专利名称：一种小豆组织再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及一种小豆组织再生植株的方法，属于生物技术领域，是一种小豆上胚轴组织再生植株的方法。
背景技术：
小豆是东亚重要的经济作物之一，是我国主要食用豆类之一。目前，小豆品种存在多样化程度较低、抗生物和非生物胁迫能力弱等特点，极大的限制了其产业的发展。对于小豆作物来说，目前还没有建立有效的离体培养植株再生体系，限制了分子育种技术在小豆作物遗传改良中的应用。因此，本发明为利用生物技术对小豆进行遗传改良奠定基础。
发明内容
技术问题
本发明所要解决的技术问题是提供一种小豆组织培养再生植株的方法。技术方案
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。一种小豆组织再生植株的方法，包括以下步骤
(1)选择饱满无瑕疵的种子，用洁净的吸水纸擦拭干净种子表面的灰尘；然后将擦拭好的种子放入事先准备好的烧杯中，加入灭菌过的超纯水清洗2次，每次30秒，用灭菌滤纸充分吸水将水控干；然后加入75%乙醇消毒1分钟，之后用灭菌过的超纯水清洗2-3次，每次30秒，将水控干；然后加入质量比5%次氯酸钠浸泡30分钟，之后用灭菌过的超纯水清洗 5-6次，每次1分钟，将水控干；再将干燥种子接种到萌发培养基的平板中，进行萌发培养；
(2)将上述消毒后的无菌小豆种子接种于萌发培养基GM=MS基本培养基，pH值5. 8中萌发，每个培养皿接种15-20粒的小豆种子，转至光照培养箱；培养6-7天后，用手术刀片将小豆上胚轴至第一个茎节之间的组织切成Icm长的片段，并放入培养皿中备用；
(3)将切好的小豆上胚轴外植体转入芽诱导培养基SI=MS + 6-BA 5 mg/L + Cef (头孢霉素)200 mg/L，pH值5. 7中选择培养，连续诱导，每两周继代一次；
(4)再将诱导出芽的小豆上胚轴外植体转移到芽伸长培养基SE:MS + Cef 200mg/L + Zeatin-ribocide (玉米素)1 mg/ L + IAA 0. 1 mg/L+GA3 0.5 mg/L + Asp (天冬氨酸)50 mg/L + Glu (谷氨酸)50 mg/L，pH值5. 7中选择培养，每两周继代一次；
(5)待丛生芽生长至3-5cm时，切下丛生芽转移至生根培养基RM:MS + Cef 50 mg/L + NAA 1 mg/L + Asp 50 mg/L + Glu 50 mg/L, pH 值 5. 7 中生根，至丛生芽产生 2-3 个主根时，打开培养瓶的盖子，在组培培养室逐渐炼苗；3-5天后将苗的根部培养基洗干净，转入蛭石中生长2周，蛭石中含Hoagland营养液，然后将成活的组培苗移栽至装有营养土的盆钵中。以后注意浇水等管理，待植株成熟后单株收获种子；
上述的培养条件温度为25°C，光照强度为3000LX，每天的光照培养条件是光培养 16h和暗培养》1。
有益效果
采用本发明的培养方法，组织再生率高，生根率达100%，其苗与种子苗基本没有差异， 茎杆粗壮，叶色浓绿，长势良好。
具体实施例方式一种小豆组织再生植株的方法，包括以下步骤
1)获取无菌种植苗选择饱满无瑕疵的小豆品种“苏红1号”(苏鉴小豆201101，江苏省农业委员会鉴定公布)的种子，用洁净的吸水纸擦拭干净种子表面的灰尘；然后将擦拭好的种子放入事先准备好的烧杯中，加入灭菌过的超纯水清洗2次，每次30秒，用灭菌滤纸充分吸收以使种子干燥将水控干；然后加入75%乙醇消毒1分钟，之后用灭菌过的超纯水清洗2-3次，每次30秒，将水基控干；然后加入5%次氯酸钠浸泡30分钟，之后用灭菌过的超纯水清洗5-6次，每次1分钟，将水控干；然后可以接种到萌发培养基的平板中，进行萌发培养。2)上胚轴外植体的制备将上述消毒后的无菌小豆种子接种于GM培养基(MS基本培养基，PH值5. 8)中萌发，每个培养皿接种15-20粒的小豆种子，转至光照培养箱。培养条件为25°C，光培养16个小时，暗培养8个小时。培养6-7天后，用手术刀片将小豆上胚轴至第一个茎节之间的组织切成Icm左右长的片段，并放入培养皿中备用。3)丛生芽的诱导将切好的小豆上胚轴外植体转入芽诱导培养基SI (MS + 6-BA 5 mg/L + Cef 200 mg/L，pH值5. 7)中选择培养，连续诱导，每两周继代一次。4)丛生芽的伸长将诱导出芽的小豆上胚轴外植体转移到芽伸长培养基SE (MS + Cef 200mg/L + Zeatin-ribocide 1 mg/ L + IAA 0. 1 mg/L+GA3 0. 5 mg/L + Asp 50 mg/ L + Glu 50 mg/L, pH值5. 7)中选择培养，每两周继代一次。5)生根和移栽待丛生芽生长至3-5cm时，切下丛生芽转移至生根培养基RM (MS + Cef 50 mg/L + NAA 1 mg/L + Asp 50 mg/L + Glu 50 mg/L, pH 值 5. 7)中生根。至丛生芽产生2-3个主根，根系有一定发达时，打开培养瓶的盖子，在组培培养室逐渐炼苗。3-5 天后将苗的根部培养基洗干净，转入蛭石中生长2周左右，蛭石中含Hoagland营养液，然后将成活的组培苗移栽至装有营养土的盆钵中。以后注意浇水等管理，待植株成熟后单株收获种子。采用本发明的培养方法，组织再生率高，生根率达100%，其苗与种子苗基本没有差异，茎杆粗壮，叶色浓绿，长势良好。
权利要求
1. 一种小豆组织再生植株的方法，包括以下步骤(1)选择饱满无瑕疵的小豆种子，用洁净的吸水纸擦拭干净种子表面的灰尘；然后将擦拭好的种子放入事先准备好的烧杯中，加入灭菌过的超纯水清洗2次，每次30秒，用灭菌滤纸充分吸水将水控干；然后加入75%乙醇消毒1分钟，之后用灭菌过的超纯水清洗2-3次， 每次30秒，将水控干；然后加入质量比5%次氯酸钠浸泡30分钟，之后用灭菌过的超纯水清洗5-6次，每次1分钟，将水控干；再将干燥种子接种到萌发培养基的平板中，进行萌发培养；(2)将上述消毒后的无菌小豆种子接种于萌发培养基GM=MS基本培养基，pH值5. 8中萌发，每个培养皿接种15-20粒的小豆种子，转至光照培养箱；培养6-7天后，用手术刀片将小豆上胚轴至第一个茎节之间的组织切成Icm长的片段，并放入培养皿中备用；(3)将切好的小豆上胚轴外植体转入芽诱导培养基SI=MS + 6-BA 5 mg/L + Cef 200 mg/L, pH值5. 7中选择培养，连续诱导，每两周继代一次；(4)再将诱导出芽的小豆上胚轴外植体转移到芽伸长培养基SE=MS + Cef 200mg/L + Zeatin-ribocide 1 mg/ L + IM 0. 1 mg/L+GA3 0. 5 mg/L + Asp 50 mg/L + Glu 50 mg/ L，pH值5. 7中选择培养，每两周继代一次；(5)待丛生芽生长至3-5cm时，切下丛生芽转移至生根培养基RM:MS + Cef 50 mg/L + NAA 1 mg/L + Asp 50 mg/L + Glu 50 mg/L, pH 值 5. 7 中生根，至丛生芽产生 2-3 个主根时，打开培养瓶的盖子，在组培培养室逐渐炼苗；3-5天后将苗的根部培养基洗干净，转入蛭石中生长2周，蛭石中含Hoagland营养液，然后将成活的组培苗移栽至装有营养土的盆钵中；以后注意浇水等管理，待植株成熟后单株收获种子；上述的培养条件温度为25°C，光照强度为3000LX，每天的光照培养条件是光培养 16h和暗培养》1。
全文摘要
本发明公开的一种小豆组织再生植株的方法，属于生物技术领域，包括获取无菌种子苗、外植体的制备、丛生芽的诱导、芽伸长、生根培养等步骤。培养时所使用的萌发培养基是MS固体基本培养基；丛生芽诱导培养基添加6-BA、Cef；芽伸长培养基添加Cef、Zeatin-ribocide、IAA、GA3、Asp和Glu；生根培养基添加Cef、NAA、Asp和Glu。采用本发明的培养方法，组织再生率高，生根率达100%，其苗与种子苗没有显著差异，长势良好。
文档编号A01H4/00GK102150622SQ201110107688
公开日2011年8月17日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者崔晓艳, 张红梅, 袁星星, 陈华涛, 陈新, 顾和平 申请人:江苏省农业科学院