来自假黑盘菌的抗微生物多肽的制作方法

专利名称：来自假黑盘菌的抗微生物多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗微生物活性的多肽和具有编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也涉及核酸构建体、载体和包含该核酸构建体的宿主细胞以及生产和使用该多肽的方法。
背景技术：
本发明的目的是提供具有抗微生物活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。发明概述本发明第一个方面涉及有抗微生物活性的多肽，其选自(a)包含与SEQ ID NO 2的1_40位氨基酸有至少65%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)包含与假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)CBS 444. 97 中存在的核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分编码的多肽有至少65%同一性的氨基酸序列的多肽；(c)由与选自下列的多核苷酸探针在低严格条件下杂交的核苷酸序列编码的多肽(i)SEQ ID NO 1的166-285位核苷酸的互补链，(ii)SEQ ID NO 1的70-285位核苷酸的互补链，和(iii)SEQ ID NO 1的1-285位核苷酸的互补链，以及(d)有抗微生物活性的(a)、(b)或(c)的片段。本发明第二个方面涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本发明第三个方面涉及包含将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连接到一种或多种在适和的宿主中控制多肽产生的调控序列上的核酸构建体。本发明第四个方面涉及包含本发明核酸构建体的重组表达载体。本发明第五个方面涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞。本发明第六个方面涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括(a)培养其野生型能够产生该多肽的菌株以产生该多肽；并(b)回收该多肽。本发明第七个方面涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并(b)回收该多肽。本发明的其他方面将在下述说明书和所附的权利要求中表明。本发明还涉及如下方面1.具有抗微生物活性的多肽，其选自(a)包含的氨基酸序列与SEQ ID NO 2的1_40位氨基酸具有至少65%同一性的多肽，其中组成该多肽的氨基酸独立地选自D型或L型；(b)包含的氨基酸序列与假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)CBS 444. 97 中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列所编码的多肽具有至少65%同一性的多肽；(c)与选自以下的多核苷酸探针在低严格条件下杂交的核苷酸序列所编码的多肽(i)SEQ ID NO 1的166-285位核苷酸的互补链，(ii)SEQ ID NO 1的70-285位核苷酸的互补链，和(iii)SEQ ID NO 1的1185位核苷酸的互补链；以及(d)具有抗微生物活性的(a)、(b)或(c)的片段。2.根据项1的多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO 2的1_40位氨基酸具有至少70%的同一性，优选地与SEQ ID NO :2的1-40位氨基酸具有至少80%的同一性、至少 85 %的同一性、至少90 %的同一性、至少95 %的同一性，或至少99 %的同一性。3.根据项2的多肽，其包含SEQ ID NO 2的1_40位氨基酸。4.根据项1至3中任意一项所述的多肽，其由SEQ ID NO 2的1_40位氨基酸组成。5.根据项1至3中任意一项所述的多肽，其中该多肽是人工变体，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO :2的1-40位氨基酸相比较具有至少一处氨基酸的替换、删除和/或插入。6.根据项1的多肽，其包含的氨基酸序列与假黑盘菌CBS 444.97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列所编码的多肽具有至少70%的同一性，优选地与假黑盘菌CBS 444. 97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列所编码的多肽具有至少80%的同一性、至少85 %的同一性、至少90 %的同一性、至少95 %的同一性，或至少99 %的同一性。7.根据项6的多肽，其包含的氨基酸序列由假黑盘菌CBS 444. 97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列编码。8.根据项6或7的多肽，其由假黑盘菌CBS 444. 97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列所编码的氨基酸序列组成。9.根据项6或7的多肽，其中该多肽是人工变体，其包含的氨基酸序列与假黑盘菌CBS 444.97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列所编码的氨基酸序列相比较具有至少一处氨基酸的替换、删除和/或插入。10.根据项1的多肽，其由与选自以下的多核苷酸探针在中严格条件下，优选地在高严格条件下杂交的核苷酸序列编码(i)SEQ ID NO 1的166-285位核苷酸的互补链，(ii)SEQ ID NO 1的70-285位核苷酸的互补链，和(iii)SEQ ID NO 1的1-285位核苷酸的互补链。11.根据项10的多肽，其由与这样的多核苷酸探针在中严格条件下，优选地在高严格条件下杂交的核苷酸序列编码，其中所述多核苷酸探针为SEQID NO :1的166-285位核苷酸的互补链。12.多核苷酸，其具有的核苷酸序列编码项1至11中任意一项所述的多肽。13.核酸构建体，其包含可操作地与一个或多个调控序列连接的项12中所述的核
4苷酸序列，其中所述调控序列指导所述多肽在合适的宿主中产生。14.重组表达载体，其包含项13中所述的核酸构建体。15.重组宿主细胞，其包含项13中所述的核酸构建体。16.产生如项1-11中任意一项所述的多肽的方法，该方法包括(a)培养菌株以产生该多肽，其中所述菌株在其野生型形式能够产生该多肽；以及(b)回收该多肽。17.产生如项1-11中任意一项所述的多肽的方法，该方法包括(a)在有益于该多肽产生的条件下培养如项15中所述的重组宿主细胞；以及(b)回收该多肽。18.多核苷酸，其具有的核苷酸序列与SEQ ID NO 1的166-285位核苷酸具有至少65%的同一性。19.多核苷酸，其具有的核苷酸序列与假黑盘菌CBS 444. 97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列具有至少65%的同一性。20.多核苷酸，其具有的核苷酸序列编码具有抗微生物活性的多肽，并且其具有的核苷酸序列与选自以下的多核苷酸探针在低严格条件下杂交(i)SEQ ID NO 1的166-285位核苷酸的互补链，(ii)SEQ ID NO 1的70-285位核苷酸的互补链，和(iii)SEQ ID NO 1的1-285位核苷酸的互补链。21.具有经修饰核苷酸序列的多核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸序列包含在SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列中的至少一处修饰，且其中该经修饰的核苷酸序列编码由SEQ ID NO 2的1-40位氨基酸组成的多肽。22.抗微生物组合物，其包含如项1-11中任意一项所述的抗微生物多肽。23.项22的组合物，其还包含额外的杀生物剂。24.杀死或抑制微生物细胞生长的方法，其包括将微生物细胞与项1-11中任意一项所述的抗微生物多肽接触。25.洗涤剂组合物，其包含表面活性剂和如项1-11中任意一项所述的抗微生物多肽。26.如项1-11中任意一项所述的用作药物的抗微生物多肽。27.如项1-11中任意一项所述的用作兽或人的抗微生物治疗剂或预防剂的抗微生物多肽。28.如项1-11中任意一项所述的抗微生物多肽的用途，其用于制备治疗微生物感染的兽或人的治疗剂或用于预防用途。29.如项1-11中任意一项所述的抗微生物多肽的用途，其用于杀死或抑制微生物细胞的生长。30.转基因植物、植物部分或植物细胞，其已经用这样的核苷酸序列转化，所述核苷酸序列编码如项1-11中任意一项所述的具有抗微生物活性的多肽。31.至少一种如项1-11中任意一项所述的抗微生物多肽在动物饲料中的用途。32.至少一种如项1-11中任意一项所述的抗微生物多肽在制备用于动物饲料的组合物中的用途。33.动物饲料添加剂，其包含(a)至少一种如项1-11中任意一项所述的抗微生物多肽；和(b)至少一种脂溶性维生素，和/或(c)至少一种水溶性维生素，和/或(d)至少一种微量矿物质，和/或(e)至少一种大量矿物质。34.项33的动物饲料添加剂，其还包含肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶和/ 或β-葡聚糖酶。35.动物饲料组合物，其具有50_800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一种如项1_11 中任意一项所述的抗微生物多肽。定义在进一步详细讨论本发明之前，先定义下列术语和惯用语基本上纯的多肽本发明上下文中，术语“基本上纯的多肽”指含有最多10%重量的与其天然缔合的其他多肽物质(更低百分比的其他多肽物质是优选的，例如最多8%重量、最多6%重量、最多5%重量、最多4%重量、最多3%重量、最多2%重量、最多重量和最多1/2%重量)的多肽制品。因此，优选基本上纯的多肽是至少92%纯，即该多肽组成制品中总的多肽物质重量的至少92%，并且更高百分比是优选的，例如至少94%纯、至少 95%纯、至少96%纯、至少96%纯、至少97%纯、至少98%纯，至少99%纯和最多99. 5% 纯。在此公开的多肽优选基本纯的形式。特别地，优选在此公开的多肽是“实质上纯的形式”，即该多肽制品实质上不含有与其天然缔合的其他多肽物质。这可例如通过公知的重组方法的方式制备多肽实现。在此，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”是同义的。抗微生物活性术语“抗微生物活性”在此定义为能够杀死或抑制微生物细胞生长的活性。本发明上下文中的术语“抗微生物”意指具有杀细菌的和/或制细菌的和/或杀真菌的和/或制真菌的效果和/或杀病毒的效果，其中术语“杀细菌的”可理解为能够杀死细菌细胞。术语“制细菌的”可理解为能够抑制细菌生长，即抑制正在生长的细菌细胞。术语“杀真菌的”可理解为能够杀死真菌细胞。术语“制真菌的”可理解为能够抑制真菌生长， 即抑制正在生长的真菌细胞。术语“杀病毒的”可理解为能够使病毒失活。术语“微生物细胞”表示细菌或真菌细胞(包括酵母)。本发明上下文中的术语“抑制微生物细胞的生长”意指细胞处于非生长状态，即它们不能够繁殖。为了本发明的目的，抗微生物活性可根据Lehrer等，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)，137 (2)，167-174 页，1991 中描述的方法确定。有抗微生物活性的多肽能够在其25% (w/w)的水溶液中，优选在10% (w/w)的水溶液中，更优选在5% (w/w)的水溶液中，甚至更优选在(w/w)的水溶液中，最优选在0.5% (w/w)的水溶液中，以及特别地在其0. 1% (w/w)有抗微生物活性的多肽的水溶液中，于20°C温育30分钟后，减少大肠杆菌(Escherichia coli) (DSM 1576)活细胞的数量至 1/100。
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有抗微生物活性的多肽也能够当其以IOOOppm的浓度加入，优选当其以500ppm的浓度加入，更优选当其以250ppm的浓度加入，甚至更优选当其以IOOppm的浓度加入；最优选当其以50ppm的浓度加入，以及特别地当其以25ppm的浓度加入微生物生长的培养基时， 于25°C抑制大肠杆菌(DSM 1576)的生长晕M小时。有抗微生物活性的多肽能够在其25% (w/w)的水溶液中，优选在10% (w/w)的水溶液中，更优选在5% (w/w)的水溶液中，甚至更优选在(w/w)的水溶液中，最优选在 0. 5% (w/w)的水溶液中，以及特别地在含0. 1% (w/w)有抗微生物活性的多肽的水溶液中， 于20°C温育30分钟后，减少枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) (ATCC 6633)活细胞的数量至1/100。有抗微生物活性的多肽也能够当其以IOOOppm的浓度加入，优选当其以500ppm的浓度加入，更优选当其以250ppm的浓度加入，甚至更优选当其以IOOppm的浓度加入；最优选当其以50ppm的浓度加入，以及特别的当其以25ppm的浓度加入微生物生长的培养基时， 于25°C抑制枯草芽孢杆菌(ATCC663;3)的生长晕M小时。本发明的多肽应优选具有由SEQ ID NO 2的1_40位氨基酸所示的氨基酸序列组成的多肽的至少20%的抗微生物活性。在一个特别优选的实施方案中，该多肽应具有由SEQ ID NO 2的1-40位氨基酸所示的氨基酸序列组成的多肽的至少40%、例如至少50%、优选至少60%、例如至少70%、更优选至少80%、例如至少90%、最优选至少95%、例如大约或至少100 %的抗微生物活性。同一性本发明的上下文中，两种氨基酸序列之间或两种核苷酸序列之间的同源性用参数“同一性”来描述。为了本发明的目的，两种氨基酸序列之间同一性的程度通过利用包括在 FASTA程序包(参见W. R. Pearson和D. J. Lipman (1988)，“生物序列分析的改进工 M," ( "Improved Tools for Biologocal Sequence Analysis"), PNAS85 :2444-2448 ； 和W. R. Pearson(1990) “使用FASTP和FASTA的快速和灵敏的序列比较” ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA"),酶学方法(Methods in Enzymology) 183 :63-98)的2. Ox版本中的FASTA程序确定。使用的评分矩阵是BL0SUM50， 缺口罚分是-12，且缺口延伸罚分是-2。两种核苷酸序列之间同一性的程度通过利用与上述相同的算法和软件包确定。使用的评分矩阵是同一性矩阵，缺口罚分是-16，且缺口延伸罚分是-4。片段在此所用的SEQ ID NO 2的“片段”是该氨基酸序列的氨基端和/或羧基端有一个或多个氨基酸删除的多肽。等位基因变体本发明的上下文中，术语“等位基因变体”表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或多种备选的形式。等位基因变体通过突变自然出现，并可在种群中导致多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中没有变化)或可能编码具有改变氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。基本上纯的多核苷酸术语“基本上纯的多核苷酸”在此指多核苷酸制品，其中多核苷酸已从其天然的遗传环境中分离出，因此不含外来的或不需要的编码序列并是适合在遗传工程蛋白质生产系统中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有最多10%重量的与其天然缔合的其他多核苷酸物质(更低百分比的其他多核苷酸物质是优选的，例如最多8%重量、最多6%重量、最多5%重量、最多4%重量、最多3%重量、最多2%重量、最多重量和最多1/2%重量)。但是，基本上纯的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是至少92%纯，即该多核苷酸组成制品中总的多核苷酸物质重量的至少92%，并且更高百分比是优选的，例如至少94%纯、至少95 %纯、至少96 %纯、至少96 %纯、至少97 %纯、至少98 %纯、至少99 %纯和最多99.5% 纯。在此公开的多核苷酸优选地为基本纯的形式。特别地，优选在此公开的多核苷酸是“实质上纯的形式”，即该多核苷酸制品实质上不含有与其天然缔合的其他多核苷酸物质。在此，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”是同义的。修饰本发明的上下文中术语“修饰”意指对由SEQ ID NO 2位1_40位氨基酸所示的氨基酸序列组成的多肽进行的任何化学修饰以及对编码该多肽的DNA的遗传操作。该修饰可以是氨基酸侧链的置换，目标氨基酸中或目标氨基酸处的替换、删除和/或插入。人工变体在此所用的术语“人工变体”指由表达与SEQ ID NO :1相比经修饰基因的生物产生的有抗微生物活性的多肽。能在合适的宿主中表达产生所述变体的经修饰基因是通过修饰SEQ ID NO :1中公开的核苷酸序列的人为干涉获得的。cDNA:上下文中用到的术语“cDNA”指涵盖可通过逆转录对分离自真核细胞的成熟剪接的mRNA分子而制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应的基因组DNA中的内含子序列。最初的初级RNA转录物是mRNA的前体并且它在作为成熟剪接的mRNA出现前经历一系列的加工。这些加工包括通过称为剪接的处理以除去内含子序列。当cDNA来自mRNA 时它因此缺少内含子序列。核酸构建体在此所用的术语“核酸构建体”指分离自天然存在的基因或已被修饰为含有不以天然方式存在的核酸片段的单链或双链的核酸分子。当该核酸构建体包含为本发明的编码序列表达所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。调控序列术语“调控序列”在此定义为包括对本发明多肽的表达必要的或有益的所有元件。每个调控序列可以是编码该多肽的核苷酸序列的自身的或外源的调控序列。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最小的调控序列包括启动子及转录和翻译的终止信号。可提供携带以引入特异的限制性位点为目的的接头调控序列，其中所述限制性位点易于调控序列和编码多肽的核苷酸序列的编码区的连接。可操作地连接的术语“可操作地连接的”在此定义为构型中调控序列被适当地置于DNA序列的编码序列相关的位置，以使得调控序列指导多肽的表达。编码序列在此所用的术语“编码序列”指涵盖直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由一般以ATG为起始密码子的开放阅读框确定。编码序列一般包括DNA、cDNA和重组核苷酸序列。表达上下文中，术语“表达”包括涉及多肽产生中的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。表达载体上下文中，术语“表达载体”涵盖包括编码本发明多肽的片段和可操作地连接到提供其转录的其它片段上的线性或环状的DNA分子。宿主细胞术语“宿主细胞”在此包括用核酸构建体易于转化的任何细胞类型。
术语“多核苷酸探针”、“杂交”以及不同的严格条件在题为“有抗微生物活性的多肽”部分定义。发明详述有抗微生物活性的多肽在第一个实施方案中，本发明涉及有抗微生物活性的多肽并且该多肽包含，优选地由与SEQ ID NO :2(即成熟多肽)的1-40位氨基酸有至少65%，优选至少70%，例如至少75 %，更优选至少80 %，例如至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少至少95 %，例如至少96%，例如至少97%，以及甚至最优选至少98%，例如至少99%同一性程度的氨基酸序列组成(下文中的“同源多肽”)。在一个令人感兴趣的实施方案中，该氨基酸序列与 SEQ ID NO 2的1-40位氨基酸最多10个氨基酸(例如10个氨基酸)，特别的最多5个氨基酸(例如5个氨基酸)，例如最多4个氨基酸(例如4个氨基酸)，例如最多3个氨基酸 (例如3个氨基酸)不同。在一个尤其令人感兴趣的实施方案中，该氨基酸序列与SEQ ID NO :2的1-40位氨基酸最多2个氨基酸(例如2个氨基酸)，例如1个氨基酸不同。优选地，本发明的多肽包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列；其等位基因变体；或其具有抗微生物活性的片段。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID N0:2的 1-40位氨基酸。在一个进一步优选的实施方案中，多肽由SEQ ID NO 2的1_40位氨基酸组成。组成本发明多肽的氨基酸可独立地选自D或L型。本发明的多肽可以是有抗微生物活性、鉴定和分离自自然源的野生型多肽。该野生型多肽可通过本领域公知的标准技术特定筛选。进一步的，本发明的多肽可通过例如 J. E. Ness 等在自然生物技术(Nature Biotechnology 17,893-896(1996))中描述的 DNA 改组技术制备。此外，本发明的多肽可以是包含，优选地由与SEQ ID NO :2的1-40位氨基酸相比具有至少一个氨基酸的替换、删除和/或插入的氨基酸组成的人工变体。该人工变体可通过本领域公知的标准技术，例如通过对包含SEQ ID NO :2的1-40位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽进行定点/随机诱变构建。在本发明的一个实施方案中，氨基酸变化(在人工变体中以及在野生型多肽中)具有次要特性是不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸替换；一般1至约30个氨基酸的小删除；氨基端或羧基端的小延伸，例如氨基端的甲硫氨酸残基；多至约20-25个残基的小连接肽；或通过改变静电荷或具有例如多聚-组氨酸序列段、抗原表位或结合结构域的其他功能而易于纯化的小延伸。保守替换的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、 缬氨酸和甲硫氨酸)，芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)的基团中。通常不会改变特定活性的氨基酸替换是本领域公知的并被例如 H. Neurath 和 R. L. Hill, 1979，蛋白质(The Proteins)，学院出版社(Academic Press)，纽约(New York) 一书中所描述。最常见的交换是Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/ Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、 Leu/IIe、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly 以及它们的逆向交换。在本发明令人感兴趣的一个实施方案中，氨基酸变化是多肽的物理-化学特性改变的种类。例如氨基酸变化可以是改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适PH等。
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优选地，与SEQ ID NO :2的1-40位氨基酸相比上述替换、删除和/或插入的数目最多10个，例如最多9个，例如最多8个，更优选最多7个，例如最多6个，例如最多5个， 最优选最多4个，例如最多3个，例如最多2个，特别是最多1个。本发明已从假黑盘菌中分离出编码有抗微生物活性的多肽的基因。含有该基因的假黑盘菌根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，于1997年1月观日保藏于真菌菌禾中保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS)), Uppsalalaah 8,3584 CT Utrecht，荷兰(备选地 P. 0. Box85167，3508 AD Utrecht, The Netherlands)并且指定保藏号CBS 444.97。因此在第二个实施方案中，本发明涉及包含，优选地由与假黑盘菌CBS444. 97中存在的核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分有至少65%同一性的氨基酸序列组成的多肽。 在本发明令人感兴趣的一个实施方案中，该多肽包含，优选地由与假黑盘菌CBS 444.97中核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分有至少70%，例如至少75%，优选至少80%，例如至少85 %，更优选至少90 %，最优选至少95 %，例如至少96 %，例如至少97 %，以及甚至最优选至少98%，例如至少99%同一性的氨基酸序列组成(下文中的“同源多肽”)。在令人感兴趣的一个实施方案中，该氨基酸序列与假黑盘菌CBS 444.97中核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分最多10个氨基酸(例如10个氨基酸)，特别的最多5个氨基酸(例如5个氨基酸)，例如最多4个氨基酸(例如4个氨基酸)，例如最多3个氨基酸(例如3个氨基酸)不同。在一个特别令人感兴趣的实施方案中，该氨基酸序列与假黑盘菌CBS 444. 97中核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分最多2个氨基酸(例如2个氨基酸)，例如1个氨基酸不同。优选地，本发明的多肽包含假黑盘菌CBS 444.97中核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽由假黑盘菌CBS 444. 97中核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分所编码多肽的氨基酸序列组成。如上述相似的方式，本发明的多肽可以是包含，优选地由与假黑盘菌CBS 444.97 中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列编码的氨基酸序列相比有至少一个氨基酸的替换、 删除和/或插入的氨基酸序列组成的人工变体。在第三个实施方案中，本发明涉及在非常低严格的条件下，优选地在低严格条件下，更优选在中等严格条件下，更优选在中-高严格条件下，甚至更优选在高严格条件下， 和最优选在非常高严格的条件下，与选自下列多核苷酸探针(i)SEQ ID NO :1的166485位核苷酸的互补链，(ii)SEQ ID NO :1的70-285位核苷酸中含有的cDNA序列的互补链，和 (iii)SEQ ID NO 1的1-285位核苷酸的互补链杂交的核苷酸序列编码的有抗微生物活性的多肽(J. Sambrook, E. F. Fritsch和T. Maniatus, 1989，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港，纽约)。SEQ ID NO :1的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO 2的氨基酸序列或其片段可根据本领域公知的方法用于设计多核苷酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的菌株的编码有抗微生物活性多肽的DNA。特别地，此类探针可用于与目标属或种的基因组或cDNA 杂交，按照标准的Southern印迹步骤以鉴定和分离其中相对应的基因。此类探针可以是较全长序列短许多，但应是至少15，优选至少25，更优选至少35个核苷酸的长度，例如至少70 个核苷酸的长度。但是优选该多核苷酸探针是至少100个核苷酸的长度。例如该多核苷酸
1探针可以是至少200个核苷酸的长度，至少300个核苷酸长度，至少400个核苷酸长度或至少500个核苷酸长度。甚至可使用更长的探针，例如至少600个核苷酸长度，至少700个核苷酸长度，至少800个核苷酸长度，或至少900个核苷酸长度的多核苷酸探针。DNA和RNA 探针都可以使用。探针通常被标记以检测相应的基因(例如，用32P，3H，35S，生物素或抗生物素蛋白标记)。因此，制备自此类其他生物体的基因组DNA或RNA文库可用于筛选与上述探针杂交和编码有抗微生物活性的多肽的DNA。来自此类其他生物体的基因组或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术分离。来自文库的DNA或分离的DNA可被转移和固定至硝酸纤维素膜或其他合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO :1同源的克隆或DNA，带有固定化DNA的载体材料被用于Southern印迹。为了本发明的目的，杂交说明该核酸序列在非常低至非常高的严格条件下与和 SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列杂交的标记多核苷酸探针杂交。在这些条件下与多核苷酸探针杂交的分子可利用χ-射线胶片或通过本领域公知的任何其他方法检测。无论何时在上下文中使用的术语“多核苷酸探针”可理解为该探针含有至少15个核苷酸。在一个令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是SEQ ID NO :1的核苷酸 166-285的互补链，核苷酸70-285的互补链，核苷酸H85的互补链。在另一个令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是编码SEQ ID NO 2的多肽的核苷酸序列的互补链。在一个进一步令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是SEQ ID NO 1的互补链。在更进一步令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是SEQ ID NO 1的成熟多肽编码区的互补链。在另一个令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是假黑盘菌CBS 444.97中抗微生物多肽编码区的互补链。在另一个更令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是假黑盘菌CBS 444.97中成熟抗微生物多肽编码区的互补链。对于至少100个核苷酸长度的长探针，非常低至非常高的严格条件定义为在 5X SSPE, 1. 0% SDS，5XDenhardt，s 溶液，100 μ g/ml 剪切和变性的鲑鱼精 DNA 中于 42°C预杂交和杂交，按照标准的Southern印迹步骤进行。优选的，至少100个核苷酸的长探针不包含多于1000个核苷酸。对于至少100个核苷酸长度的长探针，载体材料最终用2XSSC， 0. 1 % SDS于42 V洗浲15分钟，洗三次(非常低严格)，优选每次用0. 5 X SSC, 0. 1 % SDS于 42°C洗涤15分钟，洗三次(低严格)，更优选每次用0. 2 X SSC，0. 1 % SDS于42°C洗涤15分钟，洗三次(中严格)，甚至更优选每次用0.2XSSC，0. SDS于55°C洗涤15分钟，洗三次(中-高严格)，最优选每次用0. 1 X SSC, 0. 1 % SDS于60°C洗涤15分钟，洗三次(高严格)，特别的每次用0. 1XSSC，0. 1% SDS于68°C洗涤15分钟，洗三次(非常高严格)。尽管不是特别优选的，较短的探针，例如约15至99个核苷酸长度的探针，例如约 15至约70个核苷酸长度也可被使用。对于这些短探针，严格条件定义为在比根据Bolton 和 McCarthy(1962，美国国家科学院学报(Proceeding of the National Academy of Sciences USA)48 :1390)计算的Tm低5°C至 10°C下，在0. 9M NaCl，0. 09M Tris-HCl pH7. 6， 6mM EDTA，0. 5% NP-40，lXDenhardt，s 溶液，ImM 焦磷酸钠，ImM 磷酸二氢钠，0. ImM ATP 和 0. 2mg/ml的酵母RNA中预杂交、杂交和杂交后洗涤，按照标准的Southern印迹步骤进行。对于约15至99个核苷酸长度的短探针，载体材料在比计算的Tm低5°C至10°C下用加入0. 1% SDS的6XSCC洗涤15分钟以及再每次用6XSCC洗涤15分钟洗两次。
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N-末端延伸N-末端延伸可适当地由1-50个氨基酸，优选2-20个氨基酸，尤其3_15个氨基酸组成。在一个实施方案中N-末端肽的延伸不含有Arg (R)。在另一个实施方案中N-末端延伸包含将在下文进一步定义的kex2或kex2样切割位点。在一个优选的实施方案中N-末端延伸是包含至少2个Glu (E)和/或Asp (D)的氨基酸残基的肽，例如包含下列序列之一的 N-末端延伸=EAE, EE、DE、DD。Kex2 位点Kex2 位点(参见例如酶学方法(Methods in Enzymology)，185 卷，D. Goeddel 编车t， Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA,( "Gene Expression Technology"))和Kex2样位点是在一些蛋白质的前肽编码区和成熟区之间发现的二价识别位点(即切割位点)。Kex2位点或Kex2样位点的插入已经在一些情况下显示于前肽切割位点处改善了正确的肽链内切酶处理而导致蛋白质分泌水平的提高。在本发明的上下文中Kex2位点或Kex2样位点的插入导致可能获得在使抗微生物多肽与SEQ ID NO :2的1-40位氨基酸所示的成熟多肽相比被延伸的N-末端延伸的特定位点处断裂。有抗微生物活性的多肽的来源本发明的多肽可获得自任何属的微生物。为了本发明的目的，在此所用的术语“获得自”应指核苷酸序列编码的多肽是由其中该核苷酸天然存在或其中已被插入该核苷酸的细胞产生的。在优选的实施方案中，该多肽是胞外分泌的。本发明的多肽可以是，细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) > 短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)lif (Bacillus coagulans) >'Mj^^ifeff lif (Bacillus lautus) 缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)、嗜热月旨肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱杆菌或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽的芽孢杆菌(Bacillus)多肽；或例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)多肽的链霉菌(Streptomyces)多肽；或是革兰氏阴性细菌多肽，例如大肠杆菌(E. coli)或假单胞菌(Pseudomonas sp.)多肽。本发明的多肽可以是真菌多肽，更优选例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia多肽的酵母多肽；或更优选例如支 Tg 3 属(Acremonium)、 _ M (Aspergillus)、失豆禾丙 β M (Aureobasidium)、 ^t 求 W 母属(Cryptococcus)、Filibasidium、键抱属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、 Magnaporthe >(Mucor) > Iiβ M (Myceliophthora)、Neocallimastix> 113 属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂裙菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、草根霉属 (Thielavia) ,!"olypocladium 或木霉属 CTrichoderma)多肽的丝状真菌多肽。
在一个令人感兴趣的实施方案中，多肽是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多月太。在另一个令人感兴趣的实施方案中，多肽是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、 ^ ^ ffi β (Aspergillus awamori) Λ 1 ffi β (Aspergillus foetidus)、 0 ^ ft β (Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、漂曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆抱状,廉抱(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀德抱(Fusarium culmorum)、禾谷德抱(Fusarium graminearum)、禾赤德抱(Fusarium graminum)、异抱德抱(Fusarium heterosporum)、合欢木德抱(Fusarium negundi)、尖抱德抱(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusarium reticulatum)、粉红德抱(Fusarium roseum)、接骨木,廉抱(Fusarium sambucinum)、肤色 ,廉抱(Fusarium sarcochroum)、拟分枝抱德抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱 (Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁氏木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma IongibrachiatumΛ 里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多月太。在优选的实施方案中，该多肽是假黑盘菌多肽，更优选是假黑盘菌CBS444. 97多肽，例如由SEQ ID NO 2的1-40位氨基酸序列组成。可以理解的是对于在前提到的种，本发明包含有性和无性状态，以及其他分类学等同物，例如无性型，而不考虑使其被认知的种名。本领域的技术人员容易识别合适等同物的身份。这些种的菌株是公众在很多培养中心容易得到的，例如美国典型培养物保藏中心 (ATCC)，德国微生物保藏中心(DSM)，真菌培养中心(CBQ和农业研究机构培养物保藏中心，北部研究中心(NRRL)。进一步的，该多肽可利用上述的探针从其他来源鉴定和获得，包括分离自天然 (例如土壤、堆肥、水等)的微生物。用于从自然生活环境中分离微生物的技术是本领域公知的。核苷酸序列可随后通过类似筛选另一个微生物的基因组或cDNA文库获得。一旦编码多肽的核苷酸序列已经用探针检测到，该序列可通过对于本领域的普通技术人员来说公知的实用技术(参见例如Sambrook等，1989，如上)分离或克隆。本发明的核苷酸序列编码的多肽也包括其中另一个多肽被融合到该多肽或其片段的N-末端或C-末端的融合多肽或可切割融合多肽。融合多肽可通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到本发明的核苷酸序列(或其部分)产生。用于产生融合多肽的技术是本领域公知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中并且该融合蛋白的表达在相同的启动子和终止子的调控下。多核苷酸和核苷酸序列本发明也涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。特别地，本发明涉
13及由编码本发明多肽的核苷酸序列组成的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，该核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。在一个更优选的实施方案中，该核苷酸序列是SEQ ID NO=I的成熟多肽编码区。在另一个更优选的实施方案中，该核苷酸序列是假黑盘菌CBS444. 97中成熟抗微生物多肽编码区。本发明也包括具有，优选地由编码下述多肽的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中所述多肽由SEQ ID NO :2或其成熟多肽的氨基酸序列组成，其中所述多核苷酸由于遗传密码子的简并性而与SEQ ID N0:1不同。本发明也涉及具有，优选地由SEQ ID NO 1的编码SEQ ID NO 2的有抗微生物活性的片段的亚序列组成的多肽。SEQ ID NO 1的亚序列是除了 5’和/或3’末端的一个或多个核苷酸删除外被SEQ ID NO :1包括的核苷酸序列。本发明也涉及具有，优选由在SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列中包含至少一个修饰的经修饰核苷酸序列组成的多核苷酸，并且其中经修饰的核苷酸序列编码由SEQ ID NO 2的1-40位氨基酸组成的多肽。用于分离或克隆编码多肽的核苷酸序列的技术是本领域公知的并包括从基因组 DNA的分离，从cDNA的制备或它们的组合。从这些基因组DNA中克隆本发明的核苷酸序列可通过如利用公知的多聚酶链反应(PCR)或用来检测具有共同结构特性的克隆DNA片段的表达文库抗体筛选来完成。参见例如Innis等，1990，PCR 方法和应用的指导(PCR =A Guide to Methods and Application)，学院出版社，纽约。可使用例如连接酶链反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)的其他扩增方法。核苷酸序列可克隆自假黑盘菌属中存在有编码抗微生物多肽的核苷酸序列的菌株，或另一个或相关的生物体， 因此核苷酸序列可以例如是该核苷酸序列多肽编码区的等位基因变体或种间变体。核苷酸序列可通过用于使核苷酸序列从其天然位置重置到其将被再产生的不同位点的遗传工程中所用的标准克隆方法获得。克隆方法可涉及对包含编码多肽的核苷酸序列的目标片段进行切除和分离，将片段插入载体分子以及重组载体掺入到其中进行核苷酸序列的多拷贝或克隆复制的宿主细胞中。该核苷酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成来源的或为它们的任意组合。本发明也涉及具有，优选地由与SEQ ID NO 1的166-285位核苷酸有至少65%同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸。优选地该核苷酸序列与SEQ IDNO 1的166-285位核苷酸有至少70%的同一性，例如至少80%的同一性，例如至少90%的同一性，更优选至少 95 %的同一性，例如至少96 %的同一性，例如至少97 %的同一性，甚至更优选至少98 %的同一性，例如至少99%的同一性。优选地，该核苷酸序列编码有抗微生物活性的多肽。两个核苷酸序列之间的同一性程度如上述确定(参见题为“定义”的部分)。优选地，核苷酸序列包含SEQ ID NO :1的166-285位核苷酸。在一个甚至更优选的实施方案中，该核苷酸序列由SEQ ID NO 1的166-285位核苷酸组成。在另一个令人感兴趣的方面，本发明涉及具有，优选地由与假黑盘菌CBS444. 97 中编码抗微生物多肽的核苷酸序列中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列具有至少65% 同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，该多核苷酸与假黑盘菌 CBS444. 97中编码抗微生物多肽的核苷酸序列中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列的同一性程度是至少70 %，例如至少80 %，例如至少90 %，更优选至少95 %，例如至少96 %，例如至少97%，甚至更优选至少98%，例如至少99%。优选地，该核苷酸序列包含假黑盘菌
14CBS444. 97中编码抗微生物多肽的核苷酸序列中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列。在一个甚至更优选的实施方案中，该核苷酸序列由假黑盘菌CBS444. 97编码抗微生物多肽的核苷酸序列中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列组成。编码本发明多肽的核苷酸序列的修饰可能是合成与SEQ ID NO 2的1_40位氨基酸相比包含至少一个氨基酸序列替换、删除和/或插入的多肽所必需的。这些人工变体可能与分离自天然来源的多肽在例如比活性、热稳定性、最适PH等的一些工程方式上不同。对于本领域的技术人员来说能够确定在分子功能的关键区域外进行修饰并仍然保持多肽活性。为本发明核苷酸序列编码的多肽的活性所必需的并且优选不进行修饰例如替换修饰的氨基酸残基可根据例如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变的本领域公知方法(参见例如 Cunningham 和 Wells，1989，科学(Science) 244 1081-1085)鉴定。在后一个技术中，突变被引入分子中每个正电荷残基并且对所得到的突变分子用于抗微生物活性测试以确定分子活性的关键氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可通过三维结构的分析确定， 其中所述三维结构分析是通过如下技术如核磁共振分析、结晶学或光亲和标记技术(参见例如 de Vos 等，1992，科学 255 :306-312 ;Smith 等，1992，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology) 224 :899-904 ；Wlodaver 等，1992，FEBS Letters 309 :59-64)确定的。此外，编码本发明多肽的核苷酸序列可通过导入这样的核苷酸替换而修饰，其中所述核苷酸替换不会产生由该核苷酸序列编码的多肽的另一个氨基酸序列，但该核苷酸替换对应于产生酶的宿主生物的密码子使用。使一个核苷酸变换为另一个核苷酸的核苷酸序列突变的引入可利用本领域公知的任何方法通过定点诱变实现。特别有用的是使用具有目标插入片段的超螺旋双链DNA载体和包含所需突变的两条合成引物的方法。每条相对于载体的相对链互补的寡核苷酸引物借助于Pfu DNA聚合酶在温度循环下延伸。引物掺入后，形成含有交错切口的突变质粒。在温度循环之后，产物用特异于甲基化和半甲基化DNA的DpnI处理以消化亲本DNA模板并筛选含有突变的合成DNA。本领域公知的其他方法也可使用。对于核苷酸替换的概括性描述参见例如Ford等，1991，蛋白质的表达和纯化(Protein Expression and Purif ication) 2 95-107。本发明也涉及含有，优选地由以下核苷酸序列组成的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码具有抗微生物活性的多肽，并且该核苷酸序列在非常低严格条件下，优选在低严格条件下，更优选在中严格条件下，更优选在中-高严格条件下，甚至更优选在高严格条件下，以及最优选在非常高严格条件下与选自以下的多核苷酸探针杂交(i) SEQ ID N0:1的 166-285位核苷酸的互补链，(ii)SEQ ID NO :1的70-285位核苷酸中含有的cDNA序列的互补链，以及(iii)SEQ ID NO 1的1-285位核苷酸的互补链。可以理解，关于核苷酸序列杂交的细节以及具体情形与在题为“有抗微生物活性的多肽”部分讨论的杂交方面是相同或相似的。核酸构建体本发明也涉及包含被可操作地连接至一个或多个调控序列上的本发明核苷酸序列的核酸构建体，其中所述调控序列于合适的宿主细胞中在适于调控序列的条件下指导编码序列表达。编码本发明多肽的核苷酸序列可用多种方式操作以提供多肽的表达。取决于表达载体，希望或必需在核苷酸序列插入载体前进行操作。利用重组DNA方法修饰核苷酸序列的技术是本领域公知的。调控序列可以是合适的启动子序列，其中所述启动子序列是被宿主细胞识别的用于表达核苷酸序列的核苷酸序列。该启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，其包括突变、截短和杂合的启动子，并且可从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。适合的用于指导本发明核酸构建体转录的启动子实例，尤其是在细菌宿主细胞中的启动子实例，是从大肠杆菌Iac操纵子、天蓝色链霉菌(Sti^ptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α _淀粉酶基因 (amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α _淀粉酶基因 (amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核细胞 β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，美国国家科学院学报75 :3727-3731)获得的启动子以及tac启动子(DeBoer等，1983，美国国家科学院学报80 :21-25)。进一步的启动子在科学美国人(Scientific American)，1980,242 :74-79的“来自重组细菌的有用蛋白质，，("Useful proteins from recombinant bacteria，，)禾口 Sambrook 等，1989,同上中有描述。用于指导本发明核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子实例是从米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(lihizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α -淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(W096/00787)基因获得的启动子以及NA2_tpi启动子(来自黑曲霉中性α -淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因启动子的杂合启动子)，及它们的突变、截短和杂合的启动子。在酵母宿主中，有用的启动子是从酿酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GALl)、酿酒酵母醇脱氢酶/3-磷酸甘油醛脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因获得的。其他用于酵母宿主细胞的有用启动子在Romanos等，1992，酵母 (Yeast)8 :423-488 中有描述。调控序列也可以是被宿主细胞识别而终止转录的合适转录终止子序列。终止子序列被可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列的3’末端。任何在所选择的宿主细胞中发挥作用的终止子都可在本发明中使用。优选的用于丝状真菌宿主细胞的终止子是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α -葡糖苷酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得的。用于酵母宿主细胞的优选终止子从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素 C(CYCl)和酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因获得。其他用于酵母宿主细胞的有用终止子在Romanos等，1992，同上中有描述。调控序列也可以是合适的前导序列，其为对宿主细胞的翻译至关重要的mRNA非翻译区。前导序列被可操作地连接至编码多肽的核苷酸序列的5’末端。任何在所选择的宿主细胞中发挥作用的前导序列都可在本发明中使用。
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优选的用于丝状真菌宿主细胞的前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得的。酵母宿主细胞的合适前导序列从酿酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/3-磷酸甘油醛脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得。调控序列也可以是被可操作地连接到核苷酸序列的3’末端并在转录时被宿主细胞作为向转录的mRNA上添加聚腺苷残基的信号识别的聚腺苷酸化序列。任何在选择的宿主细胞中有功能的聚腺苷酸化序列都可在本发明中使用。优选的用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉 α-葡糖苷酶的基因获得的。其他用于酵母宿主细胞的有用聚腺苷酸化序列在Guo和Sierman，1995，分子细胞生物学(Molecular Cellular Biology) 15 :5983-5990 中有描述。调控序列也可以是信号肽编码区，其编码连接至多肽的氨基末端并指导编码多肽进入细胞分泌途径的氨基酸序列。核苷酸序列的编码序列的5’端可本来就含有天然连接在翻译阅读框中的信号肽编码区，其中所述翻译阅读框具有编码分泌性多肽的编码区片段。 备选地，编码序列的5’端可含有对编码序列而言为外源的信号肽编码区。该外来信号肽编码区可能在不天然含有信号肽编码区的编码序列中是必需的。备选地，该外来信号肽编码区可简单置换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。但是，任何在选择的宿主细胞中指导表达多肽进入分泌途径的信号肽编码区都可在本发明中使用。信号肽编码区是编码SEQ ID NO 2中-55至-33位氨基酸(或序列3的1_23位氨基酸)的SEQ ID NO :1中1-69位核苷酸。对细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β -内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码区。其它信号肽在Simonen和I^alva，1993，微生物综述(MicroBiological Reviews) 57 :109-137 中有描述。对丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和 Humicola lanuginosa脂肪酶的基因获得的信号肽编码区。对酵母宿主细胞有用的信号肽是从酿酒酵母α -因子和酿酒酵母转化酶的基因获得的。其他有用的信号肽编码区在Romanos等，1992，同上中有描述。调控序列也可以是编码置于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所得到的多肽公知为原酶或多肽原(或在一些情况下为酶原)。多肽原通常是无活性的并且可通过对来自多肽原的前肽催化或自动催化断裂转化为成熟有活性的多肽。前肽编码区可从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α -因子、米黑根毛酶天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(W095/33836)的基因获得。前肽编码区是编码SEQ ID NO 2中-32至_1位氨基酸(或序列3中24_55位氨基酸)的SEQ ID NO :1中70-165位核苷酸。当信号肽和前肽区都出现在多肽的氨基末端时，前肽区置于靠近多肽的氨基末端而信号肽区置于靠近前肽区的氨基末端。也可能需要加入允许相对于宿主细胞的生长调节多肽表达的调节序列。调节系统的实例是那些对化学或物理刺激起反应而导致基因表达打开或关闭的系统，其中所述化学或物理刺激包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac，tac，和trp操纵子系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，TAKA α -淀粉酶启动子、 黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作调节序列。其他调节序列的实例是允许基因扩增的序列。在真核系统中包括在氨甲蝶呤存在时被扩增的二氢叶酸还原酶基因和伴随重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列被可操作地连接到调节序列上。表达载体本发明也涉及包含本发明核酸构建体的重组表达载体。上述多种核苷酸和调控序列可被连接到一起以生产可能包括允许于该位点对编码多肽的核苷酸序列进行插入或替换的一个或多个方便的限制性位点的重组表达载体。备选地，本发明的核苷酸序列可通过将该核苷酸序列或包含该序列的核酸构建体插入合适的载体而表达。在构建表达载体时， 编码序列定位于载体使得编码序列被可操作地连接到合适的调控序列上用于表达。重组表达载体可以是能够方便地进行重组DNA步骤并能够实现核苷酸序列表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与该载体将被导入的宿主细胞间的相容性。载体可以是线性的或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即其复制不依赖于染色体复制的、作为染色体外实体存在的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被引入宿主细胞时整合到基因组中并随被整合的染色体一起复制的载体。进一步的，可使用单一载体或质粒， 或可使用一起包含被导入宿主细胞基因组的总DNA的二种或多种载体或质粒，或可使用转座子。本发明的载体优选包含允许转化细胞易于选择的一种或多种选择性标记。选择性标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、原养型到营养缺陷型等的基因。细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的抗生素抗性标记。适合酵母宿主细胞的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB (鸟氨酸转氨甲酰酶)、bar (膦丝菌素乙酰转移酶)、 hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’ -磷酸脱羧酶)、 sC (硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)及它们的等同物。优选用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)的 bar 基因。本发明的载体优选含有允许载体稳定整合到宿主细胞基因组中或在细胞中不依赖于基因组的载体自主复制的元件。为了整合到宿主细胞基因组中，载体可依赖编码多肽的核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组将载体稳定整合到基因组中的任何其它载体元件。备选地，载体可包含用于指导通过同源重组整合到宿主细胞基因组的额外核苷酸序列。该额外核苷酸序列使载体能够被整合到宿主细胞基因组染色体的精确位点。为了提高在精确位点整合的可能性，整合元件应优选含有充足数目的核苷酸，例如100-1，500个碱基对、优选地400-1，500个碱基对和最优选地800-1，500个碱基对，并且该核苷酸与相应的靶序列高度同源以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。进一步地， 整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。对于自主复制，载体可进一步包含能够使载体在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177 和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的pUBl 10、pE194、pTA1060和ρΑΜ β 1。 用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARSl和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。复制起点可以含有在宿主细胞中行使温度敏感功能的突变(参见例如Ehrlich, 1978，美国国家科学院学报75 :1433)。本发明核苷酸序列的多于一个拷贝可被插入宿主细胞以提高基因产物的产量。核苷酸序列拷贝数的增加可通过将该序列的至少一个附加拷贝整合到宿主细胞的基因组中得到，或者通过包含可扩增的选择性标记基因和该核苷酸序列的细胞而获得该核苷酸序列拷贝数的增加，其中可通过在存在合适的选择剂时培养细胞，从而选择含有选择性标记基因的扩增拷贝并因此含有该核苷酸序列的附加拷贝的细胞。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法对于本领域的技术人员是公知的(参见例如Sambrook等，1989，同上)。宿主细胞本发明也涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞，其有利地用于该多肽的重组产生。包含本发明核苷酸序列的载体被引入宿主细胞以使得载体以先前描述的染色体整合体或自我复制的染色体外载体存在。宿主细胞可以是单细胞微生物例如原核生物或非单细胞微生物例如真核生物。有用的单细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌，其包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的芽孢杆菌(Bacillus)细胞；或链霉菌例如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌的细胞；或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌或假单胞菌的细胞。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞是嗜碱芽孢杆菌。载体到细菌宿主细胞的导入可例如通过原生质体转化(参见例如Chang和 Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168 :111-115)、使用感受态细胞(参见例如 Young 和 Spizizin，1961，细菌学杂志(Journal of Bacteriology) 81 :823-829,或 Dubnau 和 Davidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology) 56 209-221)、电穿孑L (参见例如 Shigekawa 和 Dower, 1988,生物技术(Biotechniques) 6 742-751)、或接合(参见例如Koehler和Thorne, 1987，细菌学杂志(Journal ofBacteriology) 169 :5771-5278)而完成。宿主细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个优选的实施方案中宿主细胞是真菌细胞。在此用到的“真菌类”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)禾口接合菌门 (Zygomycota)(如 Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi,第八版，1995，CAB International, University Press，剑桥，英国一书中 Haw Ksworth 等定义的)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，同上，第171页中引用)和所有有丝分裂真菌类 (Hawksworth 等，1995，同上)。在一个更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。在此用到的“酵母”包括产子囊酵母(内生真菌)、担孢子酵母和属于半知菌的酵母(芽生菌)。由于酵母的分类在将来可能有变化，为了本发明的目的，酵母定义为如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast) (Skinner, F. A. , Passmore, S. M.禾口 Davenport, P. R.编辑，Soc.App. Bacteriol. Symposium Series No. 9，1980)中所描述的。在一个更优选的实施方案中，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或Yarrowia细胞。在最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、 Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是^rrowia Iipolytica细胞。在另一个更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌类”包括所有真菌亚门和卵菌门(如Hawksworth等，1995，同上定义)的丝状形式。丝状真菌的特点在于菌丝体壁由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成。 营养生长是通过菌丝的延长并且碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的芽殖并且碳分解代谢是发酵。在更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是支顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、链孢霉属、青霉属、草根霉属、Tolypocladium或木霉属的细胞，但不只限于此。在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、 硫色键抱、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides 或 Fusarium venenatum 细胞。在甚至最优选的实施方案中，丝状真菌亲本细胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp. nov.)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens, Humicola lanuginosa、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢霉、产紫青霉、Thielavia terrestris、哈茨木霉、康宁氏木霉、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉或绿色木霉细胞。真菌细胞可通过包括原生质体的形成、原生质体的转化和细胞壁再生的方法以已经公知方式转化。适合曲霉属宿主细胞转化的方法在EP238023和^lton等，1984，美国国
20家科学院学报81 :1470-1474中有描述。适合镰孢属转化的方法在Malardier等，1989，基因 (Gene) 78 147-156 和 WO 96/00787 中有描述。酵母可利用 Becker 和 Guarente 在 Abelson， J.N.和Simon，Μ. I.编的酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶学方法(Methods in Enzymology)，194 卷第 182—187 页，Academic Press, Inc.，纽约；Ito等，1983，细菌学杂志153 :163 ；禾口 Hinnen等，1978，美国国家科学院学报75 1920中描述的方法转化。产生方法本发明也涉及产生本发明多肽的方法，其包括(a)培养其野生型能够产生该多肽的菌株；和(b)回收该多肽。优选地，该菌株属于假黑盘菌属，且更优选地为假黑盘菌。本发明也涉及产生本发明多肽的方法，其包括(a)在有益于该多肽产生的条件下培养宿主细胞；和(b)回收该多肽。在本发明的产生方法中，细胞利用本领域公知的方法在适于该多肽产生的营养培养基中培养。例如，细胞可通过摇动培养瓶培养，在实验室或工业发酵罐中于适合的培养基中并在允许多肽表达和/或分离的条件下进行的小规模或大规模的发酵(包括连续的、 分批、补料分批或固体状态的发酵)培养。培养利用本领域公知的方法在包含碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行。合适的培养基可从供货商处购买或根据公开的组合物 (例如，美国典型培养物保藏中心的目录)制备。如果多肽分泌到营养培养基中，可直接从培养基中回收该多肽。如果多肽不分泌，可从细胞裂解物回收。多肽可利用本领域公知的特异于该多肽的方法检测。这些检测方法可包括特异抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，如在此所述酶检测法可用于确定多肽的活性。生成的多肽可通过本领域公知的方法回收。例如，多肽可通过常规方法包括，但不只限于此的，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀从营养培养基中回收。本发明的多肽可通过本领域公知的多种方法纯化，所述方法包括但不限于层析 (例如离子交换层析、亲和层析、疏水的、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如制备型等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如蛋白质纯化 (Protein Purification)，J.-C. Janson禾口Lars Ryden编辑，VCH Publishers，纽约，1989)。植物本发明也涉及用编码本发明的具有抗微生物活性多肽的核苷酸序列转化的以表达和产生可回收量的多肽的转基因植物、植物部分或植物细胞。多肽可从植物或植物部分中回收。备选地，含有重组多肽的植物或植物部分可用于改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、适口性和流变学特性或破坏抗营养因子。回收的多肽、植物或植物部分也可用于改善或改变动物或家畜体内的消化菌群。转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，例如草甸草(蓝草，早熟禾属(Poa))；饲料草如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草如剪股颖属(Agrostis)和谷物例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱和玉米。双子叶植物的实例是烟草、马铃薯、甜菜、如羽扇豆、豌豆、菜豆和大豆的豆科植物和如花椰菜、油菜籽的十字花科植物(芸苔科(Brassicaceae))和紧密相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎。特定植物组织如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和胞质也被认为是植物部分。进一步地，任何植物细胞，无论其组织来源都被认为是植物部分。在本发明的范围内也包括这些植物、植物部分和植物细胞的后代。表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可根据本领域公知的方法构建。简而言之，植物或植物细胞通过将编码本发明多肽的一种或多种表达构建体整合到植物宿主基因组中并繁殖所得到的经修饰植物或植物细胞成为转基因植物或植物细胞。一般，表达构建体是包含被可操作地连接到适合在选择的植物或植物细胞中表达该核苷酸序列所需要的调节序列上的编码本发明多肽的核苷酸序列的核酸构建体。进一步地，表达构建体可包含用于鉴定宿主细胞中表达构建体已被整合的选择性标记和将该构建体导入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所使用的DNA导入方法)。调节序列如启动子和终止子序列以及任选地信号或转运序列的选择，是根据例如多肽何时、何处以及怎样按需表达确定的。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或可诱导的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，或该基因产物可靶向特异组织或植物部分如种子或叶片。调节序列如Tague等，在1988，植物生理学(Plant Physiology)86 506中描述。对于组成型表达，可使用35S_CaMV启动子(Franck等，1980，细胞(Cell)21: 观5-四4)。器官特异型启动子可以是例如来自如种子、马铃薯块茎和果实的贮藏库组织 (Edwards&Coruzzi, 1990，Ann. Rev. Genet. 24 =275-303)，或来自如分生组织的代谢库组织 (Ito等，1994，植物分子生物学(Plant Mol. Biol. )24 =863-878)的启动子，来自水稻的如谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白启动子的种子特异性启动子OVu等，1998，植物和细胞生理学(Plant and Cell Physiology) 39 :885-889)，来自豆球蛋白 B4 和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白质基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，植物生理学杂志(Journal of Plant Physiology) 152 :708-711),来自种子油体蛋白质的启动子(Chen等，1998，植物和细胞生理学39 :935-941)，来自Bressica napus的贮藏蛋白napA启动子，或如WO 91/14772中描述的本领域公知的其他任何种子特异性启动子。进一步地，启动子可以是叶片特异性启动子如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，植物生理学102 991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，植物分子生物学沈:85-93)，或来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，分子和普通遗传学 (Molecular and General Genetics) 248 :668-674)，或如番茄pin2 启动子的愈伤可诱导启动子(Xu等，1993，植物分子生物学22 =573-588)。启动子增强元件也可被使用以在植物中获得酶的较高表达。例如启动子增强元件可以是置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如Xu等，1993，同上公开了利用水稻肌动蛋白1基因的第一内含子增强表达。选择性标记基因和表达构建体的任何其他部分可从本领域适用的那些中选择。核酸构建体根据本领域公知的常规技术整合到植物基因组中，包括农杆菌-介导的转化、病毒-介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物弹射击转化和电穿孔(fesser等， 1990，科学 244 1293 ；Potrykus，1990，生物 / 技术(Bio/technology) 8 535 ；Shimamoto 等，1989，自然(Nature) 338 :274)。目前，根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移是选择用于产生转基因双子叶植物的方法(综述参见Hookyas和khilperoort，1992，植物分子生物学 19 :15-38)。但是它也可用于转化单子叶植物，虽然对于这些单子叶植物而言其他转化方法是常规优选的。目前，生成转基因单子叶植物选择的方法是胚愈伤组织或发育胚的粒子轰击(用转化DNA包被的粒子金或钨颗粒)(Christou，1992，植物杂志(Plant Journal) 2 275-281 ；Shimamoto,1994, Current Opinion Biotechnology 5 :158-162 ；Vasil 等，1992， 生物/技术10 =667-674)。转化单子叶植物的备选方法是如Omirulleh等，1993，植物分子生物学21 =415-428所描述的基于原生质体转化的方法。转化后，其中已含有整合的表达构建体的转化体根据本领域公知的方法选择并再生为完整植株。本发明也涉及产生本发明多肽的方法，其包括(a)在有益于该多肽产生的条件下培养包含编码本发明有抗微生物活性多肽的核苷酸序列的转基因植物或植物细胞，和(b) 回收该多肽。组合物在更进一步的方面，本发明涉及包含本发明抗微生物多肽的组合物，如药物组合物。该组合物可包含作为主要多肽成分的本发明多肽，例如单一成分组合物。备选地， 该组合物可包含多重酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质霉、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。该组合物可进一步包含另一种药学活性剂，如另一种杀生物剂，诸如显示如上文定义的抗微生物活性的另一种抗微生物多肽。杀生物剂可以是本领域公知的抗生素。抗生素的分类包括例如青霉素G、青霉素V、甲氧苯青霉素、苯甲异唑青霉素、羧苄青霉素、乙氧萘青霉素、氨苄青霉素等的青霉素类；青霉素与内酰胺酶抑制剂的结合，头孢菌素例如氧头孢菌素、唑啉头孢菌素、头孢氨呋肟、拉氧头孢等；碳青霉烯类、单菌霉素类、氨基糖苷类、四环素类；大环内酯类；林可霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮类；氯霉素；甲硝唑； 壮观霉素；甲氧苄啶；万古霉素等。杀生物剂也可以是抗真菌剂，包括例如两性霉素B、制霉菌素的多烯类；5-flucosyn ；和例如咪康唑(miconazol)、酮康唑、依曲康唑和氟康唑的唑类。在一个实施方案中，杀生物剂是非酶化学试剂。在另一个实施方案中，杀生物剂是非多肽化学试剂。该杀生物剂能够在其25% (w/w)的水溶液中，优选在10% (w/w)的水溶液中，更优选在5% (w/w)的水溶液中，甚至更优选在(w/w)的水溶液中，最优选在0.5% (w/w) 的水溶液中，以及特别地在含0.1% (w/w)杀生物剂的水溶液中，于20°C温育30分钟后，减少大肠杆菌(DSM 1576)活细胞的数量至1/100。该杀生物剂也能够当其以IOOOppm的浓度加入，优选当其以500ppm的浓度加入，更优选当其以250ppm的浓度加入，甚至更优选当其以IOOppm的浓度加入；最优选当其以 50ppm的浓度加入，以及特别的当其以25ppm的浓度加入微生物生长的培养基时，于25°C抑制大肠杆菌(DSM 1576)的生长晕M小时。该杀生物剂能够在其25% (w/w)的水溶液中，优选在10% (w/w)的水溶液中，更优选在5% (w/w)的水溶液中，甚至更优选在(w/w)的水溶液中，最优选在0.5% (w/w) 的水溶液中，以及特别地在含0.1% (w/w)杀生物剂的水溶液中，于20°C温育30分钟后，减少枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)活细胞的数量至1/100。该杀生物剂也能够当其以IOOOppm的浓度加入，优选当其以500ppm的浓度加入， 更优选当其以250ppm的浓度加入，甚至更优选当其以IOOppm的浓度加入；最优选当其以 50ppm的浓度加入，以及特别地当其以25ppm的浓度加入微生物生长的培养基时，于25°C抑制枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)的生长晕M小时。可对组合物中本发明的抗微生物多肽和杀生物剂进行选择以获得协同抗微生物效果。可对组合物中本发明的抗微生物多肽和杀生物剂进行选择以使得大肠杆菌(DSM 1576)活细胞的数量在含有50% w/w (优选25% w/w，更优选10% w/w，最优选5% w/w)的杀生物剂和0. 5ppm(优选0. Ippm)抗微生物多肽的水溶液中，于20°C温育10分钟后，与通过将杀生物剂和抗微生物多肽分别单独温育所得到的结果相加，即简单相加效应相比减少量多出至少5% (优选至少10% )。也可对组合物中酶成分和杀生物剂进行选择以使得大肠杆菌(DSM1576)的生长晕在含有500ppm (优选250ppm，更优选lOOppm，最优选50ppm)的杀生物剂和0. 5ppm (优选 0. Ippm)抗微生物多肽的微生物生长培养基中于25°C，与通过将杀生物剂和抗微生物多肽分别单独温育所得到的结果相加，即简单相加效应相比抑制时间长出至少5% (优选至少 10% )。也可对组合物中本发明的抗微生物多肽和杀生物剂进行选择以使得枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)活细胞的数量在含有50% w/w (优选25% w/w，更优选10% w/w，最优选5% w/w)的杀生物剂和0. 5ppm(优选0. Ippm)抗微生物多肽的水溶液中，于20°C温育10分钟后，与通过将杀生物剂和抗微生物多肽分别单独温育所得到的结果相加，即简单相加效应相比减少量多出至少5% (优选至少10%)。也可对组合物中酶成分和杀生物剂进行选择以使得枯草芽孢杆菌(ATCC 66337) 的生长晕在含有500ppm (优选250ppm，更优选lOOppm，最优选50ppm)的杀生物剂和 0. 5ppm(优选0. Ippm)抗微生物多肽的微生物生长培养基中于25°C，与通过将杀生物剂和抗微生物多肽分别单独温育所得到的结果相加，即简单相加效应相比抑制时间长出至少 5% (优选至少10% )。组合物可包含适合的载体材料。组合物也可在当其用作药物时包含能够将本发明抗微生物多肽递送到所需位点的递送载体。组合物可根据本领域公知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。例如，多肽组合物可以是颗粒或微颗粒的形式。组合物中包含的多肽可根据本领域公知的方法稳定化。下面给出本发明多肽组合物优选用途的实例。本发明多肽组合物的剂量和使用该组合物时的条件可根据本领域公知的方法确定。方法和用途本发明也包含抗微生物多肽的多种用途。该抗微生物多肽一般可用于受细菌、真菌、酵母或藻类污染的任何位点。一般，该位点是在如冷却水系统、衣物冲洗水的含水系统， 如开采油、润滑剂、油田等的油系统中，其中微生物需被杀死或者其生长需受控制。但本发明也可用于已知其中抗微生物组合物有用的所有应用中，例如木材保护、橡胶、粘合剂、胶水、纸张、纸板、织物、皮革、塑料、压缝和食品。其他用途包括食品、饮料、化妆品的保存，例如洗液、霜剂、凝胶、油膏、肥皂、香波、 护发剂、止汗剂、除臭剂、漱口剂、隐形眼镜、酶制剂或食品成分。因此本发明的抗微生物多肽可用作消毒剂，例如用在痤疮、眼部或口部感染、皮肤感染的治疗中；用在止汗剂或除臭剂中；用在足浴盐中；用于隐形眼镜、硬表面、牙齿(口腔护理)、伤口、擦伤等的清洁和消毒。通常认为本发明的抗微生物多肽可用于任何硬表面上清洁、消毒或抑制微生物生长。可与本发明的抗微生物多肽有利接触的表面实例是例如奶制品厂、化学或药物加工厂、 公共卫生水系统、油处理厂、纸浆处理厂、水处理厂和冷却塔使用的加工设备的表面。本发明的抗微生物多肽应以能在所讨论的表面上有效清洁、消毒或抑制微生物生长的量使用。进一步地，认为本发明的抗微生物多肽可有利地用于清洁任何种类加工设备的定青洁系统(cleaning in place, C. I. P.) 本发明的抗微生物多肽另外可用于食品加工厂以及为如医院、保育院、餐馆、尤其是快餐店、熟食店等制备或供应食物的任何区域中清洁表面和烹饪器具。它也可用作食品中的抗微生物剂并特别用作奶酪、水果和蔬菜和沙拉条上食物的表面抗微生物剂。它也可用作水性涂料的防腐剂或消毒剂。本发明的抗微生物多肽也用于吃水线的微生物控制，并用于水的消毒，特别是用于工业水的消毒。本发明也涉及本发明抗微生物多肽或组合物作为药物的用途。进一步地，本发明的抗微生物多肽或组合物可用于控制或抗击微生物如真菌或细菌，优选革兰氏阳性细菌的药物的生产。本发明的组合物和抗微生物多肽可用作兽用或人用的治疗剂或预防剂。因此，本发明的组合物和抗微生物多肽可用于兽用或人用治疗剂或预防剂的制备，以用于治疗微生物感染，例如细菌或真菌感染、优选革兰氏阳性细菌感染。特别地，微生物感染可能伴发肺部疾病和性传播疾病，其中所述肺部疾病包括但不限于结核病和囊性纤维化；其中所述性传播疾病包括但不限于淋病和衣原体。本发明的组合物包含有效量的本发明抗微生物多肽。在此所用的术语“有效量”意指包含SEQ ID NO 2的1_40位氨基酸所示的氨基酸序列或其片段或变体的抗微生物多肽足以抑制所讨论的微生物生长的量。本发明也涉及伤口治愈组合物或产品如绷带，医疗设备如导管，并进一步涉及抗头屑护发产品如香波。体外合成本发明的抗微生物多肽可利用本领域公知的常规方法通过体外合成制备。多种商业合成设备都是适用的，例如Applied Biosystem he.、Beckman等的自动化合成仪。通过使用合成仪，天然存在的氨基酸可用非天然氨基酸，特别地用D-异构体(或D-型)例如 D-丙氨酸和D-异亮氨酸、非对映异构体、具有不同长度或官能度的侧链等替换。特定的序列和制备方式将由方便、经济、所需纯度等决定。化学连接可提供给包含适宜官能团的多种肽和蛋白质键合，如氨基用于形成酰胺或形成取代的氨基，例如还原胺化，硫醇基用于硫醚或二硫化物形成，羧基用于酰胺形成寸。如果需要，在合成或表达过程中可将多种基团导入肽，其中所述多种基团允许肽与其它分子或表面的连接。因此半胱氨酸可用于制备硫醚，组氨酸用于连接金属离子复合体，羧基用于形成酰胺或酯，氨基用于形成酰胺等。多肽也可根据常规的重组合成方法分离或纯化。可制备表达宿主的裂解物并用 HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其他纯化技术纯化裂解物。大多数情况下，所用的组合物相对于与产品制备和纯化方法中相关的污染物而言，将包含至少20%重量的所需产品，更通常地至少约75%重量，优选至少约95%重量，而对于治疗目的，通常至少约占 99. 5%重量。通常，该百分比是基于总蛋白的。动物饲料本发明也涉及有抗微生物活性的多肽在动物饲料中使用的方法，并涉及包含本发明多肽的饲料组合物和饲料添加剂。术语动物包括所有动物，包括人类。动物的实例是非反刍动物和反刍动物，例如牛、绵羊和马。在特别的实施方案中，动物是非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物例如猪 (包括但不只限于此，小猪、成长猪和大母猪)；家禽例如火鸡和小鸡(包括但不只限于，适于烤焙的嫩鸡、产卵鸡)；小牛；和鱼(包括但不只限于鲑鱼)。术语饲料或饲料组合物指适于或用于动物摄入的任何化合物、制剂、混合物或组合物。在本发明的用途中，抗微生物多肽可在规定饮食前、后或同时喂饲。优选后者。在一个特别的实施方案中，以一定形式加入饲料或包括在饲料添加剂中时，该抗微生物多肽是被充分定义的。充分定义指该抗微生物多肽制剂通过大小排阻层析(参见WO 01/58275的实施例12)确定为至少50%纯。在其他特别的实施方案中该抗微生物多肽制剂通过该方法确定为至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95%纯。充分定义的抗微生物多肽制品是有利的。例如，它使基本上不受其他抗微生物多肽干扰或污染的该抗微生物多肽在饲料中的用量正确变得容易。术语用量正确特别指获得一致和恒定结果的客观性，并且根据所需要的效果能够得到优化剂量。对于动物饲料中的用途，该抗微生物多肽不必太纯；它可例如包括其他酶，在此情况下它可被定义为抗微生物多肽制剂。抗微生物多肽制剂可(a)直接加入饲料(或直接用于植物蛋白的处理加工)，或 (b)它可用于产生一种或多种中间组合物如饲料添加剂或预混合物，其中所述饲料添加剂或预混合物随后加入饲料(或用于处理加工中)。上述纯化的程度指用于根据上述的(a) 或(b)的原始抗微生物多肽制剂的纯度。具有该等级纯度的抗微生物多肽制剂特别可利用重组方法生产获得，而当该抗微生物多肽是由传统发酵方法生产时它们不容易得到并且成批之间变异很大。该抗微生物多肽制剂当然可与其他酶混合。在此用到的术语植物蛋白指包括至少一种得自或来源自植物蛋白的任何化合物、 组合物、制剂或混合物，其中所述蛋白包括经修饰蛋白或蛋白衍生物。在特别的实施方案中，植物蛋白的含量是至少10、20、30、40、50或60% (w/w)。植物蛋白可来自如豆类和谷物的植物蛋白来源，例如来自豆科(Fabaceae) (Leguminosae)、十字花禾斗(Cruciferaceae)、藜禾斗(Chenopodiaceae)禾口禾本禾斗(Poaceae) 的植物材料，如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。在特别的实施方案中，植物蛋白源是来自豆科的一种或多种植物材料，例如大豆、 羽扇豆、豌豆或菜豆。在另一个特别的实施方案中，植物蛋白源是来自藜科的一种或多种植物材料，例如甜菜、菠菜或奎奴亚藜。其他植物蛋白源的实例是油菜籽和卷心菜。大豆是优选的植物蛋白源。其他植物蛋白源的实例是谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、水稻和高粱。抗微生物多肽可以任何形式加入饲料，只要它是相当纯的抗微生物多肽，或以与其他用于添加至动物饲料的成分混合，即以动物饲料添加剂的形式，如称为动物饲料的预混合料加入。本发明进一步的方面涉及用在动物饲料中的组合物，其中所述动物饲料如动物饲料和动物饲料添加剂例如预混合料。除本发明的抗微生物多肽外，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种脂溶性维生素和/或至少一种水溶性维生素和/或至少一种微量矿物质和/或至少一种大量矿物质。进一步任选的，饲料添加成分是着色剂、芳香化合物、稳定剂和/或至少一种其它的酶，所述酶选自肌醇六磷酸酶EC3. 1.3. 8或3. 1.3. 26 ；木聚糖酶EC3. 2. 1. 8 ；半乳聚糖酶 EC3. 2. 1. 89和/或β -葡聚糖酶EC3. 2. 1. 4的酶。在特别的实施方案中，这些其他酶被充分定义(如上对抗微生物多肽制剂的定义)。其他抗微生物多肽(AMP，s)的实例是CAP18、LeucocinA, Tritrpticin, Protegrin-l、Thanatin> Defensin、Ovispirin 如 Novispirin (Robert Lehrer, 2000)禾口它们保留了抗微生物活性的变体或片段。其他抗真菌多肽(AFP’s)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉的肽，以及在WO 94/01459和PCT/DK02/0(^89 [—旦公开即用WO号替代]中公开的它们保留了抗真菌活性的变体或片段。通常脂溶性和水溶性维生素以及微量矿物质形成用于加入饲料的称为预混合料的一部分，而大量矿物质通常被分开加入饲料。这些组合物类型当被本发明的抗微生物多肽强化时都是本发明的动物饲料添加剂。在特别的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂以0.01-10.0%，更优选 0.05-5.0%或0.2-1.0% 指g添加剂/IOOg饲料)的水平包括(或规定为必须包括) 在动物饮食或饲料中。这特别是对预混合料同样如此。
下列是这些成分实例的非排他性列表脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K、例如维生素K3。水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素Bi、维生素B2、维生素 B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如D-泛酸钙。微量矿物质的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。大量矿物质的实例是钙、磷和钠。这些成分的营养需求(以家禽和小猪/猪为例证)如WO 01/58275表A中所列。 营养需求指这些成分必须按照说明的浓度在食物中提供。备选地，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种WO 01/58275表A中指出的单独成分。至少一种指一种或多种、一种、或两种、或三种、或四种和这样直至所有十三种、或多至所有十五种单独成分。更具体地，该至少一种单独成分以在表A的第四栏或第五栏或第六栏说明的饲料内浓度范围提供的量包括在本发明的添加剂内。本发明也涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或食料具有相对高含量的蛋白质。家禽和猪食料可如WO 01/58275表B中第2-3栏说明的表征。鱼食料可如该表B第4 栏说明的表征。进一步的该鱼食料通常含有200-310g/kg含量的粗脂肪。根据本发明的动物饲料组合物含有50_800g/kg含量的粗蛋白质，并且进一步包含至少一种此处要求专利保护的抗微生物多肽。进一步地，或备选地(对于上述的粗蛋白质含量)，本发明的动物饲料组合物含有 10-30MJ/kg含量的可代谢能量；和/或0. l-200g/kg含量的钙；和/或0. l_200g/kg含量的有效磷；和/或0. l-100g/kg含量的甲硫氨酸；和/或0. l_150g/kg含量的甲硫氨酸加半胱氨酸；和/或0. 5-50g/kg含量的赖氨酸。在特别的实施方案中，可代谢能量、粗蛋白质、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量在WO 01/58275表B中2、3、4或5(R. 2-5)的任一范围内。粗蛋白质以氮(N)乘以系数6. 25计算，即粗蛋白质(g/kg) = N(g/kg) X6. 25。 氮含量通过Kjeldahl方法(Α. 0. Α. C.，1984，分析的正式方法(Official Methods of Analysis)14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC) 确定。可代谢能量可根据NRC出版物猪的营养需求(Nutrient requirements in swine)，第九次再版1988，国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会，National Academy Press,华盛顿特区，第2-6页和家禽饲养材料能量值的欧洲表，Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen,荷兰，Grafisch bedrijf Ponsen&looijen bv, ffageningen. ISBN 90-71463-12-5 计算。完整的动物食料中钙、有效磷和氨基酸的饮食含量根据如Veevoedertab 1 e 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde wan voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg6,8219pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7的饲料表计算。在特别的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有至少一种上述的植物蛋白或蛋白源。在进一步特别的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有0-80 %的玉米；和/或0-80%的高粱；和/或0-70%小麦；和/或0-70%的大麦；和/或0-30%的燕麦；和/ 或0-40%的大豆粉；和/或0-10%的鱼粉；和/或0-20%的乳清。动物食料可生产为如磨碎饲料(非丸粒)或丸粒饲料。一般，研磨的饲料是混合的并根据所讨论种类的特异性加入充足量的必需维生素和矿物质。酶可以固体或液体酶制剂加入。例如固体酶制剂一般在混合步骤前或过程中加入，而液体酶制剂一般在粒化步骤后加入。酶也可被掺入饲料添加剂或预混合料中。食料中酶的终浓度在0.01_200mg酶蛋白/kg食料的范围内，例如在5_30mg酶蛋白/kg动物食料的范围内。抗微生物多肽可以下列一种或多种量(剂量范围)施用0.01-200 ；或0.01-100、 或0. 05-100、或0. 05-50、或0. 10-10，所有这些范围是mg抗微生物多肽蛋白/kg饲料 (ppm)。为了确定mg抗微生物多肽蛋白/kg饲料，将抗微生物多肽从饲料组合物中纯化， 并且纯化的抗微生物多肽的比活性利用相关检测(参见抗微生物活性、底物和检测部分) 确定。饲料组合物的抗微生物活性也利用相同的检测确定，并且根据这两个测定计算mg抗微生物多肽蛋白/kg饲料的剂量。应用相同的原理确定饲料添加剂中的mg抗微生物多肽蛋白。当然如果可获得用于制备饲料添加剂或饲料的抗微生物多肽样品，就从该样品确定比活性(不必从饲料组合物或添加剂中纯化抗微生物多肽)。洗涤剂组合物本发明的抗微生物多肽也可被加入并因此成为洗涤剂组合物的成分。本发明的洗涤剂组合物可以是例如配制作为手洗或机洗衣物的洗涤剂组合物，包括适于预处理染色纤维的洗衣添加组合物和漂洗添加的织物柔顺组合物，或配制为用于常规家庭硬表面清洁操作的洗涤组合物或配制为用于手洗或机洗洗碟操作。在特定的方面，本发明提供了包含本发明抗微生物多肽和表面活性剂的洗涤剂添加剂。该洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可包括一种或多种其他酶，例如蛋白酶、脂肪酶、 角质霉、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(如漆酶)和/或过氧化物酶(如商代过氧化物酶)。通常，所选择酶的特性应该适配于所选择的洗涤剂，(即最适pH，适配于其它酶的或非酶的成分等)，并且该酶应以有效量存在。蛋白酶适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。微生物来源是优选的。化学修饰或蛋白质工程化的突变体也包括在内。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，特别是来自芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶 Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168 (W0 89/06279 中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和WO 89/06270和 WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。有用的蛋白酶的实例是WO 92/19729,WO 98/20115,WO 98/20116 和 WO 98/34946 中描述的变体，特别是在一个或多个下列位点27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、 167、170、194、206、218、222、224、235 和 274 替换的变体。
脂肪酶适合的脂肪酶包括细菌或真菌来源的脂肪酶。化学修饰或蛋白质工程的突变体也包括在内。有用的脂肪酶的实例是来自腐质霉(同物异名词为Thermomyces) 的脂肪酶，例如 EP 258068 和 EP 305216 中描述的来自 H. lanuginosa(T. lanuginosa)或如TO 96/13580中描述的来自H. insolens，假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P. alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P. pseudoalcaligenes) (EP 218272)， 洋葱假单胞菌(P. cepacia) (EP 331376)，施氏假单胞菌(P. stutzeri) (GB 1，372，034)，荧光假单胞菌(P. fluorescens)，假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株 SD705 (W095/06720 和 WO 96/27002)，P. wisconsinensis (W0 96/12012)的脂肪酶，芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993)，生物化学与生物物理学报(Biochemica et Biophysica Acta)，1131，253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B. pumilus) (W0 91/16422)。其他实例是如WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、 WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079 和 WO 97/07202中描述的脂肪酶变体。淀粉酶合适的淀粉酶(α和/或β )包括细菌或真菌来源的淀粉酶。化学修饰或蛋白质工程化的突变体也包括在内。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌获得的α-淀粉酶，如 GB 1，296, 839中详细描述的地衣芽孢杆菌的一个特定菌株。有用的淀粉酶的实例是WO 94/02597,WO 94/18314,WO 96/23873 和 WO 97/43424 中描述的变体，特别是在一个或多个下列位点:15、23、105、106、124、128、133、154、156、 181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408 和 444 替换的变体。纤维素酶适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶。化学修饰或蛋白质工程化的突变体也包括在内。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、草根霉属、支顶孢属的纤维素酶，例如从在US 4，435，307、US 5，648，263, US 5，691，178,US 5，776，757 和 W089/09259 中公开的 Humicola insolens、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢中产生的真菌纤维素酶。特别合适的纤维素酶是具有色彩护理优点的碱性或中性纤维素酶。这些纤维素酶的实例是在 EP 0495257,EP 0531372,WO 96/11262、W096/29397、WO 98/08940 中描述的纤维素酶。其它实例是在例如 WO 94/07998、EP 0531315、US 5，457，046、US 5，686，593、US 5, 763, 254, WO 95/24471, WO 98/12307 和 PCT/DK98/00299 中描述的纤维素酶变体。过氧化物酶/氧化酶适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的酶。化学修饰或蛋白质工程化的突变体也包括在内。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)例如灰盖鬼伞(C. cinereus)的过氧化物酶以及在WO 93/24618, WO 95/10602和WO 98/15257中描述的其变体。这些洗涤剂酶可以通过添加含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加含所有这些酶的组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，也就是独立添加剂或组合添加剂可以制成例如颗粒状、液体、浆状等等。优选的洗涤剂添加剂制剂为颗粒 (特别是无粉尘颗粒)、液体(特别是被稳定化的液体)或浆。无粉尘颗粒可依照例如US 4，106，991和4，661，452所述进行生产并可任选地用本领域已知的方法加包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1000到20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；含有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中，醇含12到20个碳原子且其中存在15到80个环氧乙烷单位；脂肪醇； 脂肪酸；和脂肪酸的单_、二-和三酸甘油酯。GB 1483591中给出了适合于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。液体酶制剂可以例如依照现成的方法通过添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得以稳定。受保护的酶可依照EP 238，216中所公开的方法进行制备。本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如棒状、片状、粉末、颗粒、糊或液体。液体洗涤剂可以是含水的，一般含高达70%的水和0-30%的有机溶剂，或是不含水的。所述的洗涤剂组合物一般包含一种或多种表面活性剂，它们可以是非离子(包括半极性的)和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。所述的表面活性剂一般占到0. 1 %到60 %的重量。当包含在所述洗涤剂中时，洗涤剂通常包含约1 %到约40 %的阴离子表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐、α-烯属磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、 醇乙氧化硫酸盐、仲链烷磺酸盐、α -磺基脂肪酸甲酯、烷基-或链烯基琥珀酸或皂。当包含在所述洗涤剂中时，通常含有约0. 2%到约40%的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。所述的洗涤剂可以包含0-65%的洗涤剂助洗剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层叠式硅酸盐(例如购自Hoechst的SKS-6)。所述的洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂醇酯/丙烯酸共聚物。所述的洗涤剂可以含有漂白体系，所述漂白体系可以包含H2O2来源如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与形成过酸的漂白活化剂如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐相结合。可选择地，所述的漂白体系可以包含例如酰胺、二酰亚胺或砜类的过氧酸。本发明的洗涤剂组合物中的酶可以通过诸如以下的常规稳定剂稳定多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如 4-甲酰基苯基硼酸，且所述的组合物可以按例如W092/19709和WO 92/19708中所述配制。所述的洗涤剂还可以包含其它的常规洗涤剂成分，例如织物调理剂包括粘土、发泡齐 、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污物再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增白剂、增溶剂、晦暗抑制剂或香料。目前认为在所述洗涤剂组合物中任何酶，特别是本发明的酶可以以相当于每升洗涤液中具有0. Ol-IOOmg酶蛋白质，优选每升洗涤液0. 05-5mg酶蛋白质，特别优选每升洗涤液中具有0. I-Img酶蛋白质的量加入。此外，本发明的酶可以额外地添加到如WO 97/07202所公开的洗涤剂制剂中，该文献引入本文作为参考。通过下述的实施例对本发明进行更详细说明，这些实施例不作为对本发明请求保
31护范围的任何限制。 实施例用作缓冲剂和底物的化学品至少是试剂级的商品。实施例1 鉴定来自假黑盘菌的抗微生物多肽材料和方法从在Mex-I培养基上诱导5天的假黑盘菌(P. nigrella)的培养基中制备cDNA文库(国际专利申请W098/38288的实施例中记载的方案)。根据标准的分子生物学方法纯化富含PolyA的RNA，合成cDNA和建立cDNA文库。常规方法的具体方案可在国际专利申请 W001/12794的实施例中找到。用于克隆的载体是pMhas5，其如SEQ ID NO :4中所示并具有下述特性表1载体pMhas5的特性
权利要求
1.具有抗微生物活性的多肽，其由以下氨基酸序列组成(a)与SEQID NO 2的1_40位氨基酸具有至少90%同一性的氨基酸序列；或(b)与SEQID NO 2的1_40位氨基酸最多4个氨基酸不同的氨基酸序列；或(c)与SEQID NO 1的166-285位核苷酸在高严格条件下杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的多肽，其氨基酸序列与SEQID NO 2的1_40位氨基酸具有至少 92%的同一性、至少95%的同一性、或至少97%的同一性。
3.根据权利要求1的多肽，其氨基酸序列与SEQID NO 2的1_40位氨基酸相比，最多 3个氨基酸不同、最多2个氨基酸不同、或最多1个氨基酸不同。
4.多核苷酸，其由编码权利要求1至3中任意一项所述多肽的核苷酸序列组成。
5.核酸构建体，其包含可操作地与一个或多个调控序列连接的权利要求4中所述的核苷酸序列，其中所述调控序列指导所述多肽在合适的宿主中产生。
6.重组表达载体，其包含权利要求5中所述的核酸构建体。
7.重组宿主细胞，其包含权利要求5中所述的核酸构建体。
8.产生如权利要求1-3中任意一项所述的多肽的方法，该方法包括(a)培养菌株以产生该多肽，其中所述菌株在其野生型形式能够产生该多肽；以及(b)回收该多肽。
9.产生如权利要求1-3中任意一项所述的多肽的方法，该方法包括(a)在有益于该多肽产生的条件下培养如权利要求7中所述的重组宿主细胞；以及(b)回收该多肽。
10.抗微生物组合物，其包含如权利要求1-3中任意一项所述的多肽和额外的杀生物剂。
11.杀死或抑制微生物细胞生长的方法，其包括将微生物细胞与权利要求1-3中任意一项所述的多肽接触。
12.洗涤剂组合物，其包含表面活性剂和如权利要求1-3中任意一项所述的多肽。
13.如权利要求1-3中任意一项所述的抗微生物多肽，其用于抗微生物的兽用或人用治疗剂或预防剂的用途。
14.如权利要求1-3中任意一项所述的抗微生物多肽的用途，其用于制备为了治疗微生物感染或预防目的的兽用或人用治疗剂。
15.转基因植物、植物部分或植物细胞，其已经用编码如权利要求1-3中任意一项所述多肽的核苷酸序列转化。
16.至少一种如权利要求1-3中任意一项所述的多肽在动物饲料中的用途。
17.至少一种如权利要求1-3中任意一项所述的多肽在制备用于动物饲料的组合物中的用途。
18.动物饲料添加剂，其包含(a)至少一种如权利要求1-3中任意一项所述的多肽；和(b)至少一种脂溶性维生素，和/或(c)至少一种水溶性维生素，和/或(d)至少一种微量矿物质，和/或(e)至少一种大量矿物质。
全文摘要
本发明涉及来自假黑盘菌的抗微生物多肽，具体的涉及具有抗微生物活性的多肽和具有编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也涉及核酸构建体、载体和包含该核酸构建体的宿主细胞以及产生和使用该多肽的方法。
文档编号A01H5/00GK102250225SQ20111009878
公开日2011年11月23日 申请日期2002年11月20日 优先权日2001年11月20日
发明者D.R.塞古拉, H-H.H.克里斯滕森, K.M.施诺尔, M.T.汗森, P.H.米京德 申请人:诺维信阿德宁生物技术公司