专利名称：一种抗除草剂基因表达盒、带有该表达盒的表达载体及其在培育抗除草剂植物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种能增强幼芽抗除草剂特性的抗除草剂基因表达盒、带有该表达盒的表达载体及其在培育抗除草剂植物中的应用。
背景技术：
目前最常用的除草剂是草甘膦，它是一种非选择性除草剂，通常使用量在
2.0-5. Okg a. i. /hm2,1971年由Monsanto公司开发成功，是全球销售最好的除草剂品种，其作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。 1996年美国最先开始种植抗草甘膦转基因大豆，2008年，全球抗除草剂转基因作物种植面积7900万公顷，占全部转基因作物播种总面积的69%，其中50%以上是抗草甘膦除草剂品种。EPSPS成为目前应用最广泛的性状基因。在使用草甘膦的过程中发现不同的杂草对除草剂的抗性是不同的，喷洒除草剂的量不足时一些野草可以存活下来，但除草剂喷洒剂量过大也会在一定程度上影响农作物的生产，甚至造成部分转基因抗除草剂农作物死亡。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗除草剂基因表达盒，该抗除草剂基因表达盒可在植物的芽部位特异表达。所述表达盒由leafy基因启动子、抗除草剂基因和终止子组成。所述leafy基因启动子的碱基序列如SEQ ID NO 1所示。所述抗除草剂基因为EPSPS基因，其碱基序列如SEQ ID NO 2所示。所述终止子为T-nos。本发明的第二个目的在于提供一种带有抗除草剂基因表达盒的表达载体，所述表达盒由leafy基因启动子、抗除草剂基因和终止子组成。所述载体进一步还包括一个抗除草剂基因表达盒，所述表达盒由35S启动子、抗除草剂基因和终止子组成。所述leafy基因启动子的碱基序列如SEQ ID NO 1所示。所述抗除草剂基因为EPSPS基因，其碱基序列如SEQ ID NO 2所示。所述终止子为T-nos。本发明的第三个目的在于提供抗除草剂基因表达盒在培育抗除草剂植物中的应用。本发明的第四个目的在于提供含有抗除草剂基因表达盒的表达载体在培育抗除草剂植物中的应用。本发明的技术路线为
I、利用分子生物学方法根据植物偏爱密码子，人工合成EPSPS基因，命名为cp4EPSPS基因；利用分子生物学方法克隆烟草leafy基因启动子；2、构建幼芽特异表达cp4EPSPS基因表达盒，该表达盒由leafy基因启动子、cp4EPSPS基因和T-nos终止子组成；3、构建包含两个cp4EPSPS基因表达盒的表达载体p3300-leafy-CP4EPSPS-35s_CP4EPSPS，其中一个表达盒由leafy基因启动子、cp4EPSPS基因和T_nos终止子组成，另一个表达盒由35S启动子、cp4EPSPS基因和T_nos终止子组成；4、将表达载体p3300-leafy-CP4EPSPS-35s_CP4EPSPS用根癌农杆菌转化烟草，获得芽特异表达转cp4EPSPS基因烟草，喷洒草甘膦实验验证转芽特异表达cp4EPSPS基因烟草受伤害程度显著降低。本发明构建了含有芽特异表达cp4EPSPS基因表达盒的表达载体，实验证明转基因植物在幼芽部位特异表达cp4EPSPS基因，在喷洒草甘膦时，可显著降低转基因植物受伤害的程度。扩大了转基因植物与杂草之间对除草剂的敏感程度，可以使转基因植物在使用除草剂时受伤害的程度降至最低，提高农作物生产能力。
图I是芽特异表达抗除草剂基因表达盒图谱；图2 是表达载体 p3300-leafy-CP4EPSPS-35s_CP4EPSPS 质粒图谱；图3是转基因烟草PCR检测电泳图，M =Marker ;1_8 :为转基因植株；P :为阳性对照；N:为野生型植株负对照。图4A是转基因烟草喷洒草甘膦一周后结果图，左非转基因烟草，中35S-cp4EPSPS 转化的烟草；右，35S-Cp4_EPSPS+leafy-Cp4EPSPS 转化的烟草。图4B是转基因烟草喷洒草甘膦三周后结果图，左非转基因烟草，中35S-cp4EPSPS 转化的烟草；右，35S-Cp4_EPSPS+leafy-Cp4EPSPS 转化的烟草。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。实施例I构建幼芽特异表达cp4EPSPS基因表达盒利用分子生物学方法根据植物偏爱密码子，人工合成EPSPS基因，命名为cp4EPSPS基因，其碱基序列如SEQ ID NO 2所示；利用分子生物学方法克隆烟草leafy基因启动子，其碱基序列如SEQ ID NO 2所示；构建幼芽特异表达cp4EPSPS基因表达盒，其结构如图I所示，该表达盒由leafy基因启动子、cp4EPSPS基因和T-nos终止子组成。实施例2构建包含两个cp4EPSPS基因表达盒的表达载体请参阅图2，表达载体 p3300-leafy-CP4EPSPS-35s_CP4EPSPS，包含两个 cp4EPSPS基因表达盒，其中一个表达盒由leafy基因启动子、cp4EPSPS基因和T_nos终止子组成，另一个表达盒由35S启动子、cp4EPSPS基因和T_nos终止子组成，该表达载体在市售p3300质粒的基础上进行构建。
实施例3利用农杆菌介导的转化法获得转幼芽特异表达cp4EPSPS基因烟草将植物表达载体p3300-leafy-CP4EPSPS-35s_CP4EPSPS 转化到农杆菌 LBA 4404，然后通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草。农杆菌侵染后的烟草愈伤，分化得到幼苗，经过PPT初筛，得到PPT抗性的植株，部分植株移栽温室，40天后提取基因组DNA检测，以基因组DNA为模板，PCR检测结果见图3，为部分转CP4EPSPS基因植株的检测电泳图。实施例4转幼芽特异表达cp4EPSPS基因烟草生物学检测对非转基因烟草，35S_cp4EPSPS转化的烟草和 35S_Cp4-EPSPS+leafy_Cp4EPSPS转化的烟草，同时喷洒草甘膦，观察其变化，结果参见图4A和图4B。图4A和图4B分别是喷洒草甘膦一周后和三周后的结果，左为非转基因烟草，中为 35S-cp4EPSPS转化的烟草，右为35S_Cp4_EPSPS+lefy-Cp4EPSPS转化的烟草，可以很明显的看出35S-Cp4-EPSPS+leafy-Cp4EPSPS转化的烟草受伤害程度最轻。扩大了转基因植物 与杂草之间对除草剂的敏感程度。
权利要求
1.一种抗除草剂基因表达盒，其特征在于所述表达盒由leafy基因启动子、抗除草剂基因和终止子组成。
2.根据权利要求I所述的一种抗除草剂基因表达盒，其特征在于所述leafy基因启动子的碱基序列如SEQ ID NO 1所示。
3.根据权利要求I所述的一种抗除草剂基因表达盒，其特征在于所述抗除草剂基因为EPSPS基因，其碱基序列如SEQ ID N0:2所示。
4.根据权利要求I所述的一种抗除草剂基因表达盒，其特征在于所述终止子为T-noSo
5.一种带有抗除草剂基因表达盒的表达载体，其特征在于所述表达盒由leafy基因启动子、抗除草剂基因和终止子组成。
6.根据权利要求5所述的一种带有抗除草剂基因表达盒的表达载体，其特征在于所述载体进一步还包括一个抗除草剂基因表达盒，所述表达盒由35S启动子、抗除草剂基因和终止子组成。
7.根据权利要求5或6所述的一种带有抗除草剂基因表达盒的表达载体，其特征在于所述leafy基因启动子的碱基序列如SEQ ID NO 1所示。
8.根据权利要求5或6所述的一种带有抗除草剂基因表达盒的表达载体，其特征在于所述抗除草剂基因为EPSPS基因，其碱基序列如SEQ ID N0:2所示。
9.根据权利要求5或6所述的一种带有抗除草剂基因表达盒的表达载体，其特征在于所述终止子为T-nos。
10.权利要求1-4中任意一项所述的抗除草剂基因表达盒或权利要求5-9中任意一项所述的表达载体在培育抗除草剂植物中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，提供了一种抗除草剂基因表达盒，该抗除草剂基因表达盒可在植物的芽部位特异表达，由leafy基因启动子、抗除草剂基因和终止子组成。转基因植物在幼芽部位特异表达cp4EPSPS基因，在喷洒草甘膦时，可显著降低转基因植物受伤害的程度。扩大了转基因植物与杂草之间对除草剂的敏感程度，可以使转基因植物在使用除草剂时受伤害的程度降至最低，提高农作物生产能力。
文档编号A01H5/00GK102719455SQ201110076618
公开日2012年10月10日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者徐志超, 杜娟, 林忠平, 胡鸢雷, 连肖华 申请人:林忠平