专利名称：红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法
技术领域：
本发明属于植物栽培技术领域，具体为红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法。
背景技术：
红叶南天竹为小檗科Berberidaceae南天竹属Nandirm的一个栽培新品种，是浙江森禾种业股份有限公司从南天竹栽培群体中选育出来的。红叶南天竹为常绿灌木，植株高约80cm，丛生而少分枝，枝叶浓密，树形紧凑，节间短缩，只有普通南天竹的1/10，10个茎节的长度只有5cm，而普通南天竹一节约8-lOcm ；叶片为二回三小叶复叶，叶片先端钝尖， 基部楔形，全缘，薄革质，长3-5cm，宽1. 5-2cm，总叶柄1. 5-3cm。红叶南天竹喜半荫，强光下也能正常生长，喜温暖气候，肥沃、湿润排水良好的土壤；冬季阳光直射到的叶片全部变红，秋天稍遇冷空气，叶色便由绿色转为鲜红色，持续至翌年初春。红叶南天竹冬季整株叶色呈现鲜艳的中国红，具兴旺发达之寓意；春、夏、秋三季叶色深绿色，和谐舒适。是优良的观叶地被和色块树种，观赏效果醒目。适于华东地区应用；该区域冬季可观赏的露地栽培树种比较少，色彩艳丽的耐寒树种更少，红叶南天竹是理想的新选择，市场开发潜力巨大。红叶南天竹植株本身分支稀少、茎节短缩，可用的扦插茎段十分有限，常规的扦插育苗法繁殖周期长、繁殖率极低，只有组培技术是其快速繁殖的有效途径；但在实践过程中观察到，部分生长正常、无菌的组培苗在继代后，培养基内的苗基部附近总会出现云雾晕开状的污染，并且随培养时间的延长，污染状况逐渐加重，影响到组培苗的增殖、生长与生根，严重时导致植株死亡。这种现象为红叶南天竹本身携带的内生菌所致。由于不能预见内生菌污染的发生时间，并且其最初表现凭借肉眼很难分辨，容易在继代过程中交叉污染，大大限制组培苗的增殖速度，加剧了生产风险。通过调查一些企业与科研院所，证实了内生菌现象的普遍存在。内生菌问题是红叶南天竹工厂化组培快繁体系建立中亟待攻克的技术障碍。查阅目前公开发表的相关文献资料，均未提及此现象。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法的技术方案，该去除方法有效、简便易行，加速了组培苗的增殖速度。所述的红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法，其特征包括以下步骤
1)从红叶南天竹处于增殖状态的组培苗中，挑选在培养基内的基部存在云雾状晕开的内生菌污染的植株，晕开的部分尚未扩展到培养基表面，培养基未明显变色的组培苗；
2)在超净工作台上，用灭菌的镊子将挑选出的组培苗从瓶中取出，放置在无菌的不锈钢盘中，用灭菌刀片将苗先端0. 8-1. 5cm的部分切下，切下的部分不碰触到苗基部，放置在另一个无菌不锈钢盘中剥取茎尖；
3)切下剥好茎尖先端0.2-0. 5cm的部分，迅速接入添加40-60 mg-Γ1苄基青霉素钾盐或1. 2-1. 8 g-r1 50%多菌灵可湿性粉剂的诱导分化培养基中培养；
4)培养55d-65d后，将长于0. 4-0. 6 cm幼嫩枝条切割成0. 5-1. Ocm的茎段转接入增殖培养基，茎段能够正常增殖，形成的幼嫩枝条性状表现正常即可。所述的红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法，其特征在于步骤2)中苗先端切下部分的长度为1. 0-1. 2cm。所述的红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法，其特征在于步骤3)中茎尖先端切下部分的长度为0. 3-0. km，苄基青霉素钾盐的浓度为50-55 mg·!/1，或50%多菌灵可湿性粉剂的浓度为1. 2-1. 4 g·!/1。所述的红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法，其特征在于步骤4)中培养60d后，将长于0. 5-0. 55 cm幼嫩枝条切割成0. 6-0. 8cm的茎段转接入增殖培养基。所述的青霉素G-K为苄基青霉素钾盐。所述的红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法，对感染内生菌组培苗的判断方法简单，实施有效、简便易行，内生菌的去除率达到90%，其组培苗能够正常增殖，形成的幼嫩枝条性状表现正常，增殖系数正常，无玻璃化现象，得到的红叶南天竹品质优良，具有广阔的应用前景。本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，均指重量百分含量。
具体实施例方式现结合本发明的实施例，对本发明作进一步说明。1)从红叶南天竹处于增殖状态的组培苗中，挑选在培养基内的植株基部存在云雾状晕开的内生菌污染，晕开的部分尚未扩展到培养基表面，培养基未明显变色的组培苗；
2)在超净工作台上，用灭菌的镊子将挑选出的组培苗从瓶中取出，放置在无菌的不锈钢盘中，用灭菌刀片将苗先端Icm的部分切下，切下的部分不要碰触到苗基部，放置在另一个无菌不锈钢盘中剥取茎尖；
3)切下剥出茎尖先端0.3cm的部分，迅速接入添加50 mg-Γ1青霉素G-K或1. 5 g-Γ1 50%多菌灵可湿性粉剂的诱导分化培养基中培养；
4)培养过程中可观察到茎尖形成愈伤组织，分化出若干不定芽，培养60d后，将长于 0. 5cm幼嫩枝条切割成0. 5cm的茎段转接入增殖培养基，茎段能够正常增殖，形成的幼嫩枝条性状表现正常，增殖系数正常，无玻璃化现象。在上述去除方法中
所述的诱导分化培养基的配方为MS培养基中添加0. 5-1. Smg-L"1 BA、0. 05-0. ISmg-L"1 IBA, 2-5%蔗糖和0. 5-0. 8%琼脂制成，至培养基pH为5. 8-6. 0止。所述的增殖培养基配方为MS培养基中添加1. 0-2. 0 mg-Γ1 BA、0. 05-0. 15 mg·!/1、 2-5%蔗糖和0. 5-0. 8%琼脂制成，至培养基pH为5. 8-6. 0止。所述的BA为6-苄氨基嘌呤，IBA为吲哚丁酸。步骤2)中苗先端切下部分的长度为0. 8cm、1. 2cm或1. 5cm ；
步骤3)中茎尖先端切下部分的长度为0. 2cm、0. 4cm或0. 5cm,青霉素G-K的浓度为 ^mg'L^.eOmg'r1 或 551^.171 ；50% 多菌灵可湿性粉剂的浓度为 1. 24 g'L^Ul. 6
g'L-\l. Sg-L"1 ；50%多菌灵可湿性粉剂是指多菌灵的含量为50% ；步骤4)中培养时间为55d、62d或65d，切割成茎段的长度为0. 5cm、0. 6cm、1. Ocm ； 其它步骤同上，也能取得本发明所述的有益效果。以下结合相应的试验数据对本发明作进一步说明。试验1.将含有内生菌组培苗的茎尖切下接种至添加不同浓度的青霉素G-K(苄基
青霉素钾盐)诱导培养基上，并设立对照，结果见表1。
表1 添加青霉素G-K对内生菌的影响表
权利要求
1.红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法，其特征包括以下步骤1)从红叶南天竹处于增殖状态的组培苗中，挑选在培养基内的基部存在云雾状晕开的内生菌污染的植株，晕开的部分尚未扩展到培养基表面，培养基未明显变色的组培苗；2)在超净工作台上，用灭菌的镊子将挑选出的组培苗从瓶中取出，放置在无菌的不锈钢盘中，用灭菌刀片将苗先端0. 8-1. 5cm的部分切下，切下的部分不碰触到苗基部，放置在另一个无菌不锈钢盘中剥取茎尖；3)切下剥好茎尖先端0.2-0. 5cm的部分，迅速接入添加40-60 mg-Γ1苄基青霉素钾盐或1. 2-1. 8 g-r1 50%多菌灵可湿性粉剂的诱导分化培养基中培养；4)培养55d-65d后，将长于0.4-0. 6 cm幼嫩枝条切割成0. 5-1. Ocm的茎段转接入增殖培养基，茎段能够正常增殖，形成的幼嫩枝条性状表现正常即可。
2.如权利要求1所述的红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法，其特征在于步骤2)中苗先端切下部分的长度为1. 0-1. 2cm。
3.如权利要求1所述的红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法，其特征在于步骤3)中茎尖先端切下部分的长度为0. 3-0.如m，苄基青霉素钾盐的浓度为50-55 mg-Γ1, 或50%多菌灵可湿性粉剂的浓度为1. 2-1. 4 g·!/1。
4.如权利要求1所述的红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法，其特征在于步骤4)中培养60d后，将长于0. 5-0. 55 cm幼嫩枝条切割成0. 6-0. 8cm的茎段转接入增殖培养基。
全文摘要
红叶南天竹组织培养体系中内生菌的去除方法，属于植物栽培技术领域。其特征在于包括以下步骤1)从红叶南天竹处于增殖状态的组培苗中，挑选出培养基内的苗基部存在内生菌感染的组培苗；2)在超净工作台上，将存在内生菌的组培苗取出，切下先端，剥取茎尖；3)将剥取的茎尖接种至添加杀菌物质的诱导分化培养基上；4)培养一段时间后，将茎尖分化出的不定芽切下，转接入增殖培养基中培养，组培苗表现正常，无内生菌污染的现象即可。上述去除方法，内生菌的去除率达到90%，得到的红叶南天竹品质优良，具有广阔的应用前景。
文档编号A01H4/00GK102172223SQ20111007221
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者杜三峰, 王越, 范文锋, 邵春荣, 郑勇平 申请人:浙江森禾种业股份有限公司