专利名称：珍稀食药用菌绣球菌的液体发酵培养方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及珍稀食药用菌绣球菌的液体发酵培养方法及其专用培养基。
背景技术：
绣球菌[Sparassis crispa(Wulf. )Fr]是一种名贵食药用菌，在生物分类上归属于真菌界(Kingdom Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、多孑L 菌目(Polyporales)、绣球菌科(Sparassidaceae)、绣球菌属(Sparassis)。绣球菌分布于我国吉林、黑龙江、云南等地， 在日本、欧洲、北美洲也有分布，夏末秋初生于云杉、冷杉或松林及混交林的地上。绣球菌主要活性成分葡聚糖含量丰富，日本食品分析化验所测定其含量为 43.6%，是灵芝、姬松茸的2倍以上，为菇类之最，且具有较高的药用、保健功能，在日本有 “梦幻之菇”之称。现代研究证实绣球菌具有抗肿瘤作用(Ohno et al. ,2000, Biol Pharm Bull, 23 (7) :866-872),免疫调节功能(Harada et al. ,2002, J Interferon Cytokine Res, 22 (12) 1227-1239)，促进伤口愈合作用(Kwon et al. ,2009, The American Journal of Surgery, 197(4) :503-509)，促进造血功能(Harada et al.，2002，Biological & pharmaceutical bulletin, 25 (7) :931-939)等等。绣球菌是新近人工开发、极具市场潜力的一种食药用菌，但是其野生数量稀少，生长区域有限，采集困难。虽然国内目前有关于绣球菌栽培成功的报道，但是其人工栽培条件苛刻，生长缓慢，生物转化率低，没有实现规模化生产。液体发酵具有周期短、产量高、不受环境限制、成本低等优点，因此通过液体发酵生产菌丝体，已成为满足市场需求的重要途径。国内绣球菌的专利主要是关于其人工栽培方面(绣球菌的人工栽培方法， 申请号CN200610050003. 1 ；—种绣球菌工厂化栽培基质配方及生产工艺，申请号 CN201010286462. 6)。文献调查发现绣球菌培养的研究多是固体培养，虽然有少许几篇液体发酵的报道，但是游雄等(绣球菌的诱变育种和深层发酵工艺的初步研究，中国食用菌2006 (3) :41-45)和刘成荣(绣球菌突变菌株液体发酵条件的研究，江西农业大学学报 2008(5) =898-902)均采用了绣球菌的突变菌株来研究，突变菌株用于保健食品和药品有着其局限性，而且菌株本身具有不稳定性。因此，开发一种具有适于绣球菌工业化液体发酵生产的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供珍稀食药用菌绣球菌的液体发酵专用培养基及其培养方法。本发明所提供的绣球菌的液体发酵培养基，每升培养基中含复合碳源20. 0-200. 0 克，糖 0-60. 0 克，蛋白胨 0-5. 0 克，KH2PO4 0-5. 0g, MgSO4 0-2. 5g，松针汁 O-IOOml，植物油 0-3. 0克，余量为水；调节pH值为2. 0-6.0。所述绣球菌培养基的优选组成为每升液体发酵培养基中含复合碳源 50. 0-200. 0 克，糖 20. 0-40. 0 克，蛋白胨 0-5. 0 克，KH2PO4 1. 0-3. 0g, MgSO4 0. 5-1. 5g，松针汁50-100ml，植物油0-3. 0克，余量为水；调节pH值为3. 0-5. 0。所述绣球菌培养基的最优组成为每升液体发酵培养基的组成如下复合碳源 100. 0-200. 0 克，糖 20. 0-30. 0 克，蛋白胨 1. 0-3. 0 克，KH2PO4 2. 0-3. 0g，MgSO4L 0-1. 5g，松针汁80-100ml，植物油2. 0-3. 0克，余量为水；调节pH值为3. 0-4. 0。本发明中所述复合碳源具体可选自下述至少一种土豆、玉米粉、玉米碴、黄豆粉和可溶性淀粉。所述糖可为单糖和/或双糖，具体选自下述至少一种蔗糖、葡萄糖、果糖、 麦芽糖、红糖和半乳糖，优选为红糖。所述植物油为大豆油。本发明培养基中所用的松针汁是按照下述方法制备的取松针20克加入IOOml水煮沸半小时，过滤定容至100ml，即得。上述绣球菌液体发酵专用培养基可按常规方法配制，如先将上述质量配比的复合碳源煮汁，过滤后，取上清液放入容器，再加入其它成分，加热溶解，使各种成分混合均勻， 用水定容至1L，并调节pH值，灭菌即可。本发明所提供的绣球菌液体培养方法，包括下述步骤将绣球菌(Sparassis crispa)接种于本发明所提供的液体发酵培养基中进行培养，得到绣球菌菌丝体。其中，所述培养在自然光照射条件下进行；所述培养的温度可为20-30°C，优选为 23-30°C，最优选为 2548°C。所述绣球菌的接种量为5. 0-20. 0%，优选为10-20%。所述培养为震荡培养，震荡转速为100-200rpm，优选为100_150rpm，最优选为 120rpm。用上述方法培养10-20天即可达到培养终点。本发明提供了一种绣球菌的液体发酵专用培养基及培养方法，突破了目前绣球菌仅能固体培养和人工栽培的局限。该培养基的原料简单、易得，而且可根据不同地方的实际情况选用不同的原材料，成本低廉。利用该培养基及本发明的培养方法发酵生产绣球菌菌丝体具有生长速度快、周期短、产率高(可达15. Og/L以上)、工艺简单、成本低等优点，适于绣球菌的工业化发酵生产。用本发明方法培养所得的绣球菌菌丝体可更大地满足市场需求。基于上述优点，本发明可产生较好的社会及经济效益，市场前景广阔。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。ACCC代表中国农业微生物菌种资源库实施例1、液体发酵绣球菌菌丝体的生产绣球菌专用液体发酵培养基的配方土豆200克，红糖40. 0克，蛋白胨3. 0克，大豆油 3. 0 克，KH2PO4 3. 0g, MgSO4 1. 5g，松针汁 100ml，用水定容至 IOOOmL, il pH 值为 4. 0。对照培养基土豆200克，葡萄糖20. 0克，pH值自然，用水定容至1000毫升。一、培养基的配制土豆的处理土豆去皮，切成小块煮沸半小时，然后用纱布过滤，得到土豆汁。松针汁的制备搜集脱落的松针，取松针20克加入IOOml水煮沸半小时，过滤定容至 100ml。
土豆汁中按上述配方加入松针汁、红糖、蛋白胨、大豆油、KH2PO4, MgSO4溶解，最后用水定容至1000毫升，调PH值为4.0。二、液体发酵绣球菌菌丝体的生产将绣球菌菌种(保藏编号ACCC 51488，购自中国农业微生物菌种资源库)接种于马铃薯固体培养基(PDA)上活化，培养温度25-28°C，培养时间14天。起始pH值为4. 0 下，按10 %的接种量将绣球菌菌种接种于上述绣球菌专用液体发酵培养基中，装瓶，然后在 25°C，转速120rpm，自然光照条件下进行振荡培养15d，6000rpm离心10分钟，去掉上清液， 得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率达15. 2g/L。同时按10%的接种量将绣球菌菌种接种于对照培养基中，在自然pH值条件下， 25°C，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养20d，6000rpm离心10分钟，去掉上清液， 得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率为0. 64g/L。将所得的绣球菌菌丝体提取基因组DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR 扩增(所用引物为ITS4和ITS5组成的引物对)并测序，在GenBank进行Blast分析。ITS4 5 ‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，；ITS5 5 ‘-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，。测序结果如序列表的序列1所示，与GenBank中GENBANK ACCESS10ΝΝ0. AY156937. 1的序列同源性最高(同源性为100% )，结果表明本方法培养得到的菌丝体为绣球菌(Sparassis crispa)菌丝体。实施例2、液体发酵绣球菌菌丝体的生产绣球菌专用液体发酵培养基玉米粉50. 0克，葡萄糖20. 0克，蛋白胨3. 0克，大豆油3. 0克，KH2PO4 2. 0g, MgSO4 1. 0g，松针汁50ml，用水定容至1000毫升，调pH值为3. 0。对照培养基土豆200克，葡萄糖20. 0克，用水定容至1000毫升，pH值自然。培养基的配制玉米粉煮沸半小时，然后用纱布过滤；按上述配方加入松针汁，葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgS04和大豆油，最后用水定容至1000毫升，调pH值为3.0。将绣球菌菌种(保藏编号ACCC 51488，购自中国农业微生物菌种资源库)接种于马铃薯固体培养基(PDA)上活化，培养温度25-28°C，培养时间14天。起始pH值为3.0下， 按20%的接种量将绣球菌菌种接种于上述绣球菌专用液体培养基中，装瓶，然后在25V， 转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养20d，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率达14. lg/L。同时按10%的接种量将绣球菌菌种接种于对照培养基中，在自然pH值条件下， 25°C，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养20d，6000rpm离心10分钟，去掉上清液， 得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率为0. 64g/L。将所得的绣球菌菌丝体提取DNA，对其ITS (核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，在GenBank进行Blast分析，结果表明本方法培养得到的菌丝体为绣球菌(Sparassis crispa)菌丝体。实施例3、液体发酵绣球菌菌丝体的生产绣球菌专用液体发酵培养基可溶性淀粉20. 0克，松针汁80ml，蛋白胨2. 5克，大豆油2. 0克，KH2PO4 5. 0g, MgSO4 2. 5g，用水定容至1000毫升，调pH值为5. 0。对照培养基土豆200克，葡萄糖20. 0克，用水定容至1000毫升，pH值自然。
培养基的配制将可溶性淀粉先用冷水调勻，加入沸水充分溶解，按上述配方加入蛋白胨、松针汁、KH2P04、MgS04和大豆油，最后用水定容至1000毫升，调pH值为5.0。将绣球菌菌种(保藏编号ACCC 51488，购自中国农业微生物菌种资源库)接种于马铃薯固体培养基(PDA)上活化，培养温度25-28°C，培养时间14天。起始pH值为5.0下， 按20%的接种量将绣球菌菌种接种于上述绣球菌专用液体培养基中，装瓶，然后在^°C， 转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养20d，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率达10. lg/L。同时按10%的接种量将绣球菌菌种接种于对照培养基中，在自然pH值条件下， 25°C，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养20d，6000rpm离心10分钟，去掉上清液， 得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率为0. 64g/L。将所得的绣球菌菌丝体提取DNA，对其ITS (核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，在GenBank进行Blast分析，结果表明本方法培养得到的菌丝体为绣球菌(Sparassis crispa)菌丝体。实施例4、液体发酵绣球菌丝体的生产绣球菌专用液体发酵培养基黄豆粉60. 0克，松针汁60ml，麦芽糖20克，大豆油 2.0 克，KH2PO4 1. 0g, MgSO4 0. 5g，用水定容至 1000 毫升，调 pH 值为 6. 0。对照培养基土豆200克，葡萄糖20. 0克，用水定容至1000毫升，pH值自然。培养基的配制黄豆粉煮沸半小时，然后用纱布过滤，按上述配方加入松针汁、麦芽糖、KH2PO4、MgSO4和大豆油，最后用水定容至1000毫升，调pH值为6. 0。将绣球菌菌种(保藏编号ACCC 51488，购自中国农业微生物菌种资源库)接种于马铃薯固体培养基(PDA)上活化，培养温度25-28°C，培养时间14天。起始pH值为6.0下， 按15%的接种量将绣球菌菌种接种于上述绣球菌专用液体培养基中，装瓶，然后在^°C， 转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养20d，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率达6. 8g/L。同时按10 %的接种量将绣球菌菌种接种于对照培养基中，在自然pH值条件下，装瓶，然后在25°C，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养20d，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率为0. 64g/L。将所得的绣球菌菌丝体提取DNA，对其ITS (核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，在GenBank进行Blast分析，结果表明本方法培养得到的菌丝体为绣球菌(Sparassis crispa)菌丝体。实施例5、液体发酵绣球菌菌丝体的生产绣球菌专用液体发酵培养基玉米碴50. 0克，葡萄糖20. 0克，蛋白胨5. 0克，大豆油3. 0克，用水定容至1000毫升，调pH值为2. 0。对照培养基土豆200克，葡萄糖20. 0克，用水定容至1000毫升，pH值自然。培养基的配制玉米粉煮沸半小时，然后用纱布过滤，按上述配方加入葡萄糖、蛋白胨和大豆油，最后用水定容至1000毫升，调PH值为2.0。将绣球菌菌种(保藏编号ACCC 51488，购自中国农业微生物菌种资源库)接种于马铃薯固体培养基(PDA)上活化，培养温度25-28°C，培养时间14天。起始pH值为2.0下， 按20%的接种量将绣球菌菌种接种于上述绣球菌专用液体培养基中，装瓶，然后在28V，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养20d，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率达6. lg/L。同时按10%的接种量将绣球菌菌种接种于对照培养基中，在自然PH值条件下，装瓶，然后在25V，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养 20d,6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率为0. 64g/L。
将所得的绣球菌菌丝体提取DNA，对其ITS (核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，在GenBank进行Blast分析，结果表明本方法培养得到的菌丝体为绣球(Sparassis crispa)菌菌丝体。
权利要求
1.一种绣球菌的液体发酵培养基，其特征在于每升所述液体发酵培养基中含复合碳源 20. 0-200. 0 克，糖 0-60. 0 克，蛋白胨 0-5. 0 克，KH2PO4 0-5. 0g, MgS040_2. 5g，松针汁 O-IOOml，植物油0-3. 0克，余量为水；调节pH值为2. 0-6. 0。
2.根据权利要求1所述的液体发酵培养基，其特征在于每升所述液体发酵培养基中含复合碳源 50. 0-200. 0 克，糖 20. 0-40. 0 克，蛋白胨 0-5. 0 克，KH2PO4L 0-3. 0g, MgSO4 0. 5-1. 5g，松针汁50-100ml，植物油0-3. 0克，余量为水；调节pH值为3. 0-5. 0。
3.根据权利要求2所述的液体发酵培养基，其特征在于每升所述液体发酵培养基的组成如下复合碳源100. 0-200.0克，糖20. 0-30.0克，蛋白胨1. 0-3. 0克，KH2PO42.0-3. 0g, MgSO4 1. 0-1. 5g，松针汁80_100ml，植物油2. 0-3. 0克，余量为水；调节pH值为3.0-4. O0
4.根据权利要求1-3中任一项所述的液体发酵培养基，其特征在于所述复合碳源选自下述至少一种土豆、玉米粉、玉米碴、黄豆粉和可溶性淀粉；所述糖为单糖和/或双糖， 优选下述至少一种蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、红糖和半乳糖，最优选为红糖；所述植物油为大豆油；所述松针汁是按照下述方法制备的取松针20克加入IOOml水煮沸半小时，过滤定容至100ml，即得。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的液体发酵培养基，其特征在于所述液体发酵培养基的配制方法如下将所述复合碳源煮汁，过滤后取上清液，再在所述上清液中加入所述液体发酵培养基中除复合碳源外的其它组分，溶解，用水定容至1L，并调节pH值为所述pH 值，灭菌即可。
6.一种绣球菌液体培养方法，包括下述步骤将绣球菌(Sparassis crispa)接种于权利要求1-5中任一项所述的液体发酵培养基中进行培养。
7.根据权利要求6所述的绣球菌液体培养方法，其特征在于所述培养在自然光照射条件下进行；所述培养的温度为20-30°C，优选为23-30°C，最优选为2548°C。
8.根据权利要求6或7所述的绣球菌液体培养方法，所述其特征在于所述绣球菌的接种量为5-20%，优选为10-20%。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的绣球菌液体培养方法，所述其特征在于所述培养为震荡培养，震荡转速为100-200rpm，优选为100_150rpm，最优选为120rpm。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的绣球菌液体培养方法，其特征在于所述培养的时间为10-20天。
全文摘要
本发明公开了一种珍稀食药用菌绣球菌的液体发酵专用培养基及其培养方法。每升所述培养基中含复合碳源20.0-200.0克，糖0-60.0克，蛋白胨0-5.0克，KH2PO40-5.0g，MgSO4 0-2.5g，松针汁0-100ml，植物油0-3.0克，余量为水；调节pH值为2.0-6.0。培养方法为在起始pH值为2.0-6.0下，按5-20％的接种量将绣球菌菌种接种于绣球菌液体发酵专用培养基中，然后在20-30℃，转速100-200rpm，自然光照条件下进行振荡培养。本发明突破了目前绣球菌仅能固体培养和人工栽培的局限，利用该培养基及本发明的培养方法发酵生产绣球菌菌丝体具有生长速度快、周期短、产率高、工艺简单、成本低等优点，适于绣球菌的工业化发酵生产。
文档编号C05G3/00GK102351605SQ201110220578
公开日2012年2月15日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者董彩虹 申请人:中国科学院微生物研究所