专利名称：蝗虫微孢子虫株系及其在防治蝗虫中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蝗虫微孢子虫株系及其在防治蝗虫中的应用。
背景技术：
蝗虫灾害与水、旱灾常交替发生，一直是严重威胁我国农业生产、影响人民生活的三大自然灾害。我国已记录的蝗虫600多种，其中对农、林、牧业可造成危害的约60余种。目前防治蝗虫的方法主要是采用化学农药防治，尽管化学防治可以迅速压低蝗虫的虫口密度，但是往往造成污染环境、杀伤大量有益动物、人畜中毒和害虫产生抗药性等不良后果等。生物农药治蝗不但可以有效控制蝗害，而且不杀伤天敌、对环境友好、对人畜安全，具有十分广阔的应用前景。已有关于利用绿僵菌防治蝗虫的技术，但是因其生产成本高、保存期短、使用的环境条件要求苛刻、对有些生物不安全等，而限制了使用范围。蝗虫微孢子虫是蝗虫的专性寄生原生动物，只对蝗虫等直翅目昆虫有致病性，因此十分安全。而且该病原物在田间使用过程受环境条件的限制较小、生产成本低，因此很有竞争性。但是，蝗虫微孢子虫的致病力一般较弱，因此提高蝗虫微孢子虫的毒力十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种蝗虫微孢子虫株系及其在防治蝗虫中的应用。本发明提供的将蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae)，命名为AL2008L-04株系，是从田间患病的东亚飞蝗中分离筛选得到的，已于2011年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3 号)，菌种保藏号为 CGMCC No. 4901。蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae) AL2008L-04 株系 CGMCC No. 4901 简称 AL2008L-04 株系。本发明还提供了一种制备蝗虫防治剂的活性成分的方法，包括如下步骤(1)将涂有所述AL2008L-04株系的孢子液的植物叶片饲喂蝗蝻
(2)改用正常植物叶片饲喂直至死亡；(3)取死亡虫体中的所述AL2008L-04株系的孢子，即为蝗虫防治剂的活性成分。步骤(1)中，所述孢子液与所述植物叶片的质量比具体可为1 1。步骤(1)中，所述孢子液的浓度具体可为IXlO6孢子/毫升。步骤(1)中，用所述植物叶片饲喂所述蝗蝻的时间具体可为2天。步骤(1)中，用所述植物叶片饲喂所述蝗蝻的饲喂条件具体可为25-32°C，相对湿度60-70%，光照时间16小时/天(光源为白炽灯)，每天饲喂2次。步骤(1)和/或步骤O)中，所述植物具体可为玉米和/或小麦。步骤(3)中，具体可通过如下方法取所述死亡虫体中的所述AL2008L-04株系的孢子将所述死亡虫体研磨、再用120目的网筛过滤；将所有过滤得到的组织液用等体积的水 (最好为蒸馏水)稀释后，进行如下差速离心500-1000转/分钟离心15分钟取上清，将上
3清液3000转/分钟离心30分钟取沉淀，即为所述AL2008L-04株系的孢子。所述蝗蝻具体可为4龄蝗蝻。所述4龄蝗蝻具体通过如下方法得到将蝗虫(如东亚飞蝗)的卵在条件下孵化，在，相对湿度60-70%条件下每天饲喂植物叶片，饲养至4龄蝗蝻。所述植物具体可为玉米和/或小麦。以上任一所述方法制备得到的活性成分也属于本发明的保护范围。本发明还保护含有所述活性成分的蝗虫防治剂。每毫克蝗虫防治剂中具体可含有 IO7个所述AL2008L-04株系的孢子。所述蝗虫防治剂具体可由所述活性成分、吐温_80、蔗糖和水组成；所述蝗虫防治剂中，所述AL2008L-04株系的孢子的浓度具体可为IO7孢子/毫升，吐温-80的质量百分含量具体可为4%，蔗糖的质量百分含量具体可为3%。所述蝗虫防治剂在应用时采用喷雾，喷雾可以一次也可多次。本发明提供的蝗虫防治剂可用于防治草原蝗虫、飞蝗等多种蝗虫。该产品属于生物农药，对环境和人、畜、禽无毒害作用，对天敌安全，应用前景广阔。本发明对于提高我国蝗虫防治技术水平具有重要意义。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、蝗虫微孢子虫AL2008-01株系的获得将田间采集的患病的东亚飞蝗，研磨、过滤、镜检，之后离心纯化，从虫体分离得到不同株系的野生蝗虫微孢子虫。将各个野生蝗虫微孢子虫株系以一系列的浓度涂抹在玉米叶片上，之后喂饲东亚飞蝗4龄蝗蝻2天，收获死亡较早的虫体，经过研磨、过滤、离心等， 得到纯化的蝗虫微孢子虫。连续筛选30代，得到蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae) AL2008L-04 株系。在光学显微镜GOO倍)可见AL2008L-04株系的孢子呈卵圆形，大小为 (6. 13 士 1. 37) μπιΧ (3. 17 士 0. 53) μ m,比已有的株系(5. 40 士 0. 50) ymX (3. 11 士 0. 37) μπι略大。2011 年5月 23 日将蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae)AL2008L-04株系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo. 4901。 蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae) AL2008L-04 株系 CGMCC No. 4901 简称 AL2008L-04株系。实施例2、AL2008-01株系的致病性鉴定实施例中的玉米叶片均可用小麦叶片代替。一、AL2008-01株系的孢子的制备1、将东亚飞幢(Locusta migratoria manilensis)的卵在条件下孵化，在 ^-32°C，相对湿度60-70%条件下每天饲喂新鲜玉米叶片，饲养至4龄蝗蝻。2、将AL2008L-04株系的孢子液(IX IO6孢子/毫升)涂抹在新鲜玉米叶片上，玉米叶片与孢子液的质量比为1 1，用于饲喂4龄蝗蝻，连续饲喂2天，之后用新鲜玉米叶正
4常饲养直至蝗虫死亡；饲养条件温度保持在25-32°C，相对湿度保持在60%左右，光照时间16小时/天(光源为白炽灯)，每天饲喂玉米叶片2次。3、将死亡后的蝗虫虫体研磨、再用120目的网筛过滤；将所有过滤得到的组织液用等体积的蒸馏水稀释后，进行如下差速离心第一次1000转/分钟(500-1000转/分钟均可)离心15分钟，取上清；之后再将上清液3000转/分钟的离心30分钟取沉淀)，即为 AL2008L-04株系的孢子。二、AL2008-01株系的致病性鉴定( 一 )AL2008L-04株系对3龄东亚飞蝗蝗蝻的LD501、将东亚飞蝗的卵在条件下孵化，在^_32°C，相对湿度60_70%条件下每天饲喂新鲜玉米叶(玉米叶也可用小麦叶代替)，饲养至3龄蝗蝻。2、将不同浓度的AL2008L-04株系的孢子液涂抹在新鲜玉米叶片上，玉米叶片与孢子液的质量比为1 1，用于饲喂3龄蝗蝻，连续饲喂2天，之后用新鲜玉米叶正常饲养 26天，统计死亡率，计算AL2008L-04株系对3龄东亚飞蝗蝗蝻的LD5tl (半数致死量)；饲养条件温度保持在25-32°C，相对湿度保持在60%左右，光照时间16小时/天，每天饲喂玉米叶2次。AL2008L-04株系对3龄东亚飞蝗蝗蝻的LD5tl (半数致死量)为2. 5 X IO6个孢子/ 克3龄蝗蝻。( 二)AL2008L_04株系对3龄东亚飞蝗蝗蝻的LT501、将东亚飞蝗的卵在条件下孵化，在^_32°C，相对湿度60_70%条件下每天饲喂新鲜玉米叶(玉米叶也可用小麦叶代替)，饲养至3龄蝗蝻。2、将AL2008L-04株系的孢子液涂抹在新鲜玉米叶片上，玉米叶片与孢子液的质量比为1 1，用于饲喂3龄蝗蝻，连续饲喂2天，饲喂剂量为5X106个孢子/克3龄蝗蝻； 之后用新鲜玉米叶正常饲养直至蝗虫死亡，统计死亡率，计算AL2008L-04株系对3龄东亚飞蝗蝗蝻的LT5tl (半数致死时间)；饲养条件温度保持在25-32°C，相对湿度保持在60%左右，光照时间16小时/天，每天饲喂玉米叶2次。在5X IO6个孢子/克3龄蝗蝻的剂量下AL2008L-04株系对3龄东亚飞蝗蝗蝻的 LT5tl (半数致死时间)为17天。步骤(一)和步骤(二)的结果表明，AL2008-01株系具有良好的致病力。实施例3、制剂的制备及其应用一、用AL2008-01株系制备制剂用实施例2的步骤一制备的AL2008L-04株系的孢子、吐温_80、蔗糖和水制备可溶性悬浮剂，AL2008L-04株系的孢子的浓度为IO7孢子/毫升，吐温-80的质量百分含量为 4%，蔗糖的质量百分含量为3%。二、制剂的应用分别在河北、山东、河南、安徽、海南、内蒙古、新疆、甘肃、青海、辽宁、广西、广东、 山西、陕西进行大田试验，方法如下将步骤一制备的可溶性悬浮剂在蝗虫处于2龄盛发期时进行大田喷雾(设置至少三个重复，每个重复的面积至少为1公顷大田)，每公顷使用3000毫升制剂，作为实验组； 设置不采用制剂进行喷雾的大田作为平行对照(设置至少三个重复，每个重复至少为1公顷大田)，即对照组；喷雾后第20天统计进行喷雾的实验组大田和对照组大田中的蝗虫数量，实验组大田和对照组大田各设置30个调查样点，每个调查样点大小为1平方米，实验组和对照组的蝗虫数量均取30个调查样点的平均值。蝗虫的死亡率=(对照组的蝗虫数量-实验组的蝗虫数量)/对照组的蝗虫数量*100%。结果见表1。表1各个地域的大田试验蝗虫的死亡率
权利要求
1.蝗虫微孢子虫(Antonosporalocustae) AL2008L-04株系，它的保藏编号为CGMCC No.4901。
2.制备蝗虫防治剂的活性成分的方法，包括如下步骤(1)将涂有权利要求1所述蝗虫微孢子虫AL2008L-04株系的孢子液的植物叶片饲喂蝗蝻；(2)改用正常植物叶片饲喂直至死亡；(3)取死亡虫体中的蝗虫微孢子虫AL2008L-04株系的孢子，即为蝗虫防治剂的活性成分。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述孢子液与所述植物叶片的质量比为1 1 ；所述孢子液的浓度为IXIO6孢子/毫升。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于步骤(1)中，用所述植物叶片饲喂所述蝗蝻的时间为2天；用所述植物叶片饲喂所述蝗蝻的饲喂条件为25-32°C，相对湿度 60-70 %，光照时间16小时/天，每天饲喂2次。
5.如权利要求2至4中任一所述的方法，其特征在于步骤⑴和/或步骤(2)中，所述植物为玉米和/或小麦。
6.如权利要求2至5中任一所述的方法，其特征在于所述蝗蝻为4龄蝗蝻；所述4 龄蝗蝻优选通过如下方法得到将蝗虫的卵在条件下孵化，在^_32°C，相对湿度 60-70 %条件下每天饲喂植物叶片，饲养至4龄蝗蝻。
7.权利要求2至6中任一所述方法制备得到的活性成分。
8.含有权利要求7所述的活性成分的蝗虫防治剂。
9.如权利要求8所述的蝗虫防治剂，其特征在于每毫克蝗虫防治剂中含有IO7个权利要求1所述蝗虫微孢子虫AL2008L-04株系的孢子。
10.如权利要求9所述的蝗虫防治剂，其特征在于所述蝗虫防治剂由权利要求7所述活性成分、吐温-80、蔗糖和水组成，AL2008L-04株系的孢子的浓度为IO7孢子/毫升，吐温-80的质量百分含量为4%，蔗糖的质量百分含量为3%。
全文摘要
本发明公开了一种蝗虫微孢子虫株系及其在防治蝗虫中的应用。本发明提供的将蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae)，命名为AL2008L-04株系，是从田间患病的东亚飞蝗中分离筛选得到的，已于2011年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No.4901。蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae)AL2008L-04株系CGMCC No.4901简称AL2008L-04株系。本发明提供的蝗虫防治剂可用于防治草原蝗虫、飞蝗等多种蝗虫。该产品属于生物农药，对环境和人、畜、禽无毒害作用，对天敌安全，应用前景广阔。本发明对于提高我国蝗虫防治技术水平具有重要意义。
文档编号A01P7/04GK102250772SQ201110174318
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月24日 优先权日2011年6月24日
发明者张龙 申请人:中国农业大学