专利名称：玉米淹水胁迫响应zmERF12基因启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及玉米淹水胁迫响应zmERF12基因启动子，属植物基因工程技术领域。
背景技术：
南方玉米在正常的生长环境中，由于季节性降雨，在苗期经常遭受绵绵春雨，在花期和灌浆期则往往遭遇梅雨。在长期阴雨下，排灌系统不良及地下水位升高等原因造成土壤溃水，使玉米根系长期处于低氧状态，导致产量下降15% -25%，有时甚至高达50%。溃害已成为南方玉米稳产和高产的重要制约因素。因此，了解玉米对溃害的耐/敏反应、鉴定重要的耐溃基因，对于阐明玉米耐溃性的分子生物学机理和玉米的耐溃性的遗传改良十分重要。ERF基因是参与植物非生物胁迫响应的关键基因之一，是水稻、深水稻和拟南芥淹·水胁迫响应的关键基因。因此，克隆玉米ERF基因的启动子，有助于阐明玉米耐溃性形成的分子机制，同时为玉米及其他旱生作物的耐溃遗传改良提供理论指导。然而，玉米ERF启动子的克隆，目前，尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供玉米淹水胁迫响应zmERF12基因启动子，并提供zmERF12基因启动子在植物耐溃遗传改良中的应用。本发明的技术方案是I、zmERFI2基因的获得根据已知的玉米基因组信息，使用烟草ERF2蛋白的AP2/ERF结构域高度保守的蛋白质序列，进行同源比对分析，电子克隆出121个ERF基因。通过与拟南芥、水稻、烟草等其他植物ERF基因的比较分析，剔除48个假阳性，获得了 73个ERF基因，分别命名为zmERFl—zmERF73。玉米自交系Hz32的耐溃性较强，而Mol7耐溃性较弱，在玉米3叶I心期，分别对Hz32和Mol7进行0、4、12h的淹水处理，并利用real-time PCR对73个ERF基因在各处理根系的表达进行了分析，结果发现zmERF12基因在Mol7根系受淹水诱导高效表达，而在Hz32根部表达量较低，结果也暗示zmERF12基因的启动子是淹水胁迫响应的诱导型启动子。2、玉米自交系Mo 17叶片总DNA的提取取玉米叶片5. Og于液氮中研磨,转入50ml离心管中。加预热至95°C的CTAB缓冲液(I. 17MNaCL、0. 0016M EDTA-8. 0,0. 835M Ttis-7. 5,1. 6% CTAB, 1% β-疏基乙醇)10ml，混匀。在65°C水浴锅内反应90分钟，不时轻摇离心管。取出离心管，待冷至室温后，加入等体积氯仿异醇(24 I)，小心摇动试管10分钟。8000rpm离心10分钟，将上清转至另一 50ml离心管中。加2/3体积异丙醇，小心混匀，将棉絮状DNA转入盛IOml 70%乙醇的50ml离心管中，浸泡12小时。倒掉70%乙醇，将DNA晾干，加入Iml TE溶解。待DNA完全溶解后，转入2. Oml离心管中，加入10 μ I 10mg/ml RNaseA,混勻；在37°C下,温育2小时。再用Iml苯酚氯仿异戊醇(25 24 I)抽提一次，8000rpm离心10分钟。将上清液转入2. Oml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC (PH5. 2)，2/3体积异丙醇沉淀DNA。将棉絮状DNA转入2. Oml离心管中，用70%乙醇洗涤一次，短暂离心，使DNA贴壁，倒去70%乙醇，晾干DNA。待DNA晾干后，加入0.5ml T. E溶液，完全溶解DNA，于_20°C长期保存。3、zmERF12基因启动子的克隆根据玉米自交系B73 zmERF12基因的启动子序列，设计一对特异引物，左引物5' TGGAGTGGACAGTGGAGTGGGAG3'，右引物5' CTCCCACTCCACTGTCCACTCCA3'。以 Mo 17 的DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为2. 5μ I 10XPCR缓冲液，2 μ I IOmMdNTPs，I μ I IOmM特异引物，I μ I IOmM特异右引物，I单位Taq酶，40ng模板DNA，总体积25 μ I。PCR扩增程序为95°C 3分钟；95°C I分钟，61°C I分钟，72°C 2分钟30秒，循环35次；72°C 7分钟；4°C 30分钟。PCR扩增产物于I %琼脂糖凝胶中120伏直流电压电泳45分钟，使用北京全式金生物技术有限公司的凝胶回收试剂盒，回收特异DNA片段，并将该DNA 片段连接到PGEM-T easy载体上，进行DNA测序。4、转化载体的构建使用带酶切位点的引物(左引物加HindIII酶切位点，右引物加BamHI酶切位点)，以玉米自交系Mo 17基因组DNA为模板进行PCR扩增。使用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增特异DNA片段,并与pGEM-T easy载体连接,转化Escherichia coli ToplO,生长在含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体平板上的白色菌株被分离出来。经PCR检测，选择阳性克隆进行DNA测序。抽提含zmERF12启动子序列正确的质粒DNA，使用HindIII和BamHI限制性内切酶同时酶切质粒，I %琼脂糖凝胶电泳，回收zmERF12启动子片段。使用HindIII和BamHI限制性内切酶同时酶切pBI121质粒载体，回收载体片段。将zmERF12启动子片段与pBI121载体片段在体外进行链接，构建成pBI121-zmERF12-GUS载体，并使用冻融法转化到农杆菌GV3101菌株中。对所克隆的zmERF12基因启动子进行DNA测序，其DNA序列如下zmERF12基因启动子DNA序列TGGAGTGGACAGTGGAGTGGGAGGTTGCTGTGTCTCGGAGCTGTGTGGCGGGCGCGCTGCCTTATATAGACAATAGAGGCGCGTCTGGCTGGCGACGAGTGCGTGTGCCGGGGCTGCGGTGGAGAGTGCTGACGCGGCAAAGGCAACGAACGGCGGCAGCTTCCTGACGAGAAGCCGTGGGCCGCTCCCAAATCCGGAGCCGTCGTTCAGTTCAGGCAGCGTGTGTTCCGAGCCTCGCTTCCGGAGCTGCGGTGGCGGTTTTTCAACGGCACAGGACCACCATTACGCTGCTGCTGGACGATGTGCGGACCACGGTTTGGGATCCGCCGGCGCCGATCCGGTCCGGCGGCCTCTGTTTTCGTTTTCTCCGTCGCCACGGCTGTTACTGCTAGCTTTGATGCACGCCTGCAGGTAGCCTGCCACGTGTGCCTAGCACTGTGGCACGTGCTAACCACACGCCCGCCGTTTGTTTTGCTTACCACGCAAACACGTAGTGCTTCATCTGTCAACAAAGAATACAACCCCTAAATTACCTATGGGTTAAAATAGTTTTATGTTTAGCCAACCTTCTAAGTAGTAAATAGTATATTCACAGCTATAGCTTTAAACTAATTTATTATCAAAAATGCAATTCATACTTTAATCTAATAGTATTATATTGTTTTAATACCGTACATACTAATATCTGTTCATATATTATTTACCAAACTTATGATATTCTTATACTATGGTACTACGCTTAAAATTGTATTCTTCCATGGAGTACCTGCTTATTTCACGTGACTGAAGAACCAACTTTTTCGTAGGTACTAGGTTTCTTTTTCACCTGAATACGACGCAGACGATTTAAGATACCAGAGATAACGATGACGTCACGTCGCCTTTTTTCCCCCTATTTGCTTTTGACTACATATATAATATAGT
CAAGTTGGAGTATACTTATATATTATATATAGCCTACTTTGTCGTCGGCCGCCGGAAGAGACGGCGACTCTGAAATCTGAAAGAAATAAAACAGCGACGAAAGGAGGTAGCTCCCTCCCTACCTCTCCACTTGAAACG5、zmERFI2启动子拟南芥植株的获得将含pBI121-zmERF12-GUS载体的GV3101农杆菌接种于LB液体培养基，加入利福平和卡那霉素至终浓度为100mg/L，28°C振荡培养。离心收集菌体，用ddH20稀释至OD =O. 8,每IOOml菌液加入5. Og鹿糖和50 μ I Silweet L-77。使用floral dip方法对拟南芥进行转化，成熟后收获种子，将种子播在含100mg/L卡那霉素的MS固体筛选培养基上。从筛选培养基中长出的抗性植株，经PCR检测后确定为转zmERF12启动子阳性植株。·6、zmERFI2启动子活性的检测将转zmERF12拟南芥于苗期进行淹水处理24h，分别对正常生长和淹水处理的转基因拟南芥幼苗进行⑶S组织化学染色。结果发现，在正常生长条件下，转zmERF12启动子拟南芥植株的根和叶片，未出现GUS染色的蓝色；而淹水条件下，转zmERF12启动子拟南芥的根呈现较强的⑶S蓝色，叶片未见GUS蓝色。研究表明zmERF12启动子既是一个在根中表达的组织特异型启动子，同时也是一个淹水诱导表达的诱导型启动子。本发明与现有的技术相比具有如下有益效果I、zmERF12启动子直接驱动外源基因的转基因植物，淹水条件下快速高效启动外源基因在植株根部的大量表达，可以提高植株的耐溃性，或抗虫、抗病等能力。2. zmERF12启动子直接驱动外源基因的转基因植物，由于外源基因只在淹水条件下诱导表达，且表达部位仅局限于根部，所以对于食用非根部的转基因植物，不存在转基因食品安全问题。3、zmERF12启动子为淹水条件下诱导表达的诱导型启动子和只在根部特异表达的组织特异性启动子、是启动能力较强的强启动子。
具体实施例方式把zmERF12启动子克隆到转化载体上，其后连接一个Tnos终止子，构建成一个转化载体。将所转化的目的基因以正确的方向，克隆到zmERF12启动子与Tnos终止子之间，构建好转化载体。然后通过基因枪轰击法或农杆菌法介导法将目的基因转化到受体细胞中，通过组织培养等技术手段获得转基因植株。在涝溃、淹水条件下，zmERF12启动子可以启动目的基因在植株根部大量表达。
权利要求
1.玉米淹水胁迫响应zmERF12基因启动子，其特征在于zmERF12基因启动子的DNA序列为
2.根据权利要求I所述的玉米淹水胁迫响应zmERF12基因启动子，其特征在于所述的启动子是从玉米自交系Mol7中克隆获得的。
3.根据权利要求2所述的玉米淹水胁迫响应zmERF12基因启动子，其特征在于在涝溃、淹水条件下，zmERF12启动子可以启动目的基因在植株根部大量表达。
全文摘要
本发明涉及玉米淹水胁迫响应zmERF12基因启动子，其特征在于公开了zmERF12基因启动子的DNA序列，该启动子的特征是含有2个G-box、5个ABRE、1个CCAAT-box、4个CGTCA-motif、1个GARE-motif、1个GC-motif、1个TCA-element、1个TGA-element和1个as1顺式元件，这些顺式元件与植物激素、厌氧胁迫响应相关，是一个组织特异型的启动子，只在根系中表达；是一个诱导型的启动子，受淹水诱导高效表达。该启动子在淹水、涝渍条件下，可提高转基因植株根部的抗虫、抗病、抗逆境能力；同时只在根部表达，不涉及食用转基因植物地上部分的食品安全问题；在旱生植物的耐渍遗传改良中，具有很好的应用前景。
文档编号A01H5/00GK102876673SQ20111019920
公开日2013年1月16日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者黄敏, 杜何为, 张祖新, 陈威, 黄育刚, 范金香, 吴闯 申请人:长江大学