或短期储存糖上起主要作用。储藏组织如甜菜(Beta vulgaris)和甘鹿(Saccharumofficinarum)积累了大量鹿糖,以作为植物代谢的能源。白天积累在叶子中的糖在晚上从液泡中释放出来。最终,在拟南芥属植物中鉴定了一个基因,其蛋白产物为位于光合有效细胞液泡膜上的一种糖转运体,并能够将葡萄糖(单糖)从细胞液中运送至液泡(Wormit等人,2006,拟南芥属植物中涉及液泡中糖运输的新单糖转运体的分子鉴定和生理学特征(Molecularidentification and physiological characterization of anovelmonosaccharide transporter from Arabidopsis involved in vacuolarsugartransport),植物细胞(Plant Cell) 18:3476-3490)。这种转运蛋白称为液泡膜单糖转运体(TMT),位于最大细胞器的膜上。液泡作为一种植物细胞器在光合活性的植物细胞中占约90%的体积(Martinola等人,2007,液泡转运体及其在植物代谢中的主要作用(Vacuolar transportersand their essential role in plant metabolism), J Exp Bot58:83-102),因此仅就其体积而言在储存糖分方面就极为重要(Neuhaus HE, 2007,初级代谢产物跨越植物液泡膜的运输(Tra nsport of primary metabolitesacross the plantvacuolar membrane),FEB S Lett 581:2223-2226)。所述液泡膜单糖转运体(TMT)蛋白在拟南芥中包括3种亚型,其表示为TMT1、TMT2和TMT3。TMTl和TMT2的基因表现出组织和细胞种类特异性的表达方式,而TMT3基因仅有很弱的表达。通过基因敲除法,有可能表明与野生型植物相比,发生该变化后的植物液泡中积累明显更少的葡糖糖和果糖。而二糖蔗糖则没有检测到差异。仅在拟南芥属植物中就已确定了 6O种以上单糖转运蛋白的亚型,其被分为各种组(Lalonde等人,2004,碳和氮的有机形式在源和汇之间的运输机制(Transportmechanisms for organic forms of carbonand nitrogen between source and sink),Annu, Rev.Plant Biol, 55,341-372)。许多这类转运蛋白同样位于液泡膜上。

发明内容
针对这一背景,本发明目的是提供一种可增加种子产量和生长的方法和转基因植物。这种方式尤其可增加所述植物产生的油和蛋白质的产量。该目的通过具有如权利要求1所述特征的方法来实现。优选的实施方案在其从属权利要求中描述。本发明人惊奇地发现,液泡膜单糖转运体(TMT)蛋白的过表达突变体导致糖分如葡萄糖在植物细胞的液泡中浓缩,而细胞液中的糖分浓度则更低。糖转运蛋白的过表达导致负责光合作用的基因表达增强(还可观察到光合作用效率提高),最终提高植物种子的重量。每角种数保持不变,但是每株植物的种子总数明显增加。由此得出结论,位于液泡膜上的糖转运蛋白的过表达导致种子产量增加并促进了植物生长。由于在所有含有液泡的植物细胞中均发现将单糖和二糖从细胞质运送至液泡的转运蛋白,因此本发明的方法可应用于单子叶植物和双子叶植物。如果将本发明中获得的结果从拟南芥转移至油菜,那么本发明的方法可用于显著提高油菜的油和蛋白质产量。因此通过本发明方法可能提高全世界的重要栽培植物和有用植物的收获物,及其生产的产物。本发明的方法基于液泡膜单糖转运体(TMT)蛋白或其同源物或类似物在单子叶植物或双子叶植物同基因或转基因细胞中的过表达。本发明的cDNA克隆(鉴定号N0.8B8T74)编码734个氨 基酸,并表现出与集胞藻(Synechocystis)的细菌葡萄糖转运体GTR具有32%的序列相似性,与位于细胞质膜的拟南芥葡萄糖转运蛋白STPl具有26%的相似性(Wormit等人,2006,拟南芥属植物中涉及液泡中糖运输的新单糖转运体的分子鉴定和生理学特征(Molecular identification andphysiological characterization ofa novel monosaccharide transporterfrom Arabidopsis involved in vacuolar sugartransport),植物细胞(PlantCell) 18:3476-3490)。该蛋白称为液泡膜单糖转运体蛋白(TMT) I。通过聚合酶链反应可以扩增除TMTl以外的另外两个TMT亚型,TMT2蛋白含有739个氨基酸残基,TMT3蛋白含有729个氨基酸残基。TMTl蛋白具有12个跨膜域和一个位于中央的相对大的亲水环,其使得结构域6和7互相连接。该环含有约320个氨基酸残基,因此比原核生物和真核生物中已知的其他单糖转运蛋白的相应结构大4-5倍。所述拟南芥液泡膜单糖转运体(TMT)蛋白的cDNA序列如SEQ IDN0:2所示,其衍生的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。下述实施例中进行的试验清楚地表明,通过拟南芥液泡膜单糖转运体(TMT)蛋白TMTl的过表达,与野生型植物相比,拟南芥种子重量增加了,成熟拟南芥种子中的油和蛋白质含量提高了。而且在各种拟南芥植物系中的作物种子产量也可提高。所述过表达还导致与野生型相比,拟南芥植物发育明显更快并表现出生长增加。推测这归因于TMT蛋白过表达导致来自植物细胞细胞液中的糖分在液泡内的积累,从而提高光合作用率。或者,也可推测为,过表达突变体的较大种子给幼苗提供了更多的能量,这比野生型幼苗更具优势,尤其是在早期发育阶段。由于位于液泡膜的许多糖转运蛋白已知存在于单子叶和双子叶植物细胞中,可以理解本发明的原理通常可转用于相应的糖转运蛋白。由于在拟南芥中确认的TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白也表现出与其他植物细胞(参见简介)中转运蛋白具有序列同源性,拟南芥TMTl转运蛋白的同源性转运蛋白也包括在本发明中。本发明范围内的“同源物”表示与拟南芥TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白TMTl具有序列高度一致性的转运蛋白。优选地,同源物与拟南芥TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白TMTl的氨基酸序列具有 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列
一致性。以区别的方式,本发明范围内的“类似物”表示位于液泡膜上并具有将糖从细胞质转运至液泡的功能而不一定与TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白具有序列同源性的糖转运蛋白。因而类似物具有与TMTl蛋白同样的功能但结构上可以不同。与同源物不同,遗传关系并非首要条件。优选地,具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的拟南芥TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白TMTl或其同源物或类似物用于提高种子产量以促进单子叶植物或双子叶植物的生长。对于过表达或调控的基因表达,优选将编码TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白的核苷酸序列或其同源物或类似物引入植物细胞,并在组成型或诱导型启动子的控制下在所述植物细胞中过表达。组成型启动子的实例为:花椰菜花叶病毒35S启动子、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂氨酸/章鱼碱合成酶启动子或玉米Emu启动子。此外,还有光-诱导型启动子如RUBISC0小亚基rbcS启动子(水稻、番茄)。植物细胞中基因的基因表达方法通常为已知的并描述于文献中,其为具体的克隆方法和受控的基因表达调控。除了启动子以外,也需要用于基因受控表达的终止序列。对于幼苗的选择,另外还可引入标记基因(例如,GFP)或用于检测特定抗体如针对c-myc模序的其他选择基因。可通过克隆具有相应核苷酸序列的质粒或整合至植物细胞的基因组中进行基因表达。稳定地整合至植物细胞的基因组中和基因表达靶向调控的可能性使得能够在植物细胞中稳定表达TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白或其同源物或类似物。根据本发明,TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白或其同源物或类似物可在同基因和转基因植物细胞中过表达。在同基因植物细胞中,上述转运蛋白的内源基因过表达,最终导致与野生型相比所述植物种子产量增加和植物生长更快。此外,也可使用其他植物中的糖转运蛋白进行过表达,从而在转染的植物细胞中实现转基因的基因表达。例如,拟南芥TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白TMTl基因可被转染至油菜植物甘蓝型油菜再表达所述基因。TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白或其同源物或类似物在植物细胞中的表达,尤其是在具有高的液泡储存能力的植物细胞如甘蓝型油菜中,因为其能产生大量油或蛋白质而尤其具有经济意义。例如,通过 靶向插入本发明的TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白基因及其表达,可提高胚乳生产和马铃薯块茎生产,因此获得更高的淀粉产量,继而增加生物酒精的生产。 TMT(液泡膜单糖转运 体)蛋白或其同源物或类似物在同基因或转基因植物细胞中的靶向整合和表达还使得每单位面积的产量增加,因为所述植物更早达到收获大小并可相应地改良。因此有可能在同样的栽培面积上以更短的时间得到更多的收获物。与野生型植物相比,本发明的方法使得收获物明显增加并明显提高了每单位面积的生物质产量。原则上本发明的方法可用于所有单子叶植物和双子叶植物。对于栽培植物和有用植物例如甘蓝型油菜尤其具有经济意义。优选用于例如下述物种及其更高的属:拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、白菜型油菜(Brassica rapa)、花生(Arachis hypogea)、Boechera stricta、木揽(Bruguiera gymnorhiza)、葡萄柚(Citrus paradisi)、积橘(Poncirus trifoliate)、乳衆大卓戈(Euphorbiaesula)、野草莓(Fragaria vesca)、棉花(Gossypium hirsutum)、雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)、大豆(Glycine max)、向日葵(Helianthusannuus)、牵牛(Ipomoea nil)、番爺(Lycopersicon esculentum)、宿根莴苣(Lactuca perennis)、柳叶莴苣(Lactuca saligna)、毒萬苣(Lactucaserriola)、萬苣(Lactuca sativa)、百脉根(Lotusjaponicus)、苹果(Malusdomestica)、蔡藜苜猜(Medicago truncatula)、烟草(Nicotianatabacum)、野生稻(Oryza australiensis)、短花药野生稻(Oryza brachyantha)、斑点野生稻(Oryza punctata)、马来野生稻(Oryza ridleyi)、普通野生稻(Oryzarufipogon)、栽培稻(Oryza sativa)、毛果杨(Populus trichocarpa)、积澄(Poncirus trifoliata)、桃(Prunus persica)、马铃薯(Solanum tuberosum)、高梁(Sorghum bicolor)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、甘鹿(Saccharum officinarum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、芒草(Miscanthus)、葡萄(Vitis vinifera)、大麻(Cannabis sativa)。本发明还涉及与野生型相比具有提高种子产量和促进生长的特性的转基因植物,所述转基因植物包括编码TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白的核苷酸序列以及可操作地与其连接的调控核苷酸序列,所述调控核苷酸序列用于控制转基因植物植物细胞中TMT蛋白的增加的基因表达。优选地,所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的拟南芥TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白TMTl或其同源物或类似物。本发明的转基因植物可用于栽培植物或有用植物的栽培。而且,可用于所述植物产生的生物质、油或蛋白质的生产。本发明还包括基因构建体,其包括编码SEQ ID NO:1所示的拟南芥TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白TMTl的核苷酸序列或其同源物或类似物以及可操作地与其连接的调控核苷酸序列,所述调控核苷酸序列用于控制植物细胞中TMT蛋白的增加的基因表达。下述附图将更详细地解释本发明。


下列附图中: 图1所示为制备TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白的过表达构建体的克隆图;图2所示为T-DNA插入至双突变体TMT1-2的示意图;图3所示为拟南芥种子的千粒重;图4所示为拟南芥种子的油和脂类含量;图5所示为拟南芥的每角种数;图6所示为每株拟南芥植物种子总重量;图7所示为15和34天后拟南芥植物的生长发育。
具体实施例方式实施例克隆用于TMT蛋白(Attmtl)过表达的质粒构建体将拟南芥TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白TMTI的cDNA (=Attmt-cDNA)用于糖转运蛋白的表达。将在推定跨膜域6和7之间的亲水环区用含有c-myc模序的修改的Attmt-cDNA制备过表达构建体。这就是构建体pMUT3 (见图1)。首先用限制酶EcoRI和Clal从质粒pMUT3上切割完整cDNA序列,并连接至质粒pHannibal与相同的酶(pSR3)线性化。形成一个表达盒,其中花椰菜花叶病毒35S启动子位于TMTl-cDNA的上游,而OCS终止子位于下游末端基因(章鱼碱合成酶基因的多腺苷酸化信号)的下游。进一步用限制酶Notl对质粒pSR3进行限制性消化以分离该表达盒,最后将其引入至植物转化载体PART27 (pSR6)。
整合有c-myc模序(以红色强调)的Attmtl的cDNA序列(SEQ IDNO: 2)如下:ATGAAGGGAGCCGACTCTCGTTGCTCTCGCCGCCACAATCGGCAATTTCTTACAAGGATGGGACAATGCCACCATTGCTGGAGCTATGGTTTATATCAACAAAGACTTGAATCTACCAACCTCTGTTCAAGGTCTTGTCGTGCTATGTCATTGATGGTGCAACGGTCATCACGACTTGCCTCAGGACCGATATCTGATTGGCTCGGCAGACGCCCCATGGCTCATTTTATCATCAGTTATGTATTTCGTCTGCGGTTTGATAATGTTGTGGTCTCCCAATGTCTATGTTCTGTGCTTTGCTAGGCTTCTTAATGGGTTTGGTGCCGGGCTCGCGGTTACACTTGTCCCTGTTTACATTTCTGAAACCGCTCCTCCGGAGATCAGAGGACAGTTAAATACTCTCCCTCAGTTTCTTGGCTCTGGTGGAATGGTTTTTGTCATACTGTATGGTTTTCACTATGTCCCTGAGTGACTCCCCTAGCTGGAGAGCCATGCTCGGTGTCCTCTCGATCCCTTCTCTTCTTTATTTGTTTCTCACGGTGTTTTATTTGCCCGAGTCTCCTCGTTGGGCTGGTTAGTAAAGGAAGAATGGACGAGGCTAAGCGAGTTCTTCAACAGTTATGTGGCAGAGAAGATGTTACCGATGAGATGGCTTTACTAGTTGAAGGACTAGATATAGGAGGAGAAAAACAATGGAAGATCTCTTAGTAACTTTGGAGGATCATGAAGGTGATGATACACTTGAAACCGTTGATGAGGATGGACAAATGCGGCTTTATGGAACCCACGAGAATCAATCGTACCTTGCTAGACCTGTCCCAGAACAAAATAGCTCACTTGGGCTACGCTCTCGCCACG GAAGCTTAGCAAACCAAAGCATGATCCTTAAAGATCCGCTCGTCAATCTTTTTGGCAGTCTCCACGAGAAGATGCCAGAAGCAGGCGGAAACACTCGGAGTGGGATTTTCCCTCATTTCGGAAGCATGTTCAGTACTACTGCCGATGCGCCTCACGGTAAACCGGCTCATTGGGAAAAGGACATAGAGAGCCATTACAACAAAGACAATGATGACTATGCGACTGATGATGGTGCGGAACAAAAACTTATCTCGGCAGAAGATTGCGTAGCCCCTTAATGTCGCGCCAGACCACAAGCATGGACAAGGATATGATCCCACATCCTACAAGTGGAAGCACTTTAAGCATGAGACGACACAGTACGCTTATGCAAGGCAACGGCGAAAGTAGCATGGGAATTGGTGGTGGTTGGCATATGGGATATAGATACGAAAACGATGAATACAAGAGGTATTATCTTAAAGAAGATGGAGCTGAATCTCGCCGTGGCTCGATCATCTCTATTCCCGGAGGTCCGGATGGTCGAGGCAGCTACATTCACGCTTCTGCCCTTGTAAGCAGATCTGTTCTTCGTCCTAAATCAGTTCATGGATCCGCCATGGTTCCCCCGGAGAAAATTGCTGCCTCTGGACCACTCTGGTCCTGCTCTTCTTGAACCTGGTGTTAAGCGTGCCTTGGTTGTGGTGTCGGCATTCAAATACTGCAGCAGTTTTCAGGTATCAATGGAGTTCTCTACTACACTCCTCAGATTCTCGAACGGGCTGGCGTAGATATTCTTCTTTCGAGCCTCGGACTAAGTTCCATCTCTGCGTCATTCCTCATCAGCCGGTTTAACAACATTACTCATGCTCCCAGCCATTGTCGTTGCCATGAGACTCATGGATGTATCCGGAAGAAGGTCATTACTTCTCTGGACAATCCCAGTTCTCATTGTCTCACTTCGTCGTCCTGTCATCAGCGAGCTCATCCACATCAGCAAAGTCGTGAACGCAGCACTCTCCACAGGTTGTGTCGTGCTCTACTTCTGCTTCTTCGTGATGGGTTACGGTCCCATTCCAAACATCCTCTGTTCTGAAATCTTCCCAACAAGAGTCCGTGGTCTCCTGCATCGCCATATGTGCTATGGTCCTTTTGGATTGGAGACATTATTGTCACGTACTCACTTCCCGTTCTCCCTCAGCTCGATCCGGACTAGTTGGTGTTTTCAGCATTTTACGCTGCGGTTTGCGTTATCTCATGGATCTTCGTTTACATGAAAGTCCCGGAGACTAAAGGCATCCCTTTGGAAGTACACAGACTACTTTGCCTTTGGAGCTCAAGCTCAAGCTTCTGCTCCTTCTAAGGATATATAA图1所示为基于AttmtlcDNA制备过表达构建体pSR6的克隆图。所获得的载体pMUT3和pSR3的序列见序列表或SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4。Attmtl过表达系的制备采用所谓的“花序浸溃法”将过表达构建体引入至拟南芥植物的基因组中。在该过程中,将花序浸入至预先用PSR6构建体转化的农杆菌(GV3101菌株)的悬浮液中。转化的植物为纯合基因的t-DNA插入细胞系,其内源tmtl基因和内源tmt2基因由于转化DNA的插入而被缺失(见Wormit等人,2006,拟南芥属植物中涉及液泡中糖运输的新单糖转运体的分子鉴定和生理学特征(Molecular identificationand physiologicalcharacterization of a novel monosaccharide transporterfrom Arabidopsis involvedin vacuolar sugar transport),植物细胞(PlantCell) 18:3476-3490)。以这种方式,抑制了针对tmtl和tmt2的其内源mRNA的产生,且防止了对人工mRNA的共抑制。代替删除内源tmtl和tmt2基因的是,异源tmt序列也可以过表达。内源tmtl-cDNA序列的表达还是可能的。当种子形成完成后,收获所述植物并使其在含卡那霉素的琼脂板萌发以选择转基因细胞系。由于转染的植物细胞携带卡那霉素抗性基因,只有成功转染了 tmtl-cDNA的幼苗才能够生长发育,因为这样的细胞产生了抗生素抗性。通过Northern印迹分析进行过表达细胞系的选择,选择与野生型相比Attmtl转录量明显增加的细胞系。图2中再次示意性说明了该情形。图中显示单独的t-DNA插入至Attmtl和Attmt2cDNA的外显子区。栽培用于种子分析的植物萌发前,将拟南芥种子于4° C黑暗中孵育2天进行抑制。将野生型植物、纯合基因的突变体细胞系tmtl-2和3个tmtl过表达细胞系1、4和10在平板上培养9周,并于22° C在短日条件(10小时光照,14小时黑暗)培养箱中培养。此后,将植物转换至22° C长日条件(14小时光照,10小时黑暗)。在这些条件下连续浇水3周。然后停止浇灌,将植物培养至有明显的完全干燥的果序。借助种子采集器(Aracon 720)采集各株植物的种子。种子分析

将0.1g完全成熟的风干种子在研钵内的液氮中匀浆,以进行脂肪酸定量。然后加入1.5ml异丙醇,进一步匀浆。将该悬浮液转移至1.5ml容积的反应容器,并在实验室搅拌器中以IOOrpm于4° C孵育12小时。将样品以12,OOOg离心10分钟,将上清液转移至预先测量的1.5ml反应容器中。将该反应容器于60° C孵育8小时以蒸发异丙醇。然后通过重量测定法确定总油脂含量。将0.1g种子于室温下在研钵内匀浆,以进行蛋白质定量。然后加入1000 μ I缓冲液介质(50mM HEPES,5mM MGCl2, pH7.5, l%Triton X100,15% 甘油,2%SDS,Im EDTA, PMSF,1/100 (v/v)),进一步匀浆。将该悬浮液转移至1.5ml反应容器,将样品于室温下以12,OOOg离心10分钟。将上清液转移至新的1.5ml反应容器,用BCA试剂按照生产商的推荐对蛋白质定量。结果图3所示为拟南芥种子的千粒重。使用野生型拟南芥植物和液泡TMT活性明显降低的tmtl-2突变体为对照(Wormit等人,2006,拟南芥属植物中涉及液泡中糖运输的新单糖转运体的分子鉴定和生理学特征(Molecular identification and physiologicalcharacterization of anovel monosaccharide transporter from Arabidopsis involvedin vacuolarsugar transport),植物细胞(Plant Cell) 18:3476-3490)。过表达系 1、4 和10的过表达使得与野生型相比其千粒重显著增加。图4所示为拟南芥种子的油和脂类含量。与野生型拟南芥植物(WT)及3个单独的TMTl过表达系比较,油含量(图4A)和蛋白质含量(图4B)增加了。图5所示为拟南芥的每角种数。野生型拟南芥植物(WT)和3个单独的TMTl过表达系的每角果平均种子数几乎相同。
图6概括了每株拟南芥植物的种子总重量。所示为野生型拟南芥植物(WT)和3个单独的TMTl过表达系的所有成熟种子的平均总重量。与野生型相比,过表达系的种子总重量明显提高了。这在图6A中清晰可见,而在图6B中定量测量了每株植物的种子。图7所示为15和34天后拟南芥植物的生长发育。仅15天后过表达系即表现出明显的促进生长,与野生型拟南芥植物相比明显更大。因此,TMTl过表达使得所述植物生长增加了。总之,所述结果清楚表明,通过TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白的过表达可提高种子产量、发芽能力和植物生长。与附图相关的文字描述:图1:制备Attmtl过表达构建体pSR6的克隆图;amp:氨节青霉素抗性基因;CaMV-35S:花椰菜花叶病毒35S启动子;0CS:章鱼碱合成酶基因的多腺苷酸化信号;tmtl-cmyc:插入有 cmyc 模序的 Attmtl 的 cDNA ;图2:T-DNA插入至双突变体tmtl-2的示意图;A:插入有T-DNA的Attmtl ;B:插入有 T-DNA 的 Attmt2 ;图3:拟南芥种子的千粒重。所示为野生型拟南芥植物(Wt,基于100%)和3个单独的TMTl过表达系的重量。tmtl-2是没有表现出液泡TMT活性的突变体(Wormit等人,2006)。数据具有统计学意义(平均值+/_标准误差),并源自3个单独的植物栽培;图4:拟南芥种子的油和脂类含量。所示为野生型拟南芥植物(WT)和3个单独的TMTl过表达系的油含量㈧和蛋白质含量(B)。tmtl-2是没有表现出液泡TMT活性的突变体(Wormit等人,2006)。数据具有统计学意义(平均值+/_标准误差),并源自3个单独的植物栽培;
图5:拟南芥的每角种数。所示为野生型拟南芥植物(WT)和3个单独的TMTl过表达系的每角平均种子数。tmtl-2是没有表现出液泡TMT活性的突变体(Wormit等人,2006)。所述数据具有统计学意义(平均值+/_标准误差),并源自3个单独的植物栽培;图6:每株拟南芥植物的种子总重量。所示为野生型拟南芥植物(WT)和3个单独的TMTl过表达系的所有成熟种子的平均总重量。tmtl-2是没有表现出液泡TMT活性的突变体(Wormit等人,2006)。A.可视化表征;B.种子量化。数据具有统计学意义(平均值+/-标准误差),并源自3个单独的植物栽培;图7:15和34天后拟南芥植物的生长发育。所示为野生型拟南芥植物(WT)、tmtl-2突变体(其缺少液泡葡萄糖转运体TMT活性(Wormit等人,2006))和3个单独的TMTl过表达系的生长发育状态。可清晰看出TMT过表达系更快的生长发育。
权利要求
1.高种子产量和促进单子叶植物或双子叶植物生长的方法,其通过在同基因或转基因植物细胞中过表达TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白而实现。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白包括SEQ ID NO:1所不的拟南芥(Arabidopsisthaliana)TMTl的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,将编码TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白的核苷酸序列引入植物细胞,并在组成型或诱导型启动子的控制下在所述植物细胞中过表达。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于,所述TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白与SEQ ID NO:1所示的拟南芥TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白TMTl的氨基酸序列具有50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列一致性。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,所述植物为下述物种或其更高属的栽培植物或有用植物:拟南芥(Arabidopsisthaliana)、甘蓝型油菜(Brassicanapus)、甘蓝(Brassica oleracea)、白菜型油菜(Brassica rapa)、花生(Arachishypogea)、Boechera stricta、木揽(Bruguiera gymnorhiza)、葡萄柚(Citrus paradisi)、积橘(Poncirustrifoliate)、乳衆大戟(Euphorbia esula)、野草莓(Fragaria vesca)、棉花(Gossypium hirsutum)、雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)、大豆(Glycinemax)、向日葵(Helianthus annuus)、牵牛(Ipomoea nil)、番爺(Lycopersicon esculentum)、宿根莴苣(Lactuca perennis)、柳叶莴苣(Lactuca saligna)、毒莴苣(Lactuca serriola)、莴苣(Lactuca sativa)、百脉根(Lotus japonicus)、苹果(Malus domestica)、蔡藜苜猜(Medicagotruncatula)、烟草(Nicotiana tabacum)、野生稻(Oryza australiensis)、短花药野生稻(Orya brachyantha)、斑点野 生稻(Oryza punctata)、马来野生稻(Oryzaridleyi)、普通野生稻(Oryza ruf ipogon)、栽培稻(Oryzasativa)、毛果杨(Populustrichocarpa)、积澄(Poncirus trifoliata)、桃(Prunus persica)、马铃薯(Solanumtuberosum)、高梁(Sorghum bicolor)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、甘鹿(SaccharumofTicinarum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、芒草(Miscanthus)、葡萄(Vitisvinifera)、大麻(Cannabis sativa)。
6.基因植物,其与野生型相比具有提高种子产量和促进生长的特性,所述转基因植物包括编码TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白的核苷酸序列以及可操作地与其连接的调控核苷酸序列,所述调控核苷酸序列用于控制转基因植物的植物细胞中TMT蛋白的增加的基因表达。
7.根据权利要求6所述的转基因植物,其特征在于,所述核苷酸序列编码SEQID NO:1所示的拟南芥TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白TMTl。
8.权利要求5-7任一项所述的转基因植物在栽培或生产栽培植物或有用植物或由其产生的生物质、油或蛋白质中的应用。
9.因构建体,其包括编码SEQID NO:1所示的拟南芥TMT (液泡膜单糖转运体)蛋白TMTl的核苷酸序列以及可操作地与其连接的调控核苷酸序列,所述调控核苷酸序列用于控制植物细胞中TMT蛋白的增加的基因表达。
10.根据权利要求9所述的基因构建体,其特征在于,所述TMTl核苷酸序列为异源cDNA序列,所述调控核苷酸序列为组成型或诱导型启动子和终止序列。
全文摘要
本发明涉及一种提高种子产量和促进单子叶植物或双子叶植物生长的方法,其通过在同基因或转基因植物细胞中过表达TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白而实现。本发明还涉及与野生型相比,具有提高种子产量和促进生长的特性的转基因植物,所述转基因植物包括编码TMT(液泡膜单糖转运体)蛋白的核苷酸序列以及可操作地与其连接的调控核苷酸序列,所述调控核苷酸序列用于控制转基因植物的植物细胞中TMT蛋白的增加的基因表达。其还涉及所述转基因植物在栽培或生产栽培植物或有用植物或由其产生的生物质、油或蛋白质中的应用。
文档编号A01H5/00GK103097401SQ201080066864
公开日2013年5月8日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年3月27日
发明者埃克哈德·纽豪斯, 奥利弗·坦安特曼, 亚历山德拉·沃米特, 卡琳娜·温恩特 申请人:凯撒斯劳滕工业大学
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