专利名称：：一种提高动物繁育力的新型shRNA及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种新型载体的构建。具体而言，本发明针对绵羊干扰素INHA基因的α亚基的核苷酸序列设计合成shRNA单链寡核苷酸，构建了shRNA慢病毒干扰载体，得到了具有良好应用前景的新型载体。
背景技术：
：抑制素(Inhibin，INH)是一种能够通过垂体负反馈调节卵泡刺激素(Follicle-stimulatinghormone,FSH)分泌的肽类性腺激素。它属于转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员，主要由雌性动物的卵巢颗粒细胞和雄性动物的睾丸支持细胞及睾丸间质细胞[HayesFJ,HallJE,BoepplePA,CrowleyWF,Jr.Clinicalreview96Differentialcontrolofgonadotropinsecretioninthehuman:endocrineroleofinhibin.JClinEndocrinolMetab，1998，83(6):1835-41.]分泌并广泛分布于动物体的多个器官中。根据抑制素的分子组成可将其分为抑制素A、抑制素B等多种类型。抑制素最早是由McCullough[McCulIaghDR.DualEndocrineActivityoftheTestes.Science,1932,76(1957):19-20.]在牛睾丸水溶液提取物中发现的，因其具有强烈抑制卵泡刺激素(FSH)、轻微抑制促黄体素(LH)的作用而得名。抑制素是一种异二聚体糖蛋白(姜庆林等，200，它由一个α亚基(20kDa)和四种β亚基(14kDa)——βΑ、βB、βC禾ΠβE之一所构成，α亚基与β亚基之间以二硫键相连形成抑制素Α(α，βΑ)、抑制素Β(α，βB)等多种抑制素亚型，只有当α亚基与β亚基相结合时抑制素才具有生物活性。此外，抑制素的β亚基还存在于另一种与抑制素具有截然相反生物学作用的二聚体分子——激活素(Activins，ACN)中。这一事实表明α亚基对于抑制素具有特异性。抑制素α亚基上有糖基化位点，是抑制素的生物活性中心，也是抑制素发挥生物活性所必需的位点。使用放射免疫分析法对灵长动物的卵巢进行检测，发现在晚期卵泡期阳性抑制素适度增加，并在月经周期与LH潮一起达到峰值[McLachlanRI,RobertsonDM,HealyDL,BurgerHG,deKretserDM.Circulatingimmunoreactiveinhibinlevelsduringthenormalhumanmenstrualcycle.JClinEndocrinolMetab,1987,65(5):954_61.]。在黄体期观察到的抑制素最高水平与灵长类月经周期中较高的孕酮水平呈正相关。抑制素对卵泡形成发挥刺激效应，并可能调控卵泡生长、发育、闭锁、卵母细胞成熟及精子产生[WoodruffTK,LyonRJ,HansenSE,RiceGC,MatherJP.Inhibinandactivinlocallyregulateratovarianfolliculogenesis.Endocrinology,1990,127(6):3196_205·]。在生理状况下抑制素能选择性地抑制垂体合成和分泌促卵泡素，从而影响卵巢上卵泡的发育和成熟，是调节家畜繁殖力的重要生殖激素之一。利用荧光原位杂交方法和遗传连锁分析方法，INHA已在人、小鼠、猪、牛和羊等动物中得到精细定位。抑制素与多种动物的生殖机能相关，INHA基因变异会导致动物生殖机能改变或异常[XUEYu,CHUMing-Xing,ZHOUZhong-Xiao.Advancesoninhibingenes.Hereditas(Beijing)，2004，26(5)=749-755.]。在人类疾病研究中，抑制素基因多作为卵巢早衰的候选基因，Sielling等扫描了整个基因组INHA基因序列，发现INHA第2外显子内769G—A变异可能与卵巢早衰有关，Marozzi等[MarozziA,PortaC,VegettiW,CrosignaniPG,TibilettiMG,DalpraL,GinelliΕ.MutationanalysisoftheinhibinαgeneinacohortofItalianwomenaffectedbyovarianfailure.HumReprod,2002,17(7):1741-1745.]的研究证明INHA基因与卵巢早衰显著相关，陈绚丽等的研究也证明该突变对人卵巢功能有严重影响。近来研究表明抑制素α亚基与动物繁殖性能之间存在密切的关系。对高繁殖力绵羊品种与低繁殖力绵羊品种之间抑制素α亚基基因多态性的研究发现，高繁殖力绵羊品种与低繁殖力绵羊品种之间基因型分布差异都极显著(P<0.01)。田秀娥等[田秀娥，孙红霞，王永军.3个绵羊群体INHA基因的遗传多态性及对产羔数的影响.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2010，38(1):23-.]用PCR-SSCP方法检测和分析3个绵羊品种(滩羊、蒙古羊和小尾寒羊)INHA基因的多态性，研究不同基因型对产羔数的影响，发现滩羊、蒙古羊和小尾寒羊Pl(5‘调控区282核苷酸处发生的1处A—G突变)位点C、D基因频率分别为0.840和0.160,0.852和0.148及0.162和0.838，均处于中度多态；P2位点E、F基因频率分别为0.784和0.216,0.787和0.213及1.000和0.000，滩羊和蒙古羊在该位点均处于中度多态；引物P3扩增片段中，滩羊和蒙古羊表现为A、B和C三种单倍体基因型，而小尾寒羊仅表现出A和B2种基因型。由于INHA基因在绵羊繁殖力上发挥重要作用，近年来，许多利用抑制素免疫的方法提高山羊、绵羊、奶牛和小鼠等繁殖力的研究取得了显著成果。LiHan等[LiHan,D.G.Mao,D.K.Zhang,Α.X.Liang,Μ.Fang,MuhammadMoaeen-ud—Din,L.G.Yang.DevelopmentandevaluationofanovelDNAvaccineexpressinginhibinα(1-32)fragmentforimprovingthefertilityinratsandsheep.AnimalReproductionScience,2007，109(2008):251-265.]将抑制素α亚基(1-32)片段插入到HBsAg-S的羧基端，构建出一种抑制素DNA疫苗。用这种疫苗免疫40只绵羊，结果发现经过绵羊的实验组绵羊的双胎率(39.2%)显著高于对照组绵羊的双胎率(10%)(P<0.05)。结果表明用针对抑制素构建的DNA疫苗进行免疫可诱导产生更多的卵泡，从而增加产仔数。RNA干扰(RNAi)最初被提出是在对秀丽线虫的研究中。1998年，Fire等在研究隐杆线虫(Celegans)基因功能时发现纯化的双链RNA比反义RNA更能高效、特异性阻断特定基因的表达，并导致整个线虫的同源基因沉默，而且还能阻断其子代第一代同源基因的表达，这一现象被称为RNAi。RNA干扰技术是一种新兴且日益成熟的的基因沉默技术，目前已被认为是基因工程学领域的一种非常高效的研究工具。它是一种封闭基因表达的有效方法，它通过将双链RNA(dsRNA)导人细胞后，在Dicer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA(siRNA)，使与该段RNA同源的目的mRNA产生特异性降解，从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象。用此技术可以高效、稳定、特异地阻止目的基因的表达，从而达到较为理想的沉默效果。在哺乳动物的RNA干扰(RNAinterference,RNAi)研究中，两类小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)被广泛用于抑制外源基因和内源基因的表达；人工合成的siRNA和载体表达的siRNA(即生物体内转录的siRNA)，而这种载体表达的siRNA—般由小片段发4夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)产生[BrummelkampTR,BernardsR,AgamiR.AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells.Science,2002,296(5567):550-553.]。近年的研究表明，具有茎环结构的shRNA分子比在细胞中同时表达的siRNA分子的正义链与反义链对靶基因的抑制效率要高，shRNAs通过稳定转染的质粒载体或整合的反转录病毒载体、慢病毒载体进行表达，能够长效的抑制基因表达[SontheimerEJ,CarthewRff.SilencefromwithinendogenoussiRNAsandmiRNAs.Cell,2005,122(1):9-12]。所以，在哺乳动物RNAi试验研究中，如需要持久抑制基因表达，最恰当的方法是利用质粒或反转录病毒载体表达shRNA。GustavoTiscornia,etal.Q003)报道了一种由鼠U6启动子控制shRNA表达的慢病毒载体(PLL3.7)，在其TO启动子下游紧接多克隆位点(MCS)，为RNAi茎环结构序列的插入提供了方便；并可表达报告基因EGFP[TiscorniaG，Singer0，IkawaΜ,etal.AgeneralmethodforgeneknockdowninmicebyusinglentiviralvectorsexpressingsmallinterferingRNAProcNatlAcadSci，2003，100(18):1844-1848]。载体pLL3.7能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。抑制素主动免疫这种方法只对亲代动物起作用，并不能将亲代高繁育性状传递给子代动物。为了解决这一问题，本发明从ShRNA入手，构建了针对绵羊抑制素α亚基的shRNA慢病毒干扰载体，通过性腺转基因法获得了转基因阳性高繁育力的小尾寒羊，为高繁殖力绵羊新品种培育奠定基础。
发明内容本发明公布了一种提高动物繁育力的新型干扰载体pLenti6-ShRNA3，所述shRNA慢病毒干扰载体包含基因序列kqunenceNO.15、SequnenceNO.16。本发明根据INHA基因序列设计合成了4个shRNA干扰载体pGFP-V-RS_shRNA。本发明通过重叠PCR的方法克隆了INHA全长基因，并构建了INHA高表达的载体pIRES2-eGFP-INHA。本发明将shRNA干扰载体pGFP-V-RS-shRNA和INHA高表达的载体pIRES2-eGFP-INHA共转染细胞，通过RT-PCR法进行干扰效果筛选。本发明将干扰效果最好的shRNA片段shRNA3构建成pENTR/TO_shRNA3，并与慢病毒载体pLenti6/BL0CK-iT-DEST重组，构建慢病毒载体pLenti6_shRNA3。本发明将获得的慢病毒干扰载体pLenti6-ShRNA3用细胞进行慢病毒包装，获得了可供细胞转染滴度为2.0510VP/ml的慢病毒。本发明将获得的慢病毒液稀释，用于母羊卵泡注射和公羊性腺注射，对16只小尾寒羊母羊进行性腺转基因操作，其余30只母羊输以处理公羊的精液，共产生仔羊41只，取其中45月龄的9只仔羊进行检测，经检测4只为转基因阳性小尾寒羊。本发明将获得的雌性Fl代转基因小尾寒羊进行繁育实验，与非转基因小尾寒羊相比其产仔数到了显著的提高。图IshRNA干扰载体pGFP_V-RS_shRNA3与INHA高效表达载体pIRES2-EGFP_INHA共转染细胞(100Χ)(Α荧光视野；B可见光视野)。图2shRNA干扰载体阴性对照pGFP_V-RS_NC与INHA高效表达载体PIRES2-EGFP-INHA共转染细胞的荧光结果(100Χ)(Α荧光视野；B可见光视野)。图3各样品中内参(β-actin)的扩增曲线。通过扩增曲线可以得到内参的循环阈值(Ct值)。图4各样品中内参(β-actin)的熔解曲线。溶解曲线未见杂峰，说明扩增产物单一特异，没有非特异性扩增。图5各样品中目的基因的扩增曲线。通过扩增曲线可以得到各样品目的基因的Ct值。图6各样品中目的基因的熔解曲线。溶解曲线未见杂峰，说明扩增产物单一特异，没有非特异性扩增。图7各干扰质粒对INHA基因的沉默效率。NC为阴性对照，shRNAl、shRNA2、shRNA3、shRNA4分别为pGFP-V-RS-shRNAl、pGFP_V-RS_shRNA2、pGFP_V-RS_shRNA3、pGFP-V-RS-shRNA4分别和INHA高表达载体共转染细胞的INHA基因的mRNA含量。图SWesternBlot方法检测各组细胞INHA蛋白的表达。A图的箭头所指为内参GAPDH，B图的箭头所指为抑制素条带约32KD。泳道1阴性对照；泳道2、3、4、5分别为pGFP-V-RS-shRNAl、pGFP_V-RS_shRNA2、pGFP_V-RS_shRNA3、pGFP_V-RS_shRNA4分别和INHA高表达载体共转染细胞的INHA蛋白的表达量。A为各样品内参，B为与A相同样品的INHA蛋白含量。图9shRNA干扰载体pENTR/U6_shRNA3测序结果(有效干扰位点59_87)。图10慢病毒干扰载体pLenti6-ShRNA3测序结果(干扰序列位点40_68)。图11实验组绵羊的9只Fl代和普通绵羊的3只Fl代INHA基因的Q-PCR检测。图12实验组绵羊的9只Fl代血清中INHA蛋白的flfesternBlot检测。实施例1绵羊抑制素shRNA慢病毒干扰载体的构建与鉴定一.研究方法1.构建shRNA干扰载体禾Ij用Invitrogen公司shRNA在线设计工具http//rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/针对绵羊INHA基因(1^8815.1)的cDNA序列筛选4个shRNA作用靶点。其革巴点的DNA序歹Ij见序歹Ij表SequnenceNO.1、SequnenceNO.2、SequnenceNO.3、SequnenceNO.4。以每条靶序列为5，端，其反向互补序列为3，端，5’端和3，端之间以茎环结构序列相连，再分别于5’端和3’端引入BamHI和MlI酶切位点，这就构成了shRNA的编码(模板)序列。然后，再设计出与绵羊体内所有已知的基因编码序列不具有显著相似性(同源性)的1条序列作为阴性对照序列，并为其设计发夹结构。设计的5对序列详情如下shRNAl的序列为SequnenceN0.5、SequnenceNO.6，shRNA2的序列为SequnenceNO.7、SequnenceNO.8，shRNA3的序列为SequnenceNO.9、SequnenceNO.10，shRNA4的序列为SequnenceΝ0·11、SequnenceΝ0·12，阴性对照序列为SequnenceNO.13、SequnenceNO.14。将4对合成好的shRNA模板链和阴性对照(neg)寡核苷酸链用双蒸水溶解成100μΜ,互补单链各取5μ1，并将其两两混合，接着按照表1给出的退火反应体系进行退火。再将5对互补的shRNA及neg寡核苷酸单链在95°C条件下加热5分钟，然后放于室温自然冷却20分钟，最终形成双链shRNA表达序列和阴性对照表达序列。表1shRNA模板链退火体系权利要求1.一种提高动物繁育力的新型干扰载体pLenti6-ShRNA3，其特征在于，所述shRNA慢病毒干扰载体包含基因序列kqunenceNO.15和kqunenceNO.16。2.一种shRNA表达载体pENTR/U6-shRNA3，其特征在于，所述pENTR/U6_shRNA3载体包含基因序列SequnenceNO.15禾口SequnenceNO.16。3.根据权利要求1所述的提高动物繁育力的新型干扰载体，其特征在于，所述载体可以制备包含基因序列kqunenceNO.15和kqunenceNO.16的慢病毒。4.根据权利要求1所述的提高动物繁育力的新型干扰载体，其特征在于，所述载体可以用于INHA低表达的转基因小尾寒羊的制备。5.根据权利要求1所述的提高动物繁育力的新型干扰载体，其特征在于，所述载体可以应用于培养高繁殖力绵羊新品种。全文摘要本发明公开了一种提高动物繁育力的新型shRNA及其应用，其特征是包含基因序列SequnenceNO.15和SequnenceNO.16。本发明针对绵羊干扰素INHA基因α亚基的核苷酸序列设计合成多对shRNA单链寡核苷酸，构建了INHAshRNA干扰载体pGFP-V-RS-shRNA，通过RT-PCR法进行干扰效果筛选，得到了抑制效果良好的pGFP-V-RS-shRNA3载体，该载体包含基因序列SequnenceNO.15和SequnenceNO.16，进一步将基因序列SequnenceNO.15和SequnenceNO.16构建到shRNA慢病毒干扰载体pLenti6-shRNA3。本发明还公开了上述新型载体的应用。文档编号A01K67/027GK102409065SQ20111017687公开日2012年4月11日申请日期2011年6月28日优先权日2011年6月28日发明者张瑞杰,苗向阳申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所