专利名称：人hcv基因的斑马鱼肝脏复制模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及人HCV基因的斑马鱼肝脏复制模型，具体的，涉及利用基因重组和分子生物学方法获得的两种斑马鱼HCV亚复制子模型斑马鱼正向HCV亚复制子模型和斑马鱼反式HCV亚复制子模型。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)是一种具包膜的正链单股RNA病毒。持续性HCV感染是发展成肝细胞癌(HCC)的主要危险因素。当前在丙型肝炎的预防和治疗中存在的问题是HCV疫苗研究尚未获得突破进展；耐药问题严重，急需新型的抗HCV药物。而HCV研究主要障碍是缺乏合适的细胞模型及小动物模型。这极大的限制了 HCV新药的研究及丙型肝炎的防治工作。HCV core蛋白作为结构蛋白在病毒的致病性方面具有重要作用；HCV非结构蛋白(NS)，则更多在病毒的复制、多蛋白产物的切割、HCV与宿主细胞间相互作用等过程中发挥重要作用，因此研究HCV非结构蛋白的作用机制，利用这些蛋白作为靶点筛选新药具有重要的理论意义和实用价值。斑马鱼属脊椎动物，其生长发育过程、组织系统结构与人有很高的相似性，两者在基因和蛋白质的结构和功能上也表现很高的保守性，因此斑马鱼是研究人类疾病发生机理的优良模式动物。斑马鱼具有个体小、养殖成本低的优点，是高通量药物筛选的惟一脊椎动物模型。利用突变体或转基因鱼，甚至野生型斑马鱼均可较方便地进行小分子化合物的筛选，筛选出的化合物可用做进一步的临床测试。因此，我们尝试利用斑马鱼建立HCV复制模型。
发明内容
本发明的一个方面，涉及斑马鱼正向HCV亚复制子模型。利用小鼠肝核因子基因HNMa启动子调控下游基因表达，顺序连接HCV 5 ^ UTR-core、脑心肌炎病毒内核糖体进入位点IRES、报告基因EGFP和HCV IRES-NS5B-3、UTR基因序列，构建了 HCV亚复制子基因表达构件pHHIGI 5B。将此构件显微注射斑马鱼受精卵，经HNMa启动子转录产生mRNA，由于此构件含有HCV的5、UTR.core.NS5B和3、UTR,具备了 HCV病毒的亚复制子结构，因此，此mRNA可做为复制模版，在HCV RNA依赖的RNA聚合酶(NS5B)的作用下，产生负链的亚复制子RNA。荧光显微镜下可观察到EGFP荧光在肝脏区域的表达。western-blot可检测到21kD core蛋白带和NS5B蛋白带。RT-PCR可检测出亚复制子负链RNA的存在，说明注射该基因构件的斑马鱼体内存在HCV亚复制子的复制过程。原位杂交实验也进一步证实斑马鱼幼体肝区存在亚复制子负链RNA。综上，斑马鱼正向HCV亚复制子模型是成功的。本发明的另一方面，涉及斑马鱼反式HCV亚复制子模型。该模型通过向斑马鱼受精卵共注射两种HCV基因表达质粒而组成，pIresDsRed-5B可在CMV promoter指导下分别表达HCV RNA polymerase (NS5B)蛋白和红色荧光蛋白；pRVIresCore-GFP_3N构件可在CMV promoter指导下分别产生反义的HCV 5、UTR-core和IRES-EGFP转录产物(antisense-transcripts)，以及正链 HCV 3，UTR。当由 pIresDsRed_5B 产生 NS5B(HCVRNA-d印endant RNA polymerase)时，由 pRVIresCore-GFP_3N 转录的反义 RNA 就能够作为复制模版，在RNA依赖的RNA聚合酶作用下复制产生互补的mRNA，并被翻译成EGFP和core蛋白。结果显示，在荧光显微镜下可以在同一条斑马鱼幼体肝区观察到绿色荧光和红色荧光，可直观地证明该业复制子复制过程的存在。RT-PCR验证了复制产物——正链HCV5、UTR-core-IRES-EGFP-HCV 3，UTR 的存在。Western blot 结果进一步证实了 core和NS5B蛋白(来自复制产生的mRNA)在共注射斑马鱼体内的表达。此外，利用原位杂交技术，EGFP和core的正义和反义RNA探针均在斑马鱼幼体肝区检测到阳性信号；NS5B的反义探针也检测到阳性信号，并且信号主要集中在斑马鱼的肝脏区域。而对照组(只注射了pRVIresCore-GFP-3N 基因构件)由于缺少 HCV RNA polymerase，由 CMV promoter 转录出的反义的RNA不能被“复制”产生互补的mRNA，也未产生HCVCore和GFP蛋白。综上所述，所构建的HCV反式亚复制子斑马鱼模型同样是成功的。 我们利用RT-PCR检测了两种亚复制子注射的斑马鱼幼体中HCV感染容易引起肝脏病变的一些基因markers的表达变化，乙酰辅酶A羧化酶(Acc)、类肝素酶(h印aranase)在注射的斑马鱼幼体的表达水平明显升高，表明已开始发生肝细胞脂肪变性。提示HCV亚复制子导入斑马鱼肝脏后，不仅具有复制功能，还可导致肝脏发生类似人体和哺乳类动物模型的HCV病变。这些结果表明，这两种斑马鱼HCV复制模型是成功的。用HCV阳性药物利巴韦林(ribayirin)、候选药物苦参素(Oxymatrine)及其类似物DM-122对斑马鱼亚复制子模型进行验证。反式亚复制子模型中，加入利巴韦林后core的正义RNA明显降低，并呈剂量依赖性，而反义RNA则无明显变化，说明利巴韦林主要抑制core的正义RNA产生，即抑制复制的过程。苦参素和DM-122也都呈剂量依赖性抑制core的正义RNA产生，对core的反义RNA无明显抑制作用。顺式亚复制子模型也得到类似的结果。这些结果初步说明斑马鱼HCV亚复制子模型可以用于抗HCV药物筛选。同时也证明苦参素及其类似物对于HCV的复制具有抑制作用。利用斑马鱼HCV复制子模型作为研究平台，可用以研究HCV基因组复制的分子机制，评估药效和研究治疗策略等。同时这些结果也为利用斑马鱼作为HCV研究的动物模型增强了信心。
权利要求
1.一种斑马鱼正向HCV亚复制子模型，其特征在于利用小鼠肝核因子基因HNMa启动子调控下游基因表达，顺序连接HCV 5 ^UTR-core、脑心肌炎病毒内核糖体进入位点IRES、报告基因EGFP和HCV IRES-NS5B-3 1 UTR基因序列，构建了 HCV亚复制子基因表达构件PHHIGI5B ；将此构件显微注射斑马鱼受精卵，经HNMa启动子转录产生mRNA，由于此构件含有HCV的5、UTR、core、NS5B和3、UTR，具备了 HCV病毒的亚复制子结构，因此，此mRNA可做为复制模版，在HCV RNA依赖的RNA聚合酶(NS5B)的作用下，产生负链的亚复制子RNA。荧光显微镜下可观察到EGFP荧光在肝脏区域的表达。
2.一种斑马鱼反向HCV亚复制子模型，其特征在于通过向斑马鱼受精卵共注射两种HCV基因表达质粒而组成，pIresDsRed-5B可在CMV promoter指导下分别表达 HCV RNApolymerase (NS5B)蛋白和红色荧光蛋白；pRVIresCore-GFP_3N 构件可在CMV promoter指导下分别产生反义的HCV 5、UTR-core和IRES-EGFP转录产物(antisense-transcripts)，以及正链 HCV 3，UTR。当由 pIresDsRed_5B 产生 NS5B(HCVRNA-d印endant RNA polymerase)时，由 pRVIresCore-GFP_3N 转录的反义 RNA 就能够作为复制模版，在RNA依赖的RNA聚合酶作用下复制产生互补的mRNA，并被翻译成EGFP和core蛋白。荧光显微镜下可在同一条斑马鱼幼体肝脏区观察到绿色荧光和红色荧光，直观地证明该亚复制子复制过程的存在。
3.用HCV阳性药物利巴韦林(ribavirin)、候选药物苦参素(Oxymatrine)及其类似物DM-122对斑马鱼亚复制子模型进行验证。反式亚复制子模型中，加入利巴韦林后core的正义RNA明显降低，并呈剂量依赖性，而反义RNA则无明显变化，说明利巴韦林主要抑制core的正义RNA产生，即抑制复制的过程。苦参素和DM-122也都呈剂量依赖性抑制core的正义RNA产生，对core的反义RNA无明显抑制作用。顺式亚复制子模型也得到类似的结果。这些结果初步说明斑马鱼HCV亚复制子模型可以用于抗HCV药物筛选。同时也证明苦参素及其类似物对于HCV的复制具有抑制作用。
全文摘要
本发明涉及人HCV基因的斑马鱼肝脏复制模型，具体涉及利用基因重组和分子生物学方法获得的两种斑马鱼HCV亚复制子模型斑马鱼正向HCV亚复制子模型和斑马鱼反式HCV亚复制子模型。可用以研究HCV基因组复制的分子机制，评估药效和研究治疗策略等。
文档编号A01K67/027GK102578039SQ201110001490
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者丁存宝, 张靖溥, 蒋建东, 赵晔 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所