专利名称：重组黑曲霉单宁酶及其表达和纯化方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及重组黑曲霉单宁酶及其在大肠杆菌中的表达、纯化，以及重组黑曲霉单宁酶的应用。
背景技术：
单宁是植物的次级代谢产物，相对分子质量在500 3000 Da,是一种水溶性聚酚，根据结构和特性，通常分为缩合单宁、复合物单宁和水解单宁三类，也有人将其分为四类，即缩合单宁、复合物单宁、没食子酸单宁和鞣花单宁。单宁广泛存在于植物的根、叶、 果实和种子当中。单宁广泛存在于食品和饲料中，是食品尤其是饲料中的主要抗营养因子之一。单宁的抗营养作用主要有三个方面。(1)单宁可以与蛋白质发生多种交联反应， 与口腔起润滑作用的糖蛋白结合，形成不溶物，产生涩味，影响动物的食欲；(2)抑制单胃动物体内胰蛋白酶、淀粉酶等多种消化酶的活性，从而降低饲料中营养物质的消化率；(3) 与蛋白质形成络合物，影响蛋白质的消化和吸收。单宁与蛋白质复合物(Tannin Protein Complex)在哺乳动物肠道中，难以被蛋白酶等分解，排出体外，增加氮的排泄量。在水溶液清凉茶饮料的生产中，茶中富含的单宁引起茶乳沉淀。单宁与啤酒和果汁中的蛋白质生成沉淀，会引起产品混浊。在食品、饮料、禽畜饲料的生产中必须去除不必要的单宁成分。用单宁酶降解多余的单宁，是一种有广泛应用前景的工艺。单宁是多种植物性饲料的主要组分，能够抑制许多微生物的生长，抵抗微生物的生物降解。但一些微生物对单宁有抗性，这些微生物通过各种机制和方法降解单宁。 Knudson分离到黑曲霉(Aspergillus niger)及青霉(Penicillum sp.)具有降解单宁酸的作用，首次对单宁发酵降解进行研究。之后，单宁降解菌的研究逐步增多，Pourrat等 (1987)筛选到一株能分泌单宁酶的黑曲霉，用此菌水解西西里漆树ahus coriaria L) 中的没食子酸单宁。Oswa等(2000)从人的肠道微生物和食品中首次分离到具有单宁降解功能的乳酸杆菌，分别是植物乳酸杆菌(L^tohciBm /^hter )、类植物乳酸杆菌 (^Lactobacillus paraplantaruin)^ 1 H L St If lif ^Lactobacillus pentosus\ Bhat 等 (1996)从采食橡树叶的hill cattle粪便里面，分离到一株能降解单宁-蛋白质复合物的漂曲毒。单宁酶，也称单宁酰基水解酶(EC3. 1. 1. 20)，是一种能够降解水解单宁中酯和缩酚酸之间的链接键，形成没食子酸和葡萄糖。单宁酶是单宁生物降解的关键酶。单宁酶的研究始于20世纪60年代。先后从米曲霉和黑曲霉，念珠菌中分离纯化到单宁酶。也从某些细菌培养液中分离单宁酶。单宁酶在工业生产中用途广泛，日益受到人们的关注。在食品工业，如茶、啤酒、果汁等制作过程发挥重要作用。在制革工业、化妆品、制药行业也有重要意义。在饲料工业中， 添加单宁酶可减少单宁的不良影响，提高饲料的利用率
发明内容
本发明的一个目的是公开了一种重组黑曲霉单宁酶及其编码基因。本发明的另一个目的是公开了重组黑曲霉单宁酶的表达及其纯化方法。本发明的还一个目的是公开了重组黑曲霉单宁酶在工业生产中的应用。为实现上述目的本发明公开了如下的技术方案
一种重组表达的黑曲霉单宁酶，其特征在于黑曲霉单宁酶编码的基因核苷酸序列如 NOl所示；其所对应的氨基酸序列如N02所示。本发明所述黑曲霉单宁酶的表达方法，它是通过表达载体pET3h-Tan在大肠杆菌菌株BL21中采用IPTG进行诱导表达，采用裂解法释放单宁酶后进行纯化得到重组黑曲霉单宁酶。其中所述的纯化为采用5 mL Ni-NTA柱纯化蛋白，50 mL NPI-10平衡柱子，流速为5 mL/min ；加入蛋白粗提物，流速为2 mL/min,50 mL NPI-20洗脱杂蛋白，流速为5 mL/ min,30 mL NPI-250洗脱单宁酶蛋白，流速为1 mL/min，收集各步洗脱液，SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。本发明进一步公开了重组表达的黑曲霉单宁酶，消除植物性饲料中的单宁，降低其其对单胃动物体内胰蛋白酶、淀粉酶等消化酶的抑制，提高饲料中营养物质的消化率。本发明所用黑曲霉菌株自主从霉变葡萄中分离得到，该菌株由自主分离得到，菌株由中国科学院微生物研究所鉴定为黑曲霉，相关文章已经发表(《饲料工业》， 2011，32 ( 28- ，菌种鉴定结果有中国科学院微生物研究所出具的正式报告)。本发明首次从该菌株中分离到单宁酶基因，所分离的单宁酶核苷酸序列与前人公开的序列不同，单宁酶氨基酸序列是一个新的序列。通过Blast比对，与相似性最高的核苷酸序列和氨基酸序列不同点如下
“_”前是本研究克隆到的基因碱基位点，“_”后是GenBank序列号XM_00140M49的序列相应碱基。(6T-219C,15T-228C,33G-246C,54G-267A,78C-291T,81C-294T,90T-303C, 102T-315C,126G-339C,168C-381G,171C-384T,177G-390C,180C-393T,210T-323C, 219C-432T,222C-435T,225C-438G,258T-471A,268T-481A,269C-482G,282T-494G, 288A-501G,295C-508A,318T-531C,321T-534C,330T-543C,346C-559A, 351T-564C, 405C-618T，435C-648T，460A-673T,483T-697C,498T-712C,516C-730T,537A-750G, 586C-799G,600T-813C,606C-819T,621T-834C,639C-852T,648C-861T,651C-864T, 654T-867C，669C-882T，681G-894A，702T-915C，717T-930C,720T-933C,731C-944A, 736T-949C,748C-961T,771T-984C,774G-987A,781G-994A,783T-996C,786C-999T, 810T-1023C,831T-1044C,858T-1071C,868T-1081G,870T-1083C,879C-1092G, 888C-1101T, 930T-1143C, 966C-1179T,969C-1182T,972T-1185C,987T-1200C,990C-1203T, 1014T-1227G,1032T-1245C，1038T-1251C，1054A-1267C，1087A-1300C，1101C-1314T， 1119C-1332T,1143C-1356G,1170A-1383G,1174T-1387C,1201A-1414T，1219C-1432A， 1224T-1437G,1231A-1444G，1245C-1458T，1257C-1470T，1266T-1479C，1278C-1491T， 1282T-1495G, 1283C-1496A，1293T-1506G，1341A-1554G，1413T-1626C，1419A-1632G， 1428T-1641C,1434T-1647C,1442A-1655C,1459A-1672T,1467T-1680C,1470C-1683T, 1482C-1695T,1509T-1722C，1530C-1743T)
“_”前是本研究表达的单宁酶氨基酸位点，“_”后是GenBank序列号XP_001402486. 1
4的序列相应氨基酸。(98Q-169K, 116Q-187K，154I-226F，244P-315T，261A-332T，290Y-36ID， 352I-423L,363K-434Q,391A-462G,401T-472S,407Q-478K,408D-479E,428S-499D, 481N-552T，487T-558S)
本发明所用表达载体为pET-32a(+)，本发明蛋白纯化的方法为Ni离子亲和层析法，所用载体和纯化方法均为成熟的技术。本发明获得的重组黑曲霉单宁酶及其表达和纯化方法所具有的积极效果在于 (l)pET-32a(+)可以提高酶蛋白的表达水平。(2)pET-32a(+)带有His标签，利于后期蛋白的纯化。(3) Ni离子亲和层析法是专门纯化带有His标签的重组蛋白。
图1为黑曲霉tan基因PCR扩增图2为菌落PCR鉴定pMD19T-Tan克隆载体；其中1 :DNA分子量Marker ； 2-7 分别是不同克隆的PCR产物； 图3为单宁酶氨基酸序列； 图4为单宁酶核苷酸序列；
图5为重组表达载体pET3h-Tan双酶切鉴定；其中1 λ mk/EcoR l+Hind III双酶切分子量 Marker ；2 空载体 pET_32a (+)/万⑶左 I 与 Hind III 双酶切；3 :pET32a-Tan/^boT I与Hind III双酶切；
图6为Wfestern blot鉴定单宁酶基因的表达；其中1 :ρΕΤ_3^ι(+)空载体转化大肠杆菌裂解物；2 :PET32a-Tan重组载体转化大肠杆菌裂解物；
图7 SDS-PAGE分析单宁酶重组蛋白的表达纯化和纯化；其中1 蛋白分子量Marker ； 2 未诱导菌体总蛋白；3 诱导菌体总蛋白；4 纯化的单宁酶； 图8为重组黑曲霉单宁酶反应温度及热稳定性测定曲线图； 图9为重组黑曲霉单宁酶反应ph值及酸碱稳定性测定曲线图。
具体实施例方式
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。特别说明的是本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。实施例1 黑曲霉DNA提取
接种黑曲霉菌株入50 mL察氏培养基中(NaNO3 3.0 g/L, K2HPO4 1.0 g/L，KCl 0.5 g/ LjMgSO4 0.5 g/L, FeSO4 0. 01 g/L，蔗糖 30 g/L)，于 28° C、250 rpm 振荡培养 48 h。12,000 rpm离心收集菌体，在液氮中快速研磨，取0. 2 g粉末，加入500 μ TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA)，再加入500 μ 酚/仿，混勻后，12，000 rpm离心10 min。取上清液加入1/10体积NaAc，再加入2倍体积无水乙醇，置冰上沉淀20 min。12,000 rpm离心20 min，沉淀用 70%乙醇洗涤两次，旋转蒸发抽干，沉淀溶于20 μ 灭菌水中。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测总 DNA。
单宁酶基因PCR扩增
单宁酶基因克隆所用引物如下
Tan-F: 5-TGCAATGTCACTGTTACC-3 (N03)和 Tan-R
5-TTAGAAAACGGGCATCTTG-3, (N04)
以黑曲霉基因组DNA作为模板，反应总体积为50 μ ，在0.2 mL PCR管中依次加入下列成分
权利要求
1.一种重组表达的黑曲霉单宁酶，其特征在于黑曲霉单宁酶编码的基因核苷酸序列如图1所示；其所对应的氨基酸序列如图2所示。
2.权利要求1所述黑曲霉单宁酶的表达方法，其特征在于通过表达载体pET3h-Tan在大肠杆菌菌株BL21中采用IPTG进行诱导表达，采用裂解法释放单宁酶后进行纯化得到重组黑曲霉单宁酶。
3.权利要求2所述黑曲霉单宁酶的表达方法，其中所述的纯化为采用5mL M-NTA柱纯化蛋白，50 mL NPI-10平衡柱子，流速为5 mL/min ；加入蛋白粗提物，流速为2 mL/min, 50 mL NPI-20洗脱杂蛋白，流速为5 mL/min, 30 mL NPI-250洗脱单宁酶蛋白，流速为1 mL/ min，收集各步洗脱液，SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。
4.权利要求1所述重组表达的黑曲霉单宁酶在作为降解植物性饲料中的单宁，降低对单胃动物体内胰蛋白酶、淀粉酶消化酶的抑制，提高饲料中营养物质消化率饲料方面的应用。
全文摘要
本发明公开一种重组黑曲霉单宁酶的表达及纯化方法。本发明通过PCR方法将编码黑曲霉单宁酶蛋白的核苷酸序列从黑曲霉基因组中扩增出来，克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a(+)，构建表达载体pET32a-Tan，采用化学转化法转化入大肠杆菌BL21获得重组菌株，采用液态培养的方法进行重组单宁酶的诱导表达。本发明采用Ni亲和层析纯化重组黑曲霉单宁酶，纯化后的单宁酶活性为13.2U/mL。本发明的重组黑曲霉单宁酶具有明显的生物学活性可以有效的降解水解单宁和没食子酸丙酯。
文档编号A23K1/165GK102260656SQ20111014363
公开日2011年11月30日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者乔家运, 李平, 王文杰, 陈龙宾 申请人:天津市畜牧兽医研究所