专利名称：擎天凤梨ACC oxidase基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体的说，是涉及一种擎天凤梨乙烯合成途径的关键酶——ACC oxidase基因及应用。
背景技术：
擎天凤梨属植物是我国花卉市场上十分流行的高档盆栽花卉，原产于南美洲的热带地区。该属是市面上观赏凤梨中栽培品种最多的属，与食用凤梨——菠萝一样同属于凤梨科植物。乙烯作为一种植物激素，在植物整个生命周期中起着至关重要的作用，它对植物的种子萌发、生长发育、叶片和花器官的衰老、果实成熟、性别分化等有广泛的影响。ACC 氧化酶(ACC oxidase)，又称乙烯形成酶(EFE)，是乙烯合成途径中的关键酶，它催化乙烯合成的最后一步。现已从很多种植物中克隆得到其全长序列如牡丹(杨英军等，2008)、 卡特兰(郑宝强等，2008)、郁金香(金晓玲，2008)、百合(刘鲜艳等，2008)、矮牵牛(Tang et al, 1993)、仙人掌(Collazo-siques et al, 2003)、柿(Nakano et al, 2003)、甜瓜 (Lasserre et al, 1996)等。自1990年HamiIton首次利用ACC氧化酶反义RNA技术，生产出世界上首例转基因植株以来(Hamilton et al，1990)，对ACC氧化酶采用正反向或RNAi法转化目标植物的研究也已取得了很大进展，如在花椰菜(陈银华等，2005)、番茄(Hamilton et al，1990)、柿果 (张丽等，2007)、甘蔗(王爱勤等，2008)、甜瓜(Ayub et al，1996)、烟草(黄永红等，2005)、 香石竹(余义勋和包满珠，2004 ；张树珍等，2003 ；Savin, 1995)等植物上都已取得成功。许多已有的研究结果表明乙烯的抑制表达则会使得花期延长，延缓衰老或者延迟果实成熟、 达到保鲜和耐贮藏的目的。这些研究多采用反义RNA技术或RNAi技术手段来降低乙烯含量达到延长观赏花期的目的。如香石竹(刘会超等，2005 ；余义勋和包满珠，2004)，康乃馨 (Savin Kff，1995; Woodson W R，1992 ；张树珍等，2003)，郁金香(金晓玲等，2008)、牡丹(杨英军等，2008)等。抑制ACO活性延迟果实成熟、保鲜和耐贮藏的目的，如香蕉(黄俊生等， 2005)、甜瓜(Guism et al, 1997)、花椰菜(陈银华等，2005)、芥菜(Pua E C and Lee J E Ε, 1995)、砂梨(乔玉山等，2008)等。此外，擎天凤梨生长缓慢，营养生长期长，需要较长一段时期才能开花，生产上常采用人工催花的方式来促使植株提早开花以便于上市销售，达到降低生产成本，提高生产效益之目的。而所用药剂主要为乙烯(乙烯利KDanijela et al，2006)。外施乙烯利、摇震和ACC应用等可导致乙烯增加的处理都可以促进果子蔓属植物的开花(石兰蓉，2005)。 乙烯能引起所有经实验的凤梨科植物迅速开花，是诱导观赏凤梨成花的关键因素(石兰蓉， 2005)。外施乙烯对凤梨的催花作用机理虽然未知，但一般认为与内源乙烯的生物合成及其传导机制有着密切的联系。在凤梨从幼年期生长发育达到成熟后，乙烯似乎是其惟一控制成花的因素，用乙烯生物合成抑制剂AVG可以完全抑制梨的开花，并且这种抑制反过来可以被随后的乙烯处理所逆转(De Greef et al, 1989; De Greef et al, 1983;石兰蓉， 2005)。因而凤梨植株内部的乙烯含量对其成花作用具有关键性的作用，获取凤梨乙烯生物合成关键酶基因，通过分子调控手段提高内源乙烯的含量对于促进凤梨花期提前具有十分重要的应用价值。在凤梨科植物中，国内外已开展了不少关于乙烯合成基因的研究，但主要集中在食用凤梨(菠萝)上，在菠萝上开展的关于克隆乙烯生物合成相关基因以及采用遗传调控手段调控乙烯合成以控制花期的研究，已取得了一定的进展。如台湾国立中兴大学生命科学系(所)的林金和游志文1994年即开展了延迟凤梨(Pineapple)自然开花之调控研究，内容主要为获取凤梨乙烯生物合成相关基因，采用antisense及RNAi技术来通过抑制乙烯合成来达到延迟其开花的目的。澳大利亚的Yuri Trusov和Jose' Ramo’ η Botella 克隆了一个菠萝的ACC合成酶基因，然后通过沉默ACC合成酶基因来延迟菠萝开花的研究，获得了两个ACC合成酶基因被抑制的株系，其开花时间被明显延迟(Yuri and Jose et al，2006)。而在观赏凤梨中相关的研究则很少，公开的文献中未见报道，基因库(GenBank) 中只有两条乙烯应答基因的部分cDNA片段(AY263359，AY294285，1)，而乙烯生物合成相关基因(包括ACC氧化酶)则没有。ACC氧化酶基因的分离对于促进观赏凤梨提前开花具有重要应用价值。参考文献如下
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发明内容
本发明提供了一种取自擎天凤梨的ACC oxidase基因及其用途。该基因为擎天凤梨乙烯合成过程中的关键酶编码基因，在促进擎天凤梨提前开花上具有重要应用价值。本发明的具体技术方案如下
本发明是一种擎天凤梨ACC氧化酶基因，具有SED ID N0:3所示的核苷酸序列。本发明所述的擎天凤梨ACC氧化酶，具有SED ID NO: 2所示的氨基酸序列。本发明所述的ACC氧化酶基因的分离，具体步骤如下
(1)全长cDNA序列的获得
以申请者前期构建成功的擎天凤梨属栽培种Ostara早期花器官cDNA全长文库，并随机规模测序获得了三个ACO的EST (同属于一个Contig)为基础，取其中一个单克隆进行 Primer Walking 测序，获得其全长 cDNA 序列(SED ID N0:1)；
(2)DNA序列的获得
以获得的全长cDNA序列(SED ID NO: 1)为基础，从两末端设计特异引物，以基因组为模板扩增获得DNA序列(SED ID NO: 3)；
(3)功能分析、预测
对获得的全长cDNA序列(SED ID NO: 1)及其编码蛋白氨基酸序列(SED ID N0:2) 分别进行BlastN、BlastP比对，预测其为ACC氧化酶基因；
(4)ACO基因的大肠杆菌表达
为验证获得的序列是一个有效的蛋白编码信息，将cDNA序列(SED ID N0:1)的编码区插入到原核表达载体中，并转化大肠杆菌，IPTG诱导表达；
(5)ACO基因的组织表达谱研究
为验证该基因在植株组织中的表达分布情况，采用实时定量PCR技术检测了该基因在根、茎、叶、苞片、花器等五个组织中的表达情况；
(6)ACO基因的功能验证
为验证该基因植物中的功能效果，构建该基因的植物超表达载体，并转化拟南芥，观察转化后代的开花习性，验证其生物学功能。本发明所述的基因应用于促进植物的提前开花。本发明的研究目的在于
1 提供一种分离出的ACC oxidase基因；包括DNA序列和cDNA序列； 2 提供一种ACC oxidase基因编码的蛋白质氨基酸； 3、提供一种包含上述基因的原核表达载体。本发明的有益效果如下
本发明在促进擎天凤梨植物提前开花方面具有应用价值，具体说来，即采用行业内熟知的分子调控技术过表达ACO基因(如正义RNA技术)，转化植株则可促进提前开花；抑制表达ACO基因(如反义RNA技术、RNAi技术)并转化植株则可延长观赏花期。
图1为全长CDNA序列BlastN分析数据图 图2为蛋白氨基酸序列的BlastP分析数据图.； 图3为原核表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测图4为ACC oxidase基因在不同组织中的表达情况； 图5为编码蛋白氨基酸序列在cDNA序列对应部分的示意图。
具体实施例方式下面通过具体实施例结合说明书附图对本发明的技术方案作进一步说明。实施例1
申请者前期构建成功的擎天凤梨属栽培种Ostara早期花器官cDNA全长文库，并随机规模测序(具体见申请者文章)，经Blast分析确定有三个EST属于ACO基因，且同属于一个 Contig，S卩|ppfca0_001923. zl. scf|ppfca0_0002_G12. abl|ppfca0_001745. zl. scf|, 由于所建文库为全长cDNA文库，文库中有较大部分克隆为全长cDNA，因而随机挑取了 ppfca0_001923. zl. scf单克隆进行Primer Walking测序方式来测通全部插入片段信息。经Blast分析(如图1、图2)可知该序列为ACO基因的全长cDNA，全长1504bp (SED ID N0:1)。实施例2
以获得的全长cDNA序列为基础，分别从两端设计特异引物 Sl-2 :GGGGATTGTAGATTAGAGGCAATCG (SED ID N0:4) A1484-2 :GCATAAAATCTGCTTCACAATAGATTACAC (SED ID NO:5) 试剂=Long PCR Enzyme Mix (MBI, K0181) PCR反应体系
权利要求
1.一种擎天凤梨ACC氧化酶基因，其特征在于，具有SED ID N0:3所示的核苷酸序列。
2.—种擎天凤梨ACC氧化酶，其特征在于，具有SED ID NO: 2所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的ACC氧化酶基因的分离，其特征在于，具体步骤如下(1)全长cDNA序列的获得以申请者前期构建成功的擎天凤梨属栽培种Ostara早期花器官cDNA全长文库，并随机规模测序获得了三个ACO的EST (同属于一个Contig)为基础，取其中一个单克隆进行 Primer Walking 测序，获得其全长 cDNA 序列(SED ID N0:1)；(2)DNA序列的获得以获得的全长cDNA序列(SED ID NO: 1)为基础，从两末端设计特异引物，以基因组为模板扩增获得DNA序列(SED ID NO: 3)；(3)功能分析、预测对获得的全长cDNA序列(SED ID NO: 1)及其编码蛋白氨基酸序列(SED ID NO: 2) 分别进行BlastN、BlastP比对，预测其为ACC氧化酶基因；(4)ACO基因的大肠杆菌表达为验证获得的序列是一个有效的蛋白编码信息，将cDNA序列(SED ID N0:1)的编码区插入到原核表达载体中，并转化大肠杆菌，IPTG诱导表达；(5)ACO基因的组织表达谱研究为验证该基因在植株组织中的表达分布情况，采用实时定量PCR技术检测了该基因在根、茎、叶、苞片、花器等五个组织中的表达情况。
4.如权利要求1所述基因的用途，其特征在于，其应用于促进擎天凤梨提前开花及延长擎天凤梨的观花花期。
全文摘要
本发明属于植物基因工程领域，具体的说，是涉及一种擎天凤梨乙烯合成途径的关键酶——ACC oxidase基因及应用，提供了一种取自擎天凤梨的ACC oxidase基因及其用途。该基因为擎天凤梨乙烯合成过程中的关键酶编码基因，在促进擎天凤梨提前开花上具有重要应用价值，即采用行业内熟知的分子调控技术过表达ACO基因(如正义RNA技术)，转化植株则可促进提前开花；抑制表达ACO基因(如反义RNA技术、RNAi技术)并转化植株则可延长观赏花期。
文档编号A01H5/00GK102304531SQ20111021060
公开日2012年1月4日 申请日期2011年7月26日 优先权日2011年7月26日
发明者刘建新, 沈福泉, 王炜勇, 马广莹 申请人:浙江省萧山棉麻研究所