一种用于烟草花粉的高效诱变方法

文档序号:355859阅读:208来源:国知局
专利名称:一种用于烟草花粉的高效诱变方法
技术领域
本发明涉及烟草诱变技术领域,特别是涉及一种用于烟草花粉的高效诱变方法。
背景技术
烟草(Nicotiana tabacum L,.)在植物分类学上属于双子叶植物纲 (Dicotyledoneae)、管花目(Tubifiorae)、爺禾斗(Solanaceae)烟草属(Nicotiana),是许多国家的重要经济作物,其中烤烟(2n = 2411)是中国也是世界上种植面积最大的烟草类型。长期以来,由于烟草育种中过度使用为数不多的几个主体亲本,加之定向选择,使得育成品种遗传基础狭窄、品种单一化现象日趋严重,导致很难培育出有较大突破性的新品种,经常出现新品种“审而不种”的尴尬局面,也给以遗传多样性为基础的分子标记遗传连锁图谱构建和基因定位带来了较大困难。已有的研究表明,尽管不同烟草种间遗传多样性较种内稍显丰富,但相比其他农作物如水稻、油菜、玉米等其种质资源间的遗传多样性仍相差甚远。因为对种间杂交后代性状的改良其难度更大,所需时间更多,因此在实际的育种工作中较少会利用种间杂交方式培育新品种,而更多的是利用同一烟草类型即种内亲本来选育品种以缩短对目标后代综合性状的改良时间。因此,国内许多烟草科技工作者试图通过物理和化学等人为诱变的方法以有效拓宽烟草狭窄的遗传背景,丰富其种质资源的遗传多样性,这些诱变方法一般是利用X-射线、Y-射线、6°Co Y、中子、高速离子、宇宙射线等物理因素,或者甲基磺酸乙酯 (EMS)、硫酸二乙酯(DEQ、叠氮化钠、碱基类似物、PEG等化学因素对烟草种子、幼苗、茎尖、 幼胚、合子等组织进行诱变处理,也取得了一些较好的成果。但这些诱变处理不同程度的存在诱变剂难吸收、诱变频率低、变异幅度小、后代筛选难度大、产量低及易产生嵌合体等问题。

发明内容
本发明根据现有技术的不足提供一种用于烟草花粉的高效诱变方法,该方法在烟草花粉离体液体培养的游离状态下施以EMS化学诱变,可大大增强烟草遗传物质对外界诱变因素的敏感性,从而成倍提高诱变频率和变异幅度,产生变异的花粉再经过加倍处理后以纯合二倍体的形式将突变性状予以很好的保持和固定,克服了基因表达上显隐性的障碍,有利于选择,且大大缩短了突变体性状稳定的周期,节省了育种时间为实现上述目的,本发明所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法,其具体步骤依次如下(1)样品采集取烟株主花序或侧花序上健康的、花粉处于单核靠边期的适龄花蕾,迅速保存于冰盒;(2)消毒处理在超净工作台上剥取花蕾中的花药,将取出的花药用无菌纱布或无菌市售丝袜装好浸入70-75%浓度的乙醇中消毒10-1 ,再浸入饱和次氯酸钙溶液中浸泡8-lOmin,最后用无菌水漂洗多次;
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(3)收集花粉将步骤2中消毒处理后的花药放入圆底试管中,加入l_3ml的 B5-13液体培养基,再加入l_2ml用于软化花药壁的酶液,碾成勻浆,然后用装有300-400目双层尼龙膜的漏斗进行过滤,并用离心管收集滤液,离心处理后去上清液,加B5-13液体培养基重新悬浮,再次离心处理后去上清液;(4)诱变处理将步骤3中经过两次离心处理后收集的花粉用B5-13液体培养基悬浮,加入浓度为0. 1-0. 2 %的EMS (甲基磺酸乙酯)溶液进行诱变处理,放入温度为 30-32°C的环境下避光培养8-10h ;(5)加倍处理将步骤4中诱变处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清液8-lOmin,再用NLN-16液体培养基悬浮后转入玻璃容器中,放置在温度为30_32°C的环境避光培养50-70h,进行加倍处理;(6)诱胚培养将步骤5中的加倍处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清液,用NLN-13液体培养基悬浮花粉,转入培养皿中,放置在温度为M_26°C的环境下, 进行避光诱胚培养14-21d,待培养皿中出现幼胚,便将培养皿放置转速为56-65r/min的摇床内,在温度为M_26°C环境下避光振荡培养6-8d ;(7)继代培养将步骤6中培养皿内出现子叶的胚转移到MS固体培养基上,在温度为25-27°C、日光照为8-lOh的环境中进行继代培养;(8)幼苗转植对步骤7中继代培养的幼苗进行炼苗,将通过炼苗后的幼苗根部的培养基清洗干净,移栽到温室的花钵中假植或者直接栽种于大田中进行突变体鉴定。步骤1中所述的适龄花蕾为长度在2. 0-2. 3cm之间、花冠与花萼等长、花粉发育时期为单核靠边期的花蕾。步骤2中的饱和次氯酸钙的浓度为10% ;无菌水漂洗2-3次,每次4-6min。步骤3中所述酶液为纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶和水的混合液,酶液中纤维素酶、 果胶酶和蜗牛酶的质量浓度分别为0. 6%,0. 2%和0. 5%。步骤3中第一次离心时间5min, 转速1000r/min,二次离心时间5min,转速500r/min ;步骤5和6中的离心处理时间都为 5min,转速 800r/min。步骤5中NLN-16液体培养基中秋水仙素的浓度为45_65mg/L。步骤5中加倍处理的玻璃容器为IOOml三角瓶,每瓶装IOml溶液,密度为3_4蕾 /ml。本发明在烟草花粉离体液体培养的游离状态下施以EMS化学诱变,可大大增强烟草遗传物质对外界诱变因素的敏感性,从而成倍提高诱变频率和变异幅度,较容易产生超诱变材料,而产生变异的花粉再经过加倍处理后以纯合二倍体的形式将突变性状予以很好的保持和固定,克服了基因表达上显隐性的障碍,有利于选择,且大大缩短了突变体性状稳定的周期,节省了育种时间。本发明所述的烟草花粉诱变方法对不同烟草类型均适用。实践证明,用本发明的方法对处于离体液体培养状态下的烤烟花粉进行诱变处理,具有诱变频率高、变异幅度大、 变异类型丰富及较容易获得性状纯合的变异材料等优点,在拓宽烟草遗传背景、丰富遗传多样性、增加分子标记多态性、创新种质资源及花粉发育进程研究等方面,具有较大的实用价值。
具体实施例方式实施例1 烤烟材料1花粉离体液体培养诱变,其操作步骤如下(1)、样品采集取烤烟烟株主花序上单核靠边期的健康适龄花蕾,长度范围为 2. 0-2. 2cm,取好的花蕾迅速用4-7°C的冰盒保存;O)、消毒处理将步骤1中冰盒内的花蕾取出,在超净工作台用镊子小心剥取出花蕾中的花药,用无菌纱布装好花药浸入70 %的乙醇中15s,再浸入10 %的饱和次氯酸钙溶液中8min,用无菌水冲洗3次,每次5min ;(3)、收集花粉将步骤2中消毒处理后的花药放入圆底大试管中,加入2ml的 B5-13液体培养基(B5基本培养基中蔗糖浓度为13 % ),再加入l_2ml纤维素酶质量浓度为 0. 6%、果胶酶质量浓度为0. 2%和蜗牛酶质量浓度为0. 5%的混合酶液用于软化花药壁, 之后用圆头玻璃棒碾成勻浆,用装有300目双层尼龙膜的漏斗进行过滤,并用IOml的离心管收集滤液,离心5min,转速lOOOr/min,去掉上清液,加B5-13液体培养基重新悬浮,离心 5min,转速500r/min,去上清夜;(4)、诱变处理将步骤3中经过两次离心处理后收集的花粉用B5-13液体培养基悬浮,加入浓度为0. 的EMS溶液6ml进行诱变处理,放置于温度为30°C的环境中避光培养IOh ;(5)、加倍处理将步骤4中的诱变处理后的溶液移入离心管中,离心8min,转速 900r/min,去掉上清液,用秋水仙素浓度为45mg/L的NLN-16液体培养基悬浮后转入IOOml 三角瓶进行加倍处理,每瓶10ml,密度3蕾/ml,32°C避光培养55h ;(6)、诱胚培养将步骤5中的加倍处理后的溶液移入离心管中,离心5min,转速800r/min,去掉上清液,用NLN-13液体培养基悬浮花粉,转入培养皿中,放置在温度为 M-26°C的环境下,避光诱胚培养18d,待幼胚出现即可用转速为65r/min的摇床在避光振荡培养6d ;(7)、继代培养将步骤6中出现子叶的胚移置于MS固体培养基进行继代培养,其温度为25°C,每日光照IOh ;(8)、幼苗转植移栽季节幼苗经炼苗2-3d后即可移栽到温室的花钵中假植或者于烟苗移栽季节直接栽种于大田中进行突变体鉴定,移栽前务必彻底清洗烟苗根系上附带
的培养基。对诱变处理后代的突变表型进行了初步鉴定,共获得双单倍体后代材料214株, 其中表型可明显分辨为突变的如皱叶、早花突变体共有2株,诱变频率达到了 0. 93%,其余材料外观与正常野生型植株无明显差别,待进一步开展其他性状鉴定,EMS对烟草种子的诱变频率一般< 0. 1%,这种方法提高了近10倍。实施例2、烤烟材料2花粉离体液体培养诱变,其操作步骤如下(1)、样品采集取烤烟烟株侧花序上单核靠边期的健康适龄花蕾,长度范围为 2. 1-2. 3cm,取好的花蕾迅速用冰盒4-7°C保存;O)、消毒处理将步骤1中冰盒内的花蕾取出,在超净工作台上小心剥取花蕾中的花药,用无菌市售丝袜装好花药浸入75%的乙醇中10s,再浸入10%的饱和次氯酸钙溶液中lOmin,用无菌水冲洗2次,每次5min ;(3)、收集花粉将步骤2中消毒处理后的花药移入圆底大试管中,加入3ml的B5-13液体培养基(B5基本培养基中蔗糖浓度为13% ),再加入l_2ml纤维素酶质量浓度为0. 6%、果胶酶质量浓度为0. 2%和蜗牛酶质量浓度为0. 5%的混合酶液用于软化花药壁,之后用圆头玻璃棒碾成勻浆,用装有400目双层尼龙膜的漏斗进行过滤,并用IOml的离心管收集滤液,离心5min,转速lOOOr/min,弃上清液,加B5-13液体培养基重新悬浮,离心 5min,转速500r/min,去掉上清夜;(4)、诱变处理将步骤3经过两次离心处理后收集的花粉用6mlB5_13液体培养基悬浮,加入浓度为0. 2%的EMS溶液細1进行诱变处理,32°C避光培养他;(5)、加倍处理将步骤4中的诱变处理后的溶液离心9min,转速800r/min,弃上清液,用秋水仙素浓度为65mg/L的NLN-16液体培养基悬浮后转入IOOml三角瓶进行加倍处理,每瓶10ml,密度4蕾/ml,30°C避光培养69h ;(6)、诱胚培养将步骤5中的加倍处理后的溶液移置离心管中,离心5min,转速800r/min,去掉上清液,用NLN-13液体培养基悬浮花粉,转入培养皿中,放置在温度为 2446°C的环境下避光诱胚培养21d,待幼胚出现即可用转速为55r/min摇床在温度为
的环境下避光振荡培养8d,;(7)、继代培养将步骤6中出现子叶的胚移置于MS固体培养基进行继代培养,温度为^°C,每日光照8h;(8)、幼苗转植移栽季节幼苗经炼苗2-3d后即可移栽到温室的花钵中假植或者于烟苗移栽季节直接栽种于大田中进行突变体鉴定,移栽前务必彻底清洗烟苗根系上附带
的培养基。对诱变处理后代的突变表型进行了初步鉴定,共获得双单倍体后代材料125株, 发现迟花多叶突变体1株,其余材料外观与正常野生型植株无明显差别,表型突变率达到了 0. 8%,也高于EMS对烟草种子的诱变频率。NLN四个母液配方如下1.大量元素(20倍),单位g/L
权利要求
1.一种用于烟草花粉的高效诱变方法,其特征在于所述方法依次按以下操作步骤进行(1)样品采集取烟株主花序或侧花序上健康的、花粉处于单核靠边期的适龄花蕾,迅速保存于冰盒;(2)消毒处理在超净工作台上剥取花蕾中的花药,将取出的花药用无菌纱布或无菌市售丝袜装好浸入70-75%浓度的乙醇中消毒10-15s,再浸入饱和次氯酸钙溶液中浸泡 8-lOmin,最后用无菌水漂洗多次;(3)收集花粉将步骤2中消毒处理后的花药放入圆底试管中,加入l_3ml的B5-13液体培养基,再加入l_2ml用于软化花药壁的酶液,碾成勻浆,然后用装有300-400目双层尼龙膜的漏斗进行过滤,并用离心管收集滤液,离心处理后去上清液,加B5-13液体培养基重新悬浮,再次离心处理后去上清液;(4)诱变处理将步骤3中经过两次离心处理后收集的花粉用B5-13液体培养基悬浮, 加入浓度为0. 1-0. 2 %的EMS溶液进行诱变处理,放入温度为30-32°C的环境下避光培养 8-10h ;(5)加倍处理将步骤4中诱变处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清液 8-lOmin,再用NLN-16液体培养基悬浮后转入玻璃容器中,放置在温度为30_32°C的环境避光培养50-70h,进行加倍处理;(6)诱胚培养将步骤5中的加倍处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清液,用NLN-13液体培养基悬浮花粉,转入培养皿中,放置在温度为M_26°C的环境下,进行避光诱胚培养14-21d,待培养皿中出现幼胚,便将培养皿放置转速为56-65r/min的摇床内,在温度为M_26°C环境下避光振荡培养6-8d ;(7)继代培养将步骤6中培养皿内出现子叶的胚转移到MS固体培养基上,在温度为 25-27°C、日光照为8-lOh的环境中进行继代培养;(8)幼苗转植对步骤7中继代培养的幼苗进行炼苗,将通过炼苗后的幼苗根部的培养基清洗干净,移栽到温室的花钵中假植或者直接栽种于大田中进行突变体鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法,其特征在于步骤1中所述的适龄花蕾为长度在2. 0-2. 3cm之间、花冠与花萼等长、花粉发育时期为单核靠边期的花蕾。
3.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法,其特征在于步骤2中的饱和次氯酸钙的浓度为10% ;无菌水漂洗2-3次,每次4-6min。
4.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法,其特征在于步骤3中所述酶液为纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶和水的混合液,酶液中纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶的质量浓度分别为0. 6%、0. 2%和0. 5%。
5.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法,其特征在于步骤3中第一次离心时间5min,转速1000r/min,二次离心时间5min,转速500r/min ;步骤5和6中的离心处理时间都为5min,转速800r/min。
6.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法,其特征在于步骤5中 NLN-16液体培养基中秋水仙素的浓度为45-65mg/L。
7.根据权利要求1所述的一种用于烟草花粉的高效诱变方法,其特征在于步骤5中加倍处理的玻璃容器为IOOml三角瓶,每瓶装IOml溶液,密度为3_4蕾/ml。
全文摘要
本发明涉及一种用于烟草花粉的高效诱变方法。该方法是在无菌条件下获取烟草花粉并置于液体培养基中用浓度为0.1-0.2%的EMS在30-32℃的环境下避光诱变处理,再用NLN-16液体培养基在30-32℃避光环境下进行染色体加倍处理,之后置于NLN-13液体培养基中在24-26℃的环境下避光进行诱胚培养,待幼胚出现即可用24-26℃摇床避光振荡培养,最后出现子叶的胚置于固体培养基进行继代培养,移栽季节幼苗经炼苗后即可移栽入大田进行突变性状鉴定。本发明克服了基因表达上显隐性的障碍,有利于选择,且大大缩短了突变体性状稳定的周期,节省了育种时间;具有变异幅度大、诱变频率高等特点。
文档编号A01H4/00GK102293154SQ20111020035
公开日2011年12月28日 申请日期2011年7月18日 优先权日2010年12月13日
发明者张俊杰, 曹景林, 杨树, 林国平, 王毅, 蔡长春 申请人:湖北省烟草科研所
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