专利名称：一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法
技术领域：
本发明属于转基因植物的培育技术领域，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。
背景技术：
水稻条纹叶枯病是由水稻条纹病毒引起的病毒性病害，由灰飞虱传播。近几年，水稻条纹叶枯病在我省及周边地区的水稻上连年猖獗，给江苏省的水稻生产和农民的经济利益造成了灾难性影响。该病最早于1897年在日本的关东发现，后在朝鲜、乌克兰、中国等地均有发生。目前它已分布于我国的16个省(市)，给我国的水稻生产造成了严重损失。该病于上世纪60年代前后始见于江苏省，70年代在苏南、苏中少数地区曾一度流行，以后几乎是销声匿迹。但自80年代末期以来，水稻条纹叶枯病在我省的发生有所加重。进入21世纪，该病的发生度和发生范围逐年扩大，已成为长江淮河流域稻区水稻生产上最主要的病害，缺乏抗病品种也是水稻条纹叶枯病暴发的主要原因之一。对待灰飞虱及其传播的条纹叶枯病，一般贯彻“预防为主，综合治理”的植保方针， 采用治虫防病结合生态调控等一系列措施，国内外抗病育种的经验表明，选育抗病品种是控制水稻病害最经济有效的方法。选育抗病品种首先要筛选或创制抗源，以往鉴定出的高抗品种多具籼稻血缘，与现有品种杂交后后代品系很难育成优质米品种。到目前为止，粳稻中还未找到1个对条纹叶枯病高度免疫的基因。也就是说，由于品种的限制，现有的抗源材料较难作为优良亲本组配杂交组合用于后代选育。RNA干扰(RNAi，RNA interference)是指在进化过程中高度保守的、有双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制。由dsRNA介导的干扰现象作为细胞的一种防御机制可针对性地降解细胞内与之具有同源性的核酸(如病毒的核酸)，达到对病毒的抵抗，同时还调节细胞内编码基因的表达，为利用RNA介导的病毒抗性进行抗病毒基因工程的研究奠定了基础。目前，RNAi已经广泛用于基因的功能分析、疾病治疗和抗病虫抗源创制。目前还未见利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的报道。
发明内容
本发明的主要目的就是针对上述水稻条纹叶枯病的研究现状，提供一种利用RNAi 技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下 一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法
以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列作为抗水稻条纹叶枯病的目的基因序列，分别以下述两对引物F1/R1和F2/R2进行PCR扩增，扩增得到CP和SP基因片段序列，设计上下游引物5’端引入限制性内切酶位点//和损ο I，酶切位点外侧添加2个保护碱基以保证酶切完全，两对引物分别如下Fl: CGCTCGAGGTTCAGTCTAGTCATCTGCAC； (SEQ ID NO. 3) Rl: CGAGATCTTAGAATGGGTACCAACAAGCC； (SEQ ID NO. 4) F2: CGCTCGAGAGAATCGAAGATGCAAGAGGTA； (SEQ ID NO. 5) R2: CGAGATCTGCTATGTTTTGTGTAGAAGAGG； (SEQ ID NO. 6)
将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pUCCRNAi，于1. 0 %琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带， 连接克隆入pUCCRNAi载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体pUCCRNAi-CP2和 pUCCRNAi-SP2 ；
用限制性内切酶分别酶切中间载体pUCCRNAi-CP和pUCCRNAi-SP，以及植物表达载体 pCam23A,电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pCam23A载体中，即为构建成功的植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A_SP ；
将植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP，利用农杆菌介导法分别转入优良水稻品种的胚性愈伤组织，通过G-418筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。本发明所说的方法，具体步骤如下
(1)水稻条纹叶枯病毒CP和SP基因RNAi载体的构建
1)分别以下述F1/R1和F2/R2为引物，水稻条纹叶枯病病毒总RNA为模板，进行PCR 扩增获得序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示的述的CP和SP基因序列，再将CP和SP 基因序列分别克隆到PMD18-T，得pMD-CP和pMD_SP ；
2)构建含反向重复序列的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi_SP2
①构建含正向序列的中间载体pUCCRNAi-CPl和pUCCRNAi_SPl
将pMD-CP、pMD-SP和pUCCRNAi绘Bgl II和炀ο I酶切获得的片段进行连接，分别得到 pUCCRNAi-CPl 和 pUCCRNAi-SPl ；
②构建含反向重复序列的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi_SP2
将①中得到的含正向序列的中间载体pUCCRNAi-CPl和pUCCRNAi-SPl用限制性内切酶酶BamH I和Sal I进行酶切，回收酶切的目的条带，将其与Bgl 11和Xho I酶切pMD_CP 和pMD-SP获得的CP和SP基因序列进行连接，得到含反向重复目的片段的中间载体，命名为 pUCCRNAi-CP2 和 pUCCRNAi_SP2 ；
③构建含反向重复序列的表达载体pCam23A-CP和pCam23A_SP
Pst I单酶切含反向重复目的片段的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi_SP2，Pst I 单酶切植物表达载体pCam23A，分别回收反向重复序列和植物表达载体片段，T4 DNA连接酶连接，得到的阳性克隆分别为pCam23A-CP和pCam23A-SP ；
(2)将植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP，利用农杆菌介导法分别转入水稻胚性愈伤组织，通过G-418筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。经过多代自交、分子检测和抗性鉴定，表明所获得的转基因株系对水稻条纹叶枯病具有较好抗性。与现有技术相比，本发明的有益效果是
本发明方法利用RNAi技术，可培育出具有优良抗条纹叶枯病的转基因水稻株系，从根本上解决水稻条纹叶枯病问题，显著增强水稻对条纹叶枯病的抗性，提高其产量和经济价值。
图1为中间载体pUCCRNAi，其多克隆位点区插入了一段内含子。图2为植物表达载体pCam23A。MCS为多克隆位点区，酶切位点依次为Sma I,Xba I, Sal I，和彻 I。图3为PCR扩增目的基因CP电泳检测结果图1，分子量标记；2，未感病植株； 3-6，感病水稻植株。图4为PCR扩增目的基因SP电泳检测结果图1，分子量标记；2，未感病植株； 3-7，感病水稻植株。图5为含CP正向序列中间载体PUCCRNAi-CPl用Bgl II和Xho I双酶切鉴定电泳检测结果图1，分子量标记；2-3，pUCCRNAi-CPl用勒·/ //和炀ο I双酶切。图6为含SP正向序列中间载体PUCCRNAi-SPl用Bgl II和Xho I双酶切鉴定电泳检测结果图1_3，pUCCRNAi-SPl用勒·/ //和炀ο I双酶切；4，分子量标记。图7为含CP反向重复序列中间载体pUCCRNAi_CP2用Ai I单酶切鉴定电泳检测结果图1，分子量标记；2-6，pUCCRNAi-CP2用Ai I单酶切。图8为含SP反向重复序列中间载体pUCCRNAi_SP2用Ai I单酶切鉴定电泳检测结果图1，分子量标记；2-5，pUCCRNAi-SP2用Ai I单酶切。图9为含CP反向重复序列表达载体pCam23A-CP用Ai I单酶切鉴定电泳检测结果图1，分子量标记；2-5, pCam23A-CP用/ ^ I单酶切。图10为含SP反向重复序列表达载体ppCam23A-SP用I单酶切鉴定电泳检测结果图1，分子量标记；2-5，pCam23A-SP用Ai I单酶切。图11为实施例2中，部分转化植株CP基因检测结果1，阴性对照；2，阳性对照； 3-7，转基因植株。图12为实施例2中，部分转化植株SP基因检测结果1，阴性对照；2，阳性对照； 3-7，转基因植株。图13为实施例4中，半定量RT-PCR检测接毒鉴定的转基因植株及对照中CP基因表达量1，未接种植株；2，接种对照；3-8，分别为TGl，TG2，TG3，TG13，TG14和TG15转基因植株。图14为实施例4中，半定量RT-PCR检测接毒鉴定的转基因植株及对照中SP基因表达量1，未接种植株；2，接种对照；3-8，分别为TG5，TG7，TG8，TG18，TG19和TG20转基因植株。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。实施例1
本实施例利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法，包括下述主要步骤(1)、水稻条纹叶枯病毒CP和SP基因RNAi载体的构建 1)利用PCR扩增获得如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的目的基因序列根据NCBI数据库中的水稻条纹叶枯病毒基因组序列信息，选取条纹病毒CP基因980bp 和SP基因548bp碱基序列作为水稻抗条纹叶枯病的目的基因序列，分别命名为CP-980和 SP-548，其核苷酸序列从左至右从5，端至3，端碱基组成分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述。具体步骤如下
①病毒总RNA的提取
选取水稻条纹叶枯病病株的叶片约250mg剪成碎片放入研钵中，在液氮冷却条件下研磨至细粉，转入1. 5ml离心管，加入0. 5ml预冷的Trizol提取液震荡摇勻，5 min后加入 0. 5ml氯仿，再剧烈震荡离心管5min，在8°C，12，OOOg条件下，离心15min，离心后的溶液分为两层，将上层液体转移入1. 5ml的干净离心管，加入0. 5ml异丙醇摇勻，沉淀lOmin，然后在8°C, 12, OOOg条件下离心IOmin0② 利用PCR分别扩增CP和SP基因片段扩增体系为，每50 μ L中含有
权利要求
1.一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法，其特征在于分别以下述两对引物F1/R1和F2/R2进行PCR扩增，从水稻基因中扩增得到CP和 SP基因片段序列，CP和SP基因序列分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示Fl: CGCTCGAGGTTCAGTCTAGTCATCTGCAC；Rl CGAGATCTTAGAATGGGTACCAACAAGCC；F2: CGCTCGAGAGAATCGAAGATGCAAGAGGTA ；R2: CGAGATCTGCTATGTTTTGTGTAGAAGAGG；将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pUCCRNAi，于1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入PUCCRNAi载体中，形成含反向重复目的片段的中间载体pUCCRNAi-CP2和 pUCCRNAi-SP2 ；用限制性内切酶分别酶切中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi_SP2，以及植物表达载体pCam23A，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pCam23A载体中， 即为构建成功的植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A_SP ；将植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP，利用农杆菌介导法分别转入水稻的胚性愈伤组织，通过G-418筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。
2.根据权利要求1所述的利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法，其特征在于其步骤如下(1)水稻条纹叶枯病毒CP和SP基因RNAi载体的构建1)分别以下述F1/R1和F2/R2为引物，水稻条纹叶枯病病毒总RNA为模板，进行PCR 扩增获得序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的述的CP和SP基因序列，再将CP和SP 基因序列分别克隆到PMD18-T，得pMD-CP和pMD_SP ；2)构建含反向重复序列的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi_SP2①构建含正向序列的中间载体pUCCRNAi-CPl和pUCCRNAi_SPl将pMD-CP、pMD-SP和pUCCRNAi绘Bgl II和炀ο I酶切获得的片段进行连接，分别得到 pUCCRNAi-CPl 和 pUCCRNAi-SPl ；②构建含反向重复序列的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi_SP2将①中得到的含正向序列的中间载体pUCCRNAi-CPl和pUCCRNAi-SPl用限制性内切酶酶1和5 / I进行酶切，回收酶切的目的条带，将其与勒·/II和损ο I酶切pMD-CP和 PMD-SP获得的CP和SP基因序列进行连接，得到含反向重复目的片段的中间载体，命名为 pUCCRNAi-CP2 和 pUCCRNAi_SP2 ；③构建含反向重复序列的表达载体pCam23A-CP和pCam23A_SPPst I单酶切含反向重复目的片段的中间载体pUCCRNAi-CP2和PUCCRNAi-SPZA1Si I单酶切植物表达载体pCam23A，分别回收反向重复序列和植物表达载体片段，T4 DNA连接酶连接，得到的阳性克隆分别为pCam23A-CP和pCam23A-SP ；(2)将植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP，利用农杆菌介导法分别转入水稻胚性愈伤组织，通过G-418筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。
全文摘要
本发明涉及一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法，适用于水稻防治水稻条纹叶枯病，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。本发明通过构建含有水稻条纹叶枯病病毒CP和SP基因的RNAi表达载体，将植物表达载体利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过G-418抗性基因筛选、分化、生根壮苗，获得再生转基因株系。该方法利用RNAi技术，可培育出优良的抗条纹叶枯病的水稻转基因株系，从根本上解决水稻条纹叶枯病问题，显著增强水稻抗性，提高其经济价值，为绿色农业提供有力的技术支持。
文档编号A01H5/00GK102206674SQ20111008722
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月8日 优先权日2011年4月8日
发明者周勇, 梁国华, 钟环 申请人:扬州大学