专利名称：大熊猫精液冷冻保存液及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料保存技术领域，具体涉及大熊猫精液冷冻保存液及其制备方法。
背景技术：
大熊猫是我国的特有种，属世界濒危珍稀动物，截至2004年结束的第三次全国大熊猫种群数量调查，虽然大熊猫野外种群数量由上世纪80年代的1100余只上升到1590余只，但依然没有摆脱濒危的境地。经过多年的努力，我国大熊猫圈养繁殖水平有了很大提高，至2008年底，圈养种群数量已达到268只。但是，如何避免近亲繁殖已成为大熊猫圈养繁育必须面对的问题。通过对大熊猫精液保存技术研究，可以使遗传性能好的雄性个体的精液得以长期保存，从而为大熊猫人工授精繁育的开展奠定了基础，同时为减缓因近交和遗传漂变所造成大熊猫种群遗传多样性降低的速度，提高大熊猫繁殖性能、扩大种群数量等有着重要意义。近年来，成都大熊猫繁育基地进行了大熊猫精液冷冻保存液的研究，获得的冷冻保存液配方为20%卵黄、12%蔗糖、5%甘油及少量ATP，用该保存液进行大熊猫精液的冷冻保存，解冻后进行精子活力检查，平均为55. 79% (侯蓉等，2005.大熊猫细管冻精制备程序的建立与应用.中国兽医学报，25C3))。本发明人按照该配方和方法进行多次冷冻保存实验，解冻后精子活力平均为36. 56%，远低于报道中的效果。所以，至今该保存液并没有在大熊猫精液冷冻保存中得到应用。目前，大熊猫人工繁育中的精液冷冻保存，包括成都大熊猫繁育基地、卧龙大熊猫研究中心以及北京动物园等，均采用美国Irvine kientific公司生产的TEST保存液完成。用TEST保存液在冷冻保存解冻后的精子活力为40 60% (黄炎等.2000.大熊猫电刺激采精及精液冷冻保存研究.四川师范学院学报(自然科学版)，21 (3)；黄炎等.2000. 大熊猫精液的保存实验.中国兽医杂志，26(6))，经冷冻后的精液可以在液氮中保存20 60年。采用TEST保存液进行大熊猫精液的冷冻保存，虽然解冻后的精子活力达到了人工授精要求，但是存在有以下问题①其配方不公开，国内没有生产、购买不方便，而且价格昂贵，每盒(5ml χ 20瓶)7000元；②保质期短，在-10°C条件下保存期小于1年。由于大熊猫是季节性发情、每年一次，且发情期持续短，每年采精进行冷冻保存时，需提前订货购买TEST保存液，当年剩存的TEST保存液在来年无法使用。另外，冷冻保存液是大熊猫人工繁育中的基础试剂，需求量比较大，又是含有蛋白质的营养试剂，以进口方式并进行长时间保存，对于精液的即时冷冻保存会造成影响，也给工作带来不便。所以，冷冻保存液采用现配现用方式的效果最好。
发明内容
针对现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种大熊猫精液冷冻保存液及
3其制备方法，使该保存液在解冻后的精子活力满足人工授精要求的前提下，成本低廉、制备方法简单，可以现配现用，实现精液的即时保存。本发明所提供的大熊猫精液冷冻保存液按IOOml配制，其组成配比为葡萄糖4 6g、果糖4 6g、柠檬酸三钠0. 05 0. 15g、卵黄15 18ml、丙三醇6 7ml、以及青霉素和链霉素各0. 5万IU 2万IU，余量为双蒸水。所述冷冻保存液的优化配比为葡萄糖5g、果糖5g、柠檬酸三钠0. lg、卵黄16ml、 丙三醇6. 7ml、以及青霉素和链霉素各1万IU，余量为双蒸水。由于大熊猫精液呈弱碱性， pH在7. 2 7. 5，以个体不同有所差异，为避免酸碱度变化对精子的影响，所述冷冻保存液的PH为7.4。本发明冷冻保存液中，葡萄糖、果糖和卵黄为精子的代谢提供能量，因为在冷冻过程中和解冻后精子都需要能量维持自身的新陈代谢；柠檬酸三钠是维持保存液中适当的渗透压和电解质平衡，以保证精子内外的渗透压平衡，其还具有缓冲作用，可以中和精子代谢产生的酸，防止PH的改变；由于冷却过程中的精液要从体温降至4 5°C，并需平衡一段时间，卵黄中的卵磷脂可以保护精子免受伤害；在冷冻和解冻的操作中，精子内的组织液和精液液体都要经历由液态到固态的变化，会出现冰晶状态，丙三醇能够保护精子免受冰晶的伤害；青、链霉素主要是控制操作过程中的微生物污染。所述大熊猫精液冷冻保存液的制备方法为，根据制备量按上述比例称、量各组分， 将固体组分用双蒸水溶解，再加入溶解后的青霉素和链霉素溶液，混合均勻，然后吸取鲜卵黄加至混合液中搅拌均勻，再将丙三醇加入混合液中搅拌均勻，余量用双蒸水补足，充分混合均勻，置于4 5°C保存备用。由于制备操作的环境条件原因，本发明在冷冻保存液中加入青霉素和链霉素，目的是抑制环境带来的有害细菌污染，但其也会对精子造成一定伤害，若在无菌条件下或清洁实验室进行操作配制，完全可以不加青霉素和链霉素，从而使精子免受抗生素的伤害。所述大熊猫精液冷冻保存液的使用方法为，先把获取的精液移入带盖的离心管中，按1 1比例加入冷冻保存液，缓慢摇动使其充分混勻，在镜检后活力达到输精要求，即放入4 5°C冰箱中平衡3小时以上，平衡结束后再次镜检，活力达到输精要求后倒管，封口后做标记，最后置入液氮罐中长期保存。在人工授精使用时，将冻存管从液氮罐中取出，于 37°C温水中解冻1分钟，剪开冻存管即可用于人工授精，同时进行精子活力检查。采用本发明冷冻保存液对大熊猫精液进行冷冻保存，解冻后精子的活力符合人工授精的要求，平均活力> 58 %，最高为65 %，检测方法采用侯蓉等，2005.大熊猫细管冻精制备程序的建立与应用.中国兽医学报，25(3)的方法。由于冷冻保存液含有蛋白质，容易受环境的变化而变性。而本发明最重要的是可以按照需要量现配现用，不用担心冷冻保存液的变性；其制备方法简便，一人在15分钟内即可完成。目前，陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心一直在采用本发明的冷冻保护液对遗传性能好的雄性大熊猫的精液进行低温冷冻保存，并使用冻存精液进行人工授精，开展大熊猫的抢救繁育工作，取得了很好的效果。与美国TEST保存液相比，本发明的冷冻保存液所需的试剂和原料取材方便、价格便宜，配制IOOmL冷冻保存液的成本约50元，并且制备方法简便，可以现配现用，实现精液的即时保存；置于4 5°C可保存1周，在-10°C条件下保存1月以上；冷冻后的精液在液氮中可保存50年以上。为大熊猫人工授精提供符合要求的精液，使大熊猫人工繁育和精液长期保存的成本大大降低，对于提高大熊猫繁殖性能、扩大种群数量都具有重要意义。
具体实施例方式为了保证本发明技术方案的可比性和检测结果的一致性，以下实例中精子活力检测方法均采用“侯蓉等，2005.大熊猫细管冻精制备程序的建立与应用.中国兽医学报， 25(3)，，的检测方法，由相同人员进行具体操作。实施例1、按IOOml配制称、量葡萄糖4g、果糖6g、柠檬酸三钠0. lg、卵黄15mL、 丙三醇6mL、青霉素和链霉素各1万IU，余量为双蒸水。先将固体组分用适量双蒸水充分溶解，再用注射器加入溶解后的青霉素和链霉素溶液，混合均勻；用移液管吸取新鲜卵黄加至混合液中搅拌均勻，再用移液管将丙三醇加入混合液中搅拌均勻，用双蒸水补足100ml，充分混合均勻，置于4 5°C冰箱保存备用。以该冷冻保存液对圈养秦岭大熊猫精液进行冷冻保存，解冻后精子的活力平均为 60%。主要原因卵黄含量低，使精子从体温降至5°C的过程中卵磷脂和脂蛋白的量不够， 导致部分精子遭受低温的伤害；丙三醇含量低，没有足够渗入精子内部，从而在低温冷冻过程中，使得精子内液体形成了冰晶物质，导致部分精子受到冰晶破坏。2007年，用该冷冻保存液对一只7岁龄雄性大熊猫的精液进行冷冻保存，1月后解冻检查活力为56%，冻存13个月后检查活力仍为56%，用该精液对一只发情的雌性秦岭大熊猫进行人工授精，该大熊猫成功受孕。实施例2、按200ml配制称、量葡萄糖10g、果糖10g、柠檬酸三钠0. 2g、卵黄32mL、 丙三醇13. 4mL、青霉素和链霉素各2万IU，余量为双蒸水。先将固体组分用适量双蒸水充分溶解，再用注射器加入溶解后的青霉素和链霉素溶液，混合均勻；用移液管吸取新鲜卵黄加至混合液中搅拌均勻，再用移液管将丙三醇加入混合液中搅拌均勻，用双蒸水补足200ml， 充分混合均勻，置于4 5°C冰箱保存备用。以该冷冻保存液对圈养秦岭大熊猫精液(30余份)进行冷冻保存，解冻后检测精子活力平均为65%。用该冷冻保存液对采集到的大熊猫精液进行冷冻保存操作，分别解冻后，对发情期的雌性秦岭大熊猫进行了人工授精，成功繁育大熊猫4胎6仔2008年繁育1 胎2仔；2009年繁育2胎3仔；2010年繁育1胎1仔。实施例3、按IOOml配制称、量葡萄糖5g、果糖5g、柠檬酸三钠0. 15g、卵黄18mL、 丙三醇7mL、青霉素和链霉素各1万IU，余量为双蒸水。先将固体组分用适量双蒸水充分溶解，再用注射器加入溶解后的青霉素和链霉素溶液，混合均勻；用移液管吸取新鲜卵黄加至混合液中搅拌均勻，再用移液管将丙三醇加入混合液中搅拌均勻，用双蒸水补足100ml，充分混合均勻，置于4 5°C冰箱保存备用。以该冷冻保存液对圈养秦岭大熊猫精液进行冷冻保存，解冻后精子的活力平均为 58%。主要原因是缓冲物柠檬酸三钠含量高，导致PH值偏高；卵黄含量高，使部分精子产生聚集现象，影响精子的直线运动；丙三醇含量高，对精子的毒害超过了保护作用，导致部分精子顶替蛋白遭到破坏，从而造成了精子活力的降低。2008年，用该冷冻保存液对一只23岁雄性大熊猫的精液进行冷冻保存，冻存20天后检查活力为58%，冻存1年后检查活力仍为58%。2009年用该精液对一只发情的雌性大熊猫进行人工授精，该大熊猫成功受孕。
权利要求
1.一种大熊猫精液冷冻保存液，其特征在于，按IOOml配制其组成配比为葡萄糖4 6g、果糖4 6g、柠檬酸三钠0. 05 0. 15g、卵黄15 18ml、丙三醇6 7ml、以及青霉素和链霉素各0. 5万IU 2万IU，余量为双蒸水。
2.根据权利要求1所述的冷冻保存液，其特征在于，按IOOml配制其组成配比为葡萄糖5g、果糖5g、柠檬酸三钠0. lg、卵黄16ml、丙三醇6. 7ml、以及青霉素和链霉素各1万IU， 余量为双蒸水；冷冻保存液的PH为7. 4。
3.制备权利要求1所述大熊猫精液冷冻保存液的方法，其特征在于，按所述比例称、量各组分，将固体组分用双蒸水溶解，再加入溶解后的青霉素和链霉素溶液混合均勻，然后吸取鲜卵黄加至混合液中搅拌均勻，再将丙三醇加入混合液中搅拌均勻，余量用双蒸水补足， 充分混合均勻，置于4 5°C保存。
全文摘要
一种大熊猫精液冷冻保存液及其制备方法，本发明采用葡萄糖、果糖、柠檬酸三钠、卵黄、丙三醇以及双蒸水配制；先将固体组分溶解后，再加入液体组分充分混合均匀而成。采用本发明的冷冻保存液对大熊猫精液冷冻保存，解冻后精子的活力符合人工授精的要求，平均活力≥58％，最高为65％；与美国TEST保存液相比，所需的试剂和原料取材方便、价格便宜，配制100mL冷冻保存液的成本约50元，并且制备方法简便，可以现配现用，实现精液的即时保存；冷冻后的精液在液氮中可保存50年以上。为大熊猫人工授精提供符合要求的精液，使大熊猫人工繁育和精液长期保存的成本大大降低，对于提高大熊猫繁殖性能、扩大种群数量都具有重要意义。
文档编号A01N1/02GK102246744SQ201110112099
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月3日 优先权日2011年5月3日
发明者吴晓民, 封托, 车利峰, 金学林, 马清义 申请人:陕西省动物研究所