专利名称：植物茎尖转化方法及其专用工具的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物茎尖转化方法及其专用工具。
背景技术：
植物遗传转化方法就是通过特定的方式将外源基因导入到受体细胞内，使之发生定向的、永久的遗传变异。目前，人们已经建立了多种转化系统。对大多数遗传转化系统而言，遗传转化方法是遗传转化系统的关键环节，决定着转化的成败及效率。用于植物的转化方法有许多农杆菌介导法，基因枪法，电击法、PEG法等。农杆菌介导法和基因枪法已成为目前用于遗传转化的主要方法。过去认为受农杆菌宿主范围限制，农杆菌介导的遗传转化仅限于双子叶植物。最早报道的采用农杆菌介导法转化成功的植物单子叶植物是石刁柏，之后相继在水稻、玉米、 大麦、甘蔗等重要作物中获得了农杆菌介导的转基因植株，并有充足的分子和遗传证据。虽然大多数单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，但随着对农杆菌转化植物细胞原理的深入认识，通过添加外源信号物质如乙酰丁香酮(AQ等也可以实现农杆菌对单子叶植物的转化。 由于农杆菌转化利用天然的整合系统实现DNA的转移，该法具有转基因拷贝数低、遗传稳定、成本低廉等优点使农杆菌成为大多数遗传转化的首选方法。植物受体的选择是遗传转化系统的另一重要因素。目前农杆菌转化的植物受体主要包括幼胚及其胚性愈伤组织、叶盘、子叶、子叶节、下胚轴等外植体。这些受体都需要经过脱分化过程形成愈伤组织，然后经过再分化再生植株。组织培养和遗传转化能否成功在很大程度上取决于受体基因型，绝大多数具有重要经济价值的基因型难以利用，植株再生频率很低，并且组织培养过程中易发生体细胞无性系变异。因此，选择合适的外植体作为农杆菌转化的受体，建立不受基因型限制的遗传转化体系仍是目前研究的重点之一。近年来，利用离体茎尖分生组织直接再生系统进行的转基因研究工作逐渐增多， 并取得重要进展。1988年，McCabe等用基因枪转化大豆离体茎尖获得了转基因植株。1991 年Gould等用玉米离体茎尖与农杆菌共培养获得了转化植株及子代。Zapata等(1999)和 Mtyavathi等^00 分别用农杆菌介导法转化棉花离体茎尖都获得了转基因植株。离体茎尖分生组织不需要脱分化过程，茎尖转化后直接再生植株，这使转化周期大大缩短，并一定程度上打破了基因型限制，因此显示出良好的应用前景。农杆菌介导的小麦遗传转化是一道难题。据统计，在2002年前获得小麦转基因植株的报道中，基因枪法占90%左右，其他方法仅占10%。1997年，Cheng等利用农杆菌介导法转化小麦成功，标志着小麦遗传转化的另一个里程碑。由于小麦离体培养受基因型的影响大、多数品种植株再生频率低、对农杆菌感染不敏感、组织培养过程中易发生体细胞无性系变异等原因，使得通过农杆菌介导的遗传转化进展慢，批量获得转基因小麦植株仍受基因型限制很大，以致小麦基因工程研究远落后于其它主要农作物。另外，小麦的基因组有1. 7 X 1010bp,是水稻基因组的40倍，是玉米基因组的6倍，是拟南芥基因组的100倍，巨大的基因组导致转基因植株的分子鉴定难度大，特别是Southern杂交分析，影响了转基因小麦的后代研究。影响小麦遗传转化的因素如小麦基因型、外植体类型、浸染及共培养时间、农杆菌菌株与筛选剂等近年来都得到了广泛研究，但转化效率明显低于其它主要农作物的。盐角草(Salicornia europaea)是属于藜科的一种肉质化真盐生植物，广泛分布在沿海和内陆盐湖附近，能够积累高到干重50%的NaCl，被认为是世界上最耐盐的一种高等植物。盐角草具有发展为蔬菜、油料作物及饲料作物的潜力。建立高效稳定的盐角草遗传转化体系对于挖掘研究其抗逆基因功能及其自身的形状改良具有重要意义。31^等Q006) 以成熟胚为外植体诱导愈伤组织并实现了植株再生，建立了盐角草的体外再生体系。然而该体系的愈伤诱导率和植株再生率很低，很难用于批量遗传转化。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明提供的培育转基因植物的方法，包括如下步骤1)刺伤目的植物的茎尖生长点，得到处理后目的植物；2)用含有目的DNA的重组农杆菌菌液侵染步骤1)得到的所述处理后目的植物，得到浸染后幼苗；3)培养步骤2)得到的浸染后幼苗，得到含有所述目的DNA的转基因植物。步骤1)中，所述刺伤采用下述的金属刷；步骤2)中，所述含有目的DNA的重组农杆菌菌液按照如下方法制备A)将所述目的DNA通过重组载体导入根癌农杆菌得到重组农杆菌；B)将步骤A得到的所述重组农杆菌重悬于如下所述培养基，得到的菌液即为含有目的DNA的重组农杆菌菌液；所述重组载体为含有bar基因的pCAMBIA3300-ubinOS ；或将所述目的DNA插入表达载体pCAMBIA3300-ubinos中，得到表达目的DNA的重组载体。所述目的DNA为kVPl或&VP2 ；所述SeVPl的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；所述SeVP2的核苷酸序列为序列表中的序列3。所述bar的核苷酸序列为序列表中的序列4。步骤2)中，所述侵染在大气压力为0.05MPa下进行；所述侵染的时间为 15-20min，所述侵染的时间具体为20min。步骤1)中，所述目的植物为所述目的植物的种子萌发1-7天得到的植物；步骤幻中，所述培养依次为共培养和继续培养；所述共培养的温度为20°C -22°C ；所述共培养的时间为2天_4天，所述共培养为黑暗培养；所述共培养的培养基为MS培养基；所述继续培养为a)或b)a)所述继续培养的温度为日温25-30°C，夜温18_20°C，所述继续培养的相对湿度为60-80%，所述继续培养的光照条件为1 光照/8h黑暗；所述继续培养的时间为20-30 天；b)所述继续培养的温度为日温22-28°C，夜温15_21°C，所述继续培养的光照条件为自然光照；所述继续培养的时间为10-15天。步骤1)中，所述目的植物为所述目的植物的种子萌发1、2、3或7天得到的植物；步骤3)中，所述共培养的温度为20°C或22°C ；所述共培养的时间为3天，所述继续培养为a)或b)a)所述继续培养的温度为日温25°C，夜温18°C，所述继续培养的相对湿度为 60%，所述继续培养的时间为21天；b)所述继续培养的温度为日温22C，夜温16°C ；所述继续培养的时间为10天。所述目的植物具体所述目的植物的种子萌发1、2、3或7天得到的植物。所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物为小麦，所述双子叶植物为盐角草。本发明的第二个目的是提供一种用于刺伤所述目的植物茎尖生长点的金属刷。本发明提供的金属刷，包括金属纤维束和套设在所述金属纤维束外侧的套筒，所述金属纤维束的一端设于所述套筒外，所述金属纤维束的另一端位于套筒内。所述金属纤维束的直径为(0. 3-0. 8)厘米，所述金属纤维束的直径具体为0. 5厘米；所述金属纤维束具体由若干条直径为20-25微米的金属纤维组成；所述金属纤维束尤其具体由若干条直径为20微米或25微米的金属纤维组成；所述设于所述套筒外的金属纤维束的长度为(0. 2-0. 5)厘米，所述设于所述套筒外的金属纤维束的长度具体为0. 5厘米。所述金属纤维束和所述套筒固定连接，所述金属纤维束通过线与万能胶与所述套筒固定连接。本发明的第三个目的是提供一种用于配制所述重组农杆菌菌液的培养基。本发明提供的培养基，按照如下方法制备将乙酰丁香酮、SilwetL-77和1/2MS液体培养基混合，得到培养基，所述乙酰丁香酮在所述培养基中的浓度为150μΜ-250μΜ ；所述SilwetL-77在所述培养基中的浓度为0. 005% -0. 015% (体积百分含量)。所述乙酰丁香酮在所述培养基中的浓度为200 μ M ；所述SilwetL-77在所述培养基中的浓度为0.01% (体积百分含量)。本发明的实验证明，分别以单子叶植物小麦和双子叶植物盐角草幼苗的茎尖分生组织为农杆菌转化受体，通过对茎尖损伤工具的改造、对幼苗苗龄的研究，及辅助真空渗透处理和助渗剂使用等措施，建立了一套高效快速的植物转化体系，提高了茎尖转化效率；该转化体系的优势在于操作简单、周期短，不需要组织培养和植株再生过程，从而克服了普遍存在的基因型依赖性及体细胞变异的问题。
图1为金属纤维制作的刷子的结构示意2为小麦茎尖转化及TO代抗性植株图3为不同茎尖刺伤工具对小麦除草剂抗性率的影响图4为小麦苗龄对除草剂抗性率的影响图5为转基因小麦及其后代的获得
图6为转kVPl和&VP2小麦Tl代PCR检测结果图7为盐角草抗性植株的获得及真空渗透处理对除草剂抗性率的影响图8为盐角草Tl代抗性植株的获得图9为bar基因在盐角草Tl代植株的转录本相对表达量
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例数据统计分析用统计软件SPSS 12.0进行多重比较的(LSD)统计分析，在P < 0. 05和P < 0. 01水平上对各处理和株系差异的显著性进行比较。实施例1、利用小麦茎尖转化体系获得转基因小麦一、小麦茎尖转化体系的建立1、材料A、小麦品种中麦12小麦(以下简称野生型小麦)，冬性；分蘖力较强，成穗率较高；穗纺锤型， 长芒，白壳，白粒，籽粒角质；产量要素中亩穗数和穗粒数较多，千粒重偏低；植株较矮，节水区试株高65厘米左右，高肥区试70厘米左右，抗倒性好；抗寒性较好；抗、慢条锈病，慢叶锈病，感白粉病和秆锈病。购买自北京中农金土地农业发展研究中心种子销售部。B、转染重组菌C58/pCAMBIA3300-ubinos重组农杆菌C58/pCAMBIA3300-ubinos 为将命名质粒 pCAMBIA3300_ubinos 转入农杆菌C58获得的重组菌。质粒pCAMBIA3300_ubinos含有ubiquitin启动子和筛选标记基因编码草丁膦乙酉先基转移酶(PAT, phosphinothricinacetyltransferase)基因 bar。农 If 菌 C58 菌株在文献"Overexpression of Organellar and Cytosolic AtHSP90 in Arabidopsis thaliana Impairs Plant Tolerance to Oxidative Stress. Hongmiao Song, Pengxiang Fan, Yinxin Li. Plant Mol Biol Rep(2009) 27 :342-349. "ψ 公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。质粒pCAMBIA3300-ubinos 为在载体 pCAMBIA 3300 的 Hind III 和 BamH I 中插入ubiquitin启动子序列，得到的载体，ubiquitin启动子序列见序列表中的序列1， PCAMBIA3300中含有基因bar，其核苷酸序列为序列4。PCAMBIA3300购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。C、金属纤维刷将约6万条直径为20微米的金属纤维成束(金属纤维束直径为 0. 5cm)地塞到竹制毛笔竿的小孔中，用万能胶和线固定住。为了保持刷子的刚性，露在笔竿外的金属纤维长度为0.5厘米。金属纤维购自西安菲尔特金属过滤材料有限公司。笔竿购自文具店。分别用直径为20和25微米的金属纤维制作的刷子如图1所示。为了保持刷子的刚性，刷子的金属纤维长度为0.5厘米。D、培养基
YEP培养基的配制酵母提取物(yeast extract)蛋白胨(ρ印tone)NaCl琼脂粉(agar)用IM 的 NaOH 溶液调 pH7. 0。1/2MS培养基的配制培养基母液的配制和保存
权利要求
1.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤1)刺伤目的植物的茎尖生长点，得到处理后目的植物；2)用含有目的DNA的重组农杆菌菌液侵染步骤1)得到的所述处理后目的植物，得到浸染后幼苗；3)培养步骤2)得到的浸染后幼苗，得到含有所述目的DNA的转基因植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述刺伤采用如下权利要求6-8中任一所述的金属刷；步骤2)中，所述含有目的DNA的重组农杆菌菌液按照如下方法制备A)将所述目的DNA通过重组载体导入根癌农杆菌得到重组农杆菌；B)将步骤A得到的所述重组农杆菌重悬于如下权利要求9或10所述培养基，得到的菌液即为含有目的DNA的重组农杆菌菌液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤2)中，所述侵染在大气压力为0.05MI^下进行；所述侵染的时间为15-20min，所述侵染的时间具体为15min。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述目的植物为所述目的植物的种子萌发1-7天得到的植物。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述目的植物为所述目的植物的种子萌发1、2、3或7天得到的植物。
6.一种用于刺伤所述目的植物茎尖生长点的金属刷，包括金属纤维束和套设在所述金属纤维束外侧的套筒，所述金属纤维束的一端设于所述套筒外，所述金属纤维束的另一端位于套筒内。
7.根据权利要求6所述的金属刷，其特征在于所述金属纤维束的直径为0. 3-0. 8厘米，所述金属纤维束的直径具体为0. 5厘米；所述金属纤维束具体由若干条直径为20-25微米的金属纤维组成；所述金属纤维束尤其具体由若干条直径为20微米或25微米的金属纤维组成；所述设于所述套筒外的金属纤维束的长度为0. 2-0. 5厘米，所述设于所述套筒外的金属纤维束的长度具体为0. 5厘米。
8.根据权利要求6或7所述的金属刷，其特征在于所述金属纤维束和所述套筒固定连接。
9.一种用于配制所述重组农杆菌菌液的培养基，按照如下方法制备将乙酰丁香酮、 SilweetL-77和1/2MS液体培养基混合，得到培养基，所述乙酰丁香酮在所述培养基中的浓度为150μΜ-250μΜ ；所述SilweetL-77在所述培养基中的浓度为0. 005% -0. 015% (体积百分比)。
10.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于所述乙酰丁香酮在所述培养基中的浓度为200 μ M ；所述SilweetL-77在所述培养基中的浓度为0. 01% (体积百分比)。
全文摘要
本发明公开了一种植物茎尖转化方法及其专用工具。本发明提供的培育转基因植物的方法，包括如下步骤1)用如下所述的金属刷刺伤所述目的植物的茎尖生长点，得到处理后目的植物；2)用含有目的DNA的菌液侵染步骤1)得到的所述处理后目的植物，得到浸染后幼苗；3)将步骤1)得到的浸染后幼苗依次进行共培养和继续培养，得到含有所述目的DNA的转基因植物。本发明的实验证明，分别以单子叶植物小麦和双子叶植物盐角草幼苗的茎尖分生组织为农杆菌转化受体，通过对茎尖损伤工具的改造、对幼苗苗龄的研究，及辅助真空渗透处理和助渗剂使用等措施，建立了一套高效快速的植物转化体系，提高了茎尖转化效率。
文档编号A01H5/00GK102321662SQ20111019727
公开日2012年1月18日 申请日期2011年7月14日 优先权日2011年7月14日
发明者吕素莲, 李银心 申请人:中国科学院植物研究所