专利名称：一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法
技术领域：
本发明涉及发酵工程领域，尤其涉及一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法。
背景技术：
樟芝(Antrodia cinnamomea)又称牛樟芝、樟菇、樟内菇、血灵芝等，属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多菌科、薄孔菌属珍稀药用真菌。仅生长在中国台湾山区海拔 450-2000米之间的牛樟树腐朽的空心内壁，具有强烈的黄樟气味。樟芝含有多种生理活性物质，如多糖类、三萜类化合物、超氧化物歧化酶、腺苷、小分子蛋白质(含免疫蛋白)、维生素、固醇类、木质素、不饱和长链脂肪酸、麦角留醇、微量元素锗等、凝集素、氨基酸、薄孔菌酸等等，其中多糖和三萜化合物是其主要的生理活性物质。樟芝具有免疫调节，抗癌，解毒消肿，镇静安神，活血化瘀和温和消积等功能。台湾民间还用于治疗腹痛，癌症，肝炎等。樟芝自然生长条件苛刻，生长缓慢，生长期也仅限于每年的六月至十月，自然产量稀少。此外不法商人的滥采滥伐，导致野生樟芝资源严重短缺和价格的一路飙升。为弥补野生樟芝资源的匮乏，保护森林资源，亟需研究如何以人工方式栽培樟芝进而大量生产。目前，樟芝菌丝体的培养方法包括椴木培养、固体培养和液体培养等。椴木培养和固体培养都存在培养周期长，易污染，不易获得樟芝子实体，获得的樟芝难分离，成本高，不易大规模生产等问题。采用生物技术方法利用液体发酵培养樟芝菌丝体，并利用菌丝体和发酵液提取生物活性成分是目前最经济、最环保的方法。为解决上述问题，亟待提供一种适合大规模产业化生产而又能保证樟芝菌丝体生物活性成分含量的液体发酵培养方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，该方法可快速、大量生产樟芝菌丝体。为达到上述目的，本发明的技术方案为一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，包括以下步骤1)菌种的斜面培养将菌种接入斜面培养基中培养，培养温度22-33°C，培养1_4 周，得到斜面菌种；2)种子菌种培养，将步骤1)斜面培养得到的菌种进一步进行种子培养，包括液体摇瓶培养、液体摇瓶再扩大培养、一级种子菌种培养和二级种子菌种培养，得到二级种子菌种；3)发酵培养，将步骤2)得到的二级种子菌种转入到装有发酵培养基的发酵罐中进行深层液态发酵，得到樟芝菌丝体。所述步骤2)具体为a)将步骤1)得到的斜面菌种转接到摇瓶培养基中，22-33°C摇瓶培养，转速 80-180rpm/min，培养3_9天，得到第一摇瓶菌种；b)将步骤a)得到的摇瓶菌种转接到装有种子培养基的摇瓶中进行再扩大培养，接种量为8-12 % ；培养温度22-33°C，转速80-180rpm/min，培养3_9天，得到第二摇瓶菌种；c)将步骤b)得到的摇瓶菌种转接到装有种子培养基的一级种子罐中进行一级种子培养，接种量为8-12 %，培养温度22-33°C，罐压0. 01-0. 05Mpa,搅拌速率120_220rpm/ min，通气量1 0.2-2.0，培养3-9天，得到一级种子菌种;d)将步骤C)得到的一级种子菌种转接到装有种子培养基的二级种子罐中进行二级种子培养，接种量为8-12 %，培养温度22-33 °C，罐压0. 01-0. 05Mpa,搅拌速率 120-220rpm/min，通气量1 0. 2-2. 0，培养3-9天，得到二级种子菌种。所述摇瓶中培养基体积与摇瓶容积的比例为2 5。所述一级种子罐的容积为10-500L，在所述一级种子罐中装有的发酵培养基相应为5L-400L ；所述二级种子罐的容积为100-5000L，在所述二级种子罐中装有的发酵培养基相应为 50L-4000L。所述步骤3)具体为将步骤2)得到的二级种子菌种转入到装有发酵培养基的发酵罐中进行深层液态发酵，接种量为8-12 %，培养温度22-33°C，罐压0. 01-0. 05Mpa,搅拌速率120-220rpm/min，通气量1 0. 2-2. 0,发酵3_12天，得到樟芝菌丝体。所述斜面培养基的配方为-4%葡萄糖，-4%麦芽浸膏，0.01% -0.2%蛋白胨，琼脂 -4%，以 g/IOOml 计，pH3. 0-7. 0。所述摇瓶培养基的配方为-4%葡萄糖，-4%麦芽浸膏，0.01% -0.2%蛋白胨，以 g/100ml 计，pH3. 0-7. 0。所述种子培养基的配方为-7%麸皮汁，-7%玉米淀粉，0.01% -0.2%硫酸镁，以 g/100ml 计，ρΗ2· 0-7. 0。所述发酵培养基的配方为-7%麸皮汁，-7%玉米淀粉，0.01% -0.2%硫酸镁，以 g/100ml 计，pH2. 0-7. 0。发酵罐的容积为1000-50000L，在所述发酵罐中装有的发酵培养基相应为 500L-40000L。本发明所述深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，具有如下优点1)周期短，需16-52天，最短仅需16天，与固体培养相比，培养周期大大缩短；2)产量高，得率是2%，以40吨发酵培养基计，一次即可生产干重为800公斤的菌丝体；3)经测试，菌丝体中多糖含量在5% _8%，三萜类物质含量在5%左右，与固体相比，生物活性物质含量相当；4)工艺简单，过程可控；5)成本低；本发明所述方法不同于一般实验室制备方法，适于工业化大规模生产高质量的樟芝菌丝体。
具体实施例方式实施例1 一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法培养基
斜面培养基的配方为-4%葡萄糖，-4%麦芽浸膏，0. 01%-0. 2%蛋白胨， 琼月旨 -4%，以 g/100ml 计，pH3. 0-7. O。优选配方为2%葡萄糖，2%麦芽浸膏，0. 蛋白胨，琼脂2%，以g/100ml计， ρΗ5· O。摇瓶培养基的配方为-4%葡萄糖，-4%麦芽浸膏，0. 01%-0. 2%蛋白胨， 以 g/100ml 计，pH3. 0-7. O。优选配方为2%葡萄糖，2%麦芽浸膏，0.1%蛋白胨，以g/ IOOml计，pH5. O。种子培养基的配方为-7%麸皮汁，-7%玉米淀粉，0.01%-0.2%硫酸镁， 以 g/100ml 计，pH2. 0-7. O。优选配方为4%麸皮汁，4%玉米淀粉，0. 硫酸镁，以g/100ml计，pH5. O。发酵培养基的配方为-7%麸皮汁，-7%玉米淀粉，0.01%-0.2%硫酸镁， 以 g/100ml 计，pH2. 0-7. O。优选配方为4%麸皮汁，4%玉米淀粉，0. 硫酸镁，以g/100ml计，pH5. O。本实施例全部培养基采用优选配方。本实施例采用樟芝菌菌种与中国发明专利01115869. 7所述CGMCCNo. 0575相同。具体包括以下步骤1)菌种的斜面培养将菌种接入斜面培养基中培养，培养温度22-33°C，培养1周， 得到斜面菌种；2)种子菌种培养，将步骤1)斜面培养得到的菌种进一步进行种子培养，包括液体摇瓶培养、液体摇瓶再扩大培养、一级种子菌种培养和二级种子菌种培养，得到二级种子菌种；所述步骤2)具体为a)将步骤1)得到的斜面菌种转接到摇瓶培养基中，摇瓶培养基与摇瓶容积的比例为2:5，26°C摇瓶培养，转速120rpm/min，培养5天，得到第一摇瓶菌种；b)将步骤a)得到的摇瓶菌种转接到装有种子培养基的摇瓶中进行再扩大培养， 接种量为10% ；种子培养基与摇瓶容积的比例为2 5;培养温度26°C，转速120rpm/min， 培养5天，得到第二摇瓶菌种；c)将步骤b)得到的摇瓶菌种转接到装有种子培养基的一级种子罐中进行一级种子培养，接种量为10%，培养温度26°C，罐压0.03Mpa，搅拌速率170rpm/min，通气量1 1， 培养5天，得到一级种子菌种；d)将步骤C)得到的一级种子菌种转接到装有种子培养基的二级种子罐中进行二级种子培养，接种量为10%，培养温度26°C，罐压0. 03Mpa，搅拌速率170rpm/min，通气量 1 1，培养5天，得到二级种子菌种；所述一级种子罐的容积为500L，在所述一级种子罐中装有的发酵培养基相应为400L ；所述二级种子罐的容积为5000L，在所述二级种子罐中装有的发酵培养基相应为 4000L。3)发酵培养，将步骤2)得到的二级种子菌种转入到装有发酵培养基的发酵罐中进行深层液态发酵，接种量为10%，发酵罐的容积为50000L，在所述发酵罐中装有的发酵培养基相应为40000L。
培养温度26°C，罐压0.03Mpa，搅拌速率170rpm/min，通气量1 1，发酵6天，得
到樟芝菌丝体。实施例1所述深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，1)周期短，需16-52天，最短仅需33天，与固体培养相比，培养周期大大缩短；2)产量高，得率是2%，以40吨发酵培养基计，一次即可生产干重为800公斤的菌丝体；3)经测试，菌丝体中多糖含量在5% _8%，三萜类物质含量在5%左右，与固体相比，生物活性物质含量相当；4)工艺简单，过程可控；5)成本低；本发明所述方法不同于一般实验室制备方法，适于工业化大规模生产高质量的樟芝菌丝体。
权利要求
1.一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，包括以下步骤1)菌种的斜面培养将菌种接入斜面培养基中培养，培养温度22-33°C，培养1-4周，得到斜面菌种；2)种子菌种培养，将步骤1)斜面培养得到的菌种进一步进行种子培养，包括液体摇瓶培养、液体摇瓶再扩大培养、一级种子菌种培养和二级种子菌种培养，得到二级种子菌种；3)发酵培养，将步骤2)得到的二级种子菌种转入到装有发酵培养基的发酵罐中进行深层液态发酵，得到樟芝菌丝体。
2.根据权利要求1所述的一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，其特征在于，所述步骤2)具体为a)将步骤1)得到的斜面菌种转接到摇瓶培养基中，22-33°C摇瓶培养，转速 80-180rpm/min，培养3_9天，得到第一摇瓶菌种；b)将步骤a)得到的摇瓶菌种转接到装有种子培养基的摇瓶中进行再扩大培养，接种量为8-12% ；培养温度22-33°C，转速80-180rpm/min，培养3_9天，得到第二摇瓶菌种；c)将步骤b)得到的摇瓶菌种转接到装有种子培养基的一级种子罐中进行一级种子培养，接种量为8-12%，培养温度22-33°C，罐压0. 01-0. 05Mpa,搅拌速率120-220rpm/min，通气量1 0.2-2.0，培养3-9天，得到一级种子菌种；d)将步骤c)得到的一级种子菌种转接到装有种子培养基的二级种子罐中进行二级种子培养，接种量为8-12 %，培养温度22-33°C，罐压0. 01-0. 05Mpa,搅拌速率120_220rpm/ min，通气量1 0.2-2.0，培养3-9天，得到二级种子菌种。
3.根据权利要求2所述的一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，其特征在于，所述摇瓶中培养基体积与摇瓶容积的比例为2 5。
4.根据权利要求2所述的一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，其特征在于，所述一级种子罐的容积为10-500L，在所述一级种子罐中装有的发酵培养基相应为5L-400L ； 所述二级种子罐的容积为100-5000L，在所述二级种子罐中装有的发酵培养基相应为 50L-4000L。
5.根据权利要求1所述的一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，其特征在于， 所述步骤3)具体为将步骤2)得到的二级种子菌种转入到装有发酵培养基的发酵罐中进行深层液态发酵，接种量为8-12%，培养温度22-33 °C，罐压0. 01-0. 05Mpa,搅拌速率 120-220rpm/min,通气量1 0. 2-2. 0，发酵3-12天，得到樟芝菌丝体。
6.根据权利要求1所述的一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，其特征在于，所述斜面培养基的配方为葡萄糖，-4%麦芽浸膏，0.01% -0.2%蛋白胨，琼脂 1% -4%，以 g/100ml 计，ρΗ3· 0-7. 0。
7.根据权利要求2或3所述的一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，其特征在于， 所述摇瓶培养基的配方为葡萄糖，-4%麦芽浸膏，0.01% -0.2%蛋白胨，以 g/100ml 计，ρΗ3· 0-7. 0)。
8.根据权利要求2所述的一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，其特征在于， 所述种子培养基的配方为麸皮汁，-7%玉米淀粉，0.01% -0.2%硫酸镁，以 g/100ml 计，pH2. 0-7. 0。
9.根据权利要求1或5所述的一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，其特征在于， 所述发酵培养基的配方为_7%麸皮汁，-7%玉米淀粉，0.01% -0.2%硫酸镁，以 g/100ml 计，pH2. 0-7. 0。
10.根据权利要求5所述的一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，其特征在于发酵罐的容积为1000-50000L，在所述发酵罐中装有的发酵培养基相应为500L-40000L。
全文摘要
本发明涉及发酵工程领域，尤其涉及一种深层液态发酵生产樟芝菌丝体的方法，包括以下步骤1)菌种的斜面培养；2)种子菌种培养，将步骤1)斜面培养得到的菌种进一步进行种子培养，包括液体摇瓶培养、液体摇瓶再扩大培养、一级种子菌种培养和二级种子菌种培养，得到二级种子菌种；3)发酵培养，将步骤2)得到的二级种子菌种转入到装有发酵培养基的发酵罐中进行深层液态发酵，得到樟芝菌丝体。本发明所述方法不同于一般实验室制备方法，周期短，产量高，生物活性物质含量高，工艺简单，过程可控，成本低；适于工业化大规模生产高质量的樟芝菌丝体。
文档编号C05G3/00GK102217487SQ20111008096
公开日2011年10月19日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者何开泽, 李静, 贺元川, 赵宗杰 申请人:李静, 赵宗杰