专利名称：一种人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法。
背景技术：
芸薹属植物在十字花科中具有较重要的经济价值。芸薹属中包含了六个最基本的品种类型，包括白菜型油菜(B. rapa, 2n = 20，AA)、黑芥(B. nigra，2n = 16，BB)和甘蓝(B. oleracea，2n = 18，CC)三个二倍体种，以及甘蓝型油菜(B. napus，2n = 38，AACC)、 芥菜型油菜(B. juncea, 2n = 36，AABB)和埃塞俄比亚芥(B. carinata,2n = 34，BBCC)三个四倍体复合种，这就是著名的禹氏三角(UN，1935)。这些芸薹属植物在遗传改良中具有很大的潜力，每个种都存在独特的特异基因。例如，白菜型油菜具有较强的抗潮和抗寒能力，特别是它具有较短的生育期，这些特征使得它在生产上具有很大的价值，但是产量低以及易受病害则在某种程度上限制了它的推广。而埃塞俄比亚芥却具有很强的抗病能力以及特殊的黄色种皮，但它的生育期长成为了在生产上应用最大的障碍。在自然界中，芸薹属含有A，B和C三个基因组的六倍体物种(AABBCC)是不存在的。但在其他物种中六倍体是可以存在并且在生产上得到大量应用，例如六倍体小麦。近期的研究中，Tian E等人在题为"Synthesis of a Brassica trigenomic allohexaploid(B. carinataXB. rapa) de novo and its stability in subsequent generations" (Theoretical and Applied Genetics，2010，121，1431-1440)以及 Pradhan 等人在题为 “Successful induction of trigenomic hexaploid Brassica from a triploid hybrid of B. napus L. and B. nigra(L)Koch. ”(Euphytica，2010，176，87-98)的文章中，通过芸薹属不同物种间的杂交(B. rapaXB. carinata, B. nigraXB. napus, B. juncea, B. napus 禾口 B. carinata 三者之间等)获得了一种新型并且稳定的六倍体油菜，这种六倍体油菜包含芸薹属的三个基因，对芸薹属作物的研究和芸薹属中ABC基因组作图等具有很大的影响。自1982年Lichter首次报道油菜游离小孢子培养获得再生植株以来，芸薹属作物，尤其是油菜的小孢子培养，小孢子的出胚率、出胚量以及胚培养及再生植株方面都获得了很大的成功。但对于这种新型的六倍体油菜的小孢子培养鲜有报道。我们知道甘蓝型油菜游离小孢子培养比较容易，但芸薹属中的其他作物例如甘蓝属和芥菜属的小孢子培养难度比较大，尤其是对于较难出胚的品种来说特别不易。因此，在这种人工杂交合成的六倍体油菜中包含了 ABC三个基因组，我们不能确定三个基因组同时存在的情况是否会影响到小孢子培养的出胚率及胚的质量，从而对将来DH(doubled haploid，双单倍体)群体的建立有障碍。因此，寻找一种适合六倍体油菜小孢子培养的方法显得极其重要。
发明内容
本发明提供了一种人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，成功培育出了第一个人工杂交六倍体油菜小孢子来源的双单倍体群体，为将来制作六倍体油菜遗传图谱以及与农业相关性状的QTL提供了很好的资源。一种人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，包括以下步骤(1)取人工杂交六倍体油菜的花序作为小孢子培养的供体；(2)将灭菌后的六倍体油菜花蕾加入到1/2B5-13培养基中研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在所述沉淀中加入NLN-13液体培养基，将小孢子细胞浓度调至3 X IO5 5 X IO5个细胞/mL后，再依次加入秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到六倍体油菜小孢子培养的混合悬浮液；(3)将所述六倍体油菜小孢子培养的混合悬浮液在黑暗条件下于30°C 33°C恒温热激处理1 3天后，在黑暗条件下于20°C 培养10天 15天，直至肉眼可见时， 在黑暗条件下于20°C 再震荡培养5天 10天，得到子叶期胚状体；(4)将所述子叶期胚状体接种到含有细胞分裂素的再生培养基中，在每天12小时 18小时光照和20°C 下培养，形成再生芽；(5)切取再生芽接种至不含激素的生根培养基中，在每天12小时 18小时光照和 20°C 条件下进行生根培养，将根生长健壮的苗炼苗后移栽到土壤里，得到再生植株， 鉴定倍性。本发明中，所述人工杂交六倍体油菜通过现有技术方法制备得到，具体详见 Pradhan A 等(2010). Successful induction of trigenomic hexaploid Brassica from a triploid hybrid of B. napus L. and B. nigra(L. )Koch. Euphytica 176,87-98.以及 Tian E^ (2010) Synthesis of a Brassica trigenomic allohexaploid(B. carinataXB. rapa)de novo and its stability in subsequent generations. Theoretical andApplied Genetics 121,1431-1440.中的记载。本发明中，所述花蕾为自然界中不存在的人工杂交六倍体油菜的花蕾，优选所述花蕾的长度为2 4mm，花粉母细胞处于单核晚期至双核早期，花蕾的数目为80 100个。本发明中，所述灭菌采用本领域常规的灭菌方法。考虑到次氯酸钠灭菌的效果较好，并且没有毒害，本发明中优选采用次氯酸钠溶液将人工杂交六倍体油菜花蕾灭菌15 30分钟，后用无菌水清洗干净。所述次氯酸钠溶液，以IL计，组成为次氯酸钠56ml 100ml、无水乙醇100ml、洗洁精8 10滴和余量的无菌水，配制成体积百分为5. 6 10%的次氯酸钠水溶液。本发明中所述1/2B5-13液体培养基，以IL计，组成为Austratec 公司的Gamborg，B5完全培养基粉末1. 6g(即，减半的B5完全培养基粉末)，蔗糖130g，IL无菌水，PH5. 6 6. 2。所述NLN-13液体培养基，以IL计，组成为NLN液体培养基IL和蔗糖130g，PH 5. 6 6. 2。所述NLN液体培养基，以IL计，组成为Austratec 公司的NLN培养基粉末1. 92g， IL无菌水。所述秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0. 3% 0. 8%。秋水仙碱是植物加倍技术中最常用的试剂，可以作用在植物的根，子房等器官实现染色体加倍。在小孢子游离过程中加入秋水仙碱溶液的加倍率比较高，而且用量少污染小。所述活性炭混合液，以IL计，组成为NLN液体培养基1L，琼脂糖2 5g和8
515g活性炭。所述再生培养基，以IL计，组成为Austratec 公司的Gamborg，B5完全培养基粉末3. 21g，IL无菌水，蔗糖20 30g，琼脂粉2 4g，植物凝胶3 5g，1 3ml浓度为 0. 5 1. 5mg/ml的细胞分裂素以及PH5. 6 6. 2。所述生根培养基，以IL计，组成为Austratec 公司的Gamborg，B5完全培养基粉末3. 21g，IL无菌水，蔗糖20 30g，琼脂粉2 4g，植物凝胶3 5g以及PH5. 6 6. 2。Austratec 公司的 NLN 培养基粉末 1. 92g,组成为KN03125mg，Ca(NO3)2 · 4H20 500mg, MgSO4 61mg, KH2PO4 125mg, H3BO3 6. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 IOmg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, 0. 5mg 维生素 Bi，0. 5mg 维生素B6,生物素0. 05mg,叶酸0. 5mg, NaFeEDTA 36. 70mg,肌醇IOOmg,甘氨酸2mg,烟酸 5mg, L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，丝氨酸lOOmg。Austratec 公司的 Gamborg，B5 完全培养基粉末 3. 21g，组成为=NaH2PO4. H2O 150mg, CaCl2 113. 24mg,KI 0. 75mg, KNO3 2500mg, (NH4) 2S04134mg，MgSO4 · 7H20 125mg, H3BO3 3. Omg, MnSO4 · H2O IOmg, ZnSO4 · 7H202mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 ·6Η20 0. 025mg, IOmg 维生素 Bi, Img 维生素 B6,Na2EDTA 37. 3mg,FeSO4 ·7Η20 27. 8mg, 肌醇lOOmg，烟酸lmg。减半的B5 完全培养基粉末，组成为=NaH2PO4. H2O 75mg, CaCl256. 62mg, KI 0. 375mg, KNO3 1250mg, (NH4)2SO4 67mg, MgSO4 · 7H2062. 5mg, H3BO3 1. 5mg, MnSO4 · H2O 5mg, ZnSO4 · 7H20 lmg, Na2MoO4 · 2H200. 125mg, CuSO4 · 5H20 0. 0125mg, CoCl2 · 6H20 0. 0125mg, 5mg 维生素 Bi，0. 5mg 维生素 B6，Na2EDTA 18. 65mg,FeSO4 ·7Η20 13. 9mg，肌醇 50mg，烟酸 0. 5mg。步骤(2)中，所述的研磨、离心、弃上清液及用NLN-13液体培养基分散小孢子细胞的操作可以重复进行1 2次S卩，步骤O)的具体步骤可以如下将灭菌后的六倍体油菜花蕾加入到1/2B5-13培养基中研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀后；在沉淀中再次加入1/2B5-13培养基研磨成悬浮液，再次过滤所得滤液经离心、弃上清液，再次得到沉淀；在所述沉淀中加入NLN-13液体培养基， 在显微镜下利用血细胞计数器计算小孢子细胞浓度，再用一定量的NLN-13液体培养基小孢子细胞浓度调至3 X IO5 5 X IO5个细胞/mL后，依次加入秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到六倍体油菜小孢子培养的混合悬浮液。步骤O)中，所述的过滤可采用44μπι无菌滤网。所述的离心的条件一般为 900rpm/min 1200rpm/min 离心 3 5min。步骤(3)中，热激后的小孢子悬浮液能够更促进小孢子细胞的胚胎发生。步骤(3)中，所述子叶期小孢子胚状体可放入3°C 8°C冰箱中冷藏保存，以延长胚状体的保存期限。步骤(3)中，在黑暗条件下培养温度优选为25士2°C，S卩在黑暗条件下25士2°C于培养至肉眼可见胚状体时，再在黑暗条件下于25 士 2°C条件下摇动培养。在黑暗条件下摇动培养相对于不摇动培养的小孢子吸收营养更充分，因此胚生长的较迅速以及较健壮。步骤(4)中，所述培养条件优选为每天16小时光照和25°C下培养。一般培养时间为20 30天。步骤中，所述的子叶期小孢子胚状体接种到再生培养基上，只需要留下已经直接成苗的幼芽，其他愈伤组织都不再保留，这样既保证了苗的质量也避免了不必要的时间浪费。步骤(5)中，所述的直接成苗的幼苗接种到生根培养基上，培养条件优选为每天 16小时光照和25 °C下培养。一般培养时间为25 30天。步骤(5)中，移栽时用蒸馏水洗净组培苗根部培养基，减去较长的根，以便于移栽。随后植于装好灭菌土的穴盘中，塑料膜罩住保湿5 7天，在温室中培养15 20天后移栽到大的盆钵中。步骤(5)中，所述的鉴定可采用本领域常用的倍性鉴定方法，如取再生植株的最嫩的叶片检测各再生植株倍性。可用美国BD公司的BDFACSCanto流式细胞仪进行倍性分析的鉴定。本发明所述的六倍体油菜小孢子培养方法与传统的甘蓝型油菜小孢子培养方法相比，得到的小孢子胚状体的质量更好，小孢子数目更多，利用血细胞计数器将游离出的小孢子细胞数目做了适当调整，对于小孢子的胚胎发生具有很重要的作用。在小孢子游离过程中进行秋水仙碱加倍，不仅污染小而且加倍的效率比用根浸染的方法高。对子叶型小孢子胚状体进行低温保存，能大大的延长胚状体的保存期限。用传统方法在25°C的培养室中保存的子叶型胚状体一般7 10天不移入再生培养基中便变黄死亡，而利用低温保存的小孢子胚状体可保存长达3个月的时间。本发明中在游离小孢子细胞的过程中利用1/2B5-13 培养基作为游离培养基比传统的NLN-13培养基具有更好的效果。再生培养基以及生根培养基都采用B5成分的固体培养基成苗率和生根率更高。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明首次公开了一种新型的人工合成的芸薹属油菜品种(人工杂交六倍体油菜)小孢子培养的方法，培育出了第一个人工杂交六倍体油菜小孢子来源的双单倍体群体。利用此种方法培育出来的六倍体油菜小孢子得到的双单倍体群体，为将来制作含有ABC 三个基因组的六倍体油菜遗传图谱以及与农业相关性状QTL提供了很好的资源。
具体实施例方式下面结合实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。实施例1 (1)培养基配制①NLN液体培养基，以IL计，组成为Austratec 公司的NLN培养基粉末1. 92g， IL无菌水，过滤灭菌。②NLN-13液体培养基，以IL计，组成为NLN液体培养基IL和蔗糖130g，PH5. 8， 过滤灭菌。③1/2B5-13液体培养基，以IL计，组成为Austratec 公司的Gamborg，B5完全培养基粉末1. 6g( S卩，减半的B5完全培养基粉末)，蔗糖130g，IL无菌水，PH5. 8，过滤灭菌。④再生培养基，以IL计，组成为Austratec 公司的Gamborg，B5完全培养基粉末3. 21g，IL无菌水，蔗糖20g，琼脂粉3g，植物凝胶4g，1. 5ml细胞分裂素(lmg/ml)以及 PH5. 8，高温高压灭菌。⑤生根培养基，以IL计，组成为Austratec 公司的Gamborg，B5完全培养基粉末3. 21g，IL无菌水，蔗糖20g，琼脂粉3g，植物凝胶4g以及PH5. 8，高温高压灭菌。Austratec 公司的 NLN 培养基粉末 1. 92g,组成为KN03 125mg, Ca(NO3)2 · 4H20 500mg, MgSO4 61mg, KH2PO4 125mg, H3BO3 6. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 IOmg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, 0. 5mg 维生素 Bi，0. 5mg 维生素B6,生物素0. 05mg,叶酸0. 5mg, NaFeEDTA 36. 70mg,肌醇IOOmg,甘氨酸2mg,烟酸 5mg, L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，丝氨酸lOOmg。Austratec 公司的 Gamborg，B5 完全培养基粉末 3. 21g，组成为=NaH2PO4. H2O 150mg, CaCl2 113. 24mg,KI 0. 75mg, KNO3 2500mg, (NH4) 2S04134mg，MgSO4 · 7H20 125mg, H3BO3 3. Omg, MnSO4 · H2O IOmg, ZnSO4 · 7H202mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 ·6Η20 0. 025mg, IOmg 维生素 Bi, Img 维生素 B6,Na2EDTA 37. 3mg,FeSO4 ·7Η20 27. 8mg, 肌醇lOOmg，烟酸lmg。减半的B5 完全培养基粉末，组成为=NaH2PO4. H2O 75mg, CaCl256. 62mg, KI 0. 375mg, KNO3 1250mg, (NH4)2SO4 67mg, MgSO4 · 7H2062. 5mg, H3BO3 1. 5mg, MnSO4 · H2O 5mg, ZnSO4 · 7H20 lmg, Na2MoO4 · 2H200. 125mg, CuSO4 · 5H20 0. 0125mg, CoCl2 · 6H20 0. 0125mg, 5mg 维生素 Bi，0. 5mg 维生素 B6，Na2EDTA 18. 65mg,FeSO4 ·7Η20 13. 9mg，肌醇 50mg，烟酸 0. 5mg。(2)六倍体油菜小孢子再生植株的培养1)供体植株花蕾的选择取六倍体油菜生长健康、无病虫害的初花期的花序作为小孢子培养的供体；取花蕾长度为2mm、单核晚期至双核早期的花蕾80个；2)花蕾的灭菌用次氯酸钠56ml/L+无水乙醇100ml/L+洗洁精10滴+无菌水配制成的体积百分浓度为5. 6%的次氯酸钠水溶液灭菌液；把花蕾放入小瓶中，加入50ml次氯酸钠水溶液灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒20分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗3次后，备用；3)在超净工作台上将灭菌后的花蕾一并置于无菌烧杯中，加入少量1/2B5-13培养基，用灭过菌的平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液，加入新鲜1/2B5-13培养基至30ml ；该悬浮液用44 μ m无菌滤网过滤到50ml离心管中，盖紧，900rpm/min离心;3min，离心后倒掉上清液，往沉淀中再加入30ml的1/2B5-13培养基，按上述方法再离心1次，弃上清液；往沉淀中加入NLN-13液体培养基30ml，取1. 5ul溶液用血细胞计数器在5X显微镜下计算小孢子细胞密度为9 X IO5个细胞/mL。所需的密度为3 X IO5个细胞/mL，因此再补加60mL的 NLN-13液体培养基，分装到9个灭菌的培养皿中，每皿IOmL小孢子悬浮液，每皿中依次加入 40ul秋水仙碱溶液(质量百分浓度为0. 5% )及IOOul高压灭菌后的活性炭混合液(1L活性炭混合液的组成为NLN液体培养基1L、琼脂糖2g和IOg活性炭)。4)将装有该小孢子混合悬浮液的培养皿，加盖后用pamfilm@封口膜(美国 parafilm公司)封口，锡纸包裹后置于32. 5°C恒温生化培养箱里、黑暗条件下热激处理3 天；再置于25°C恒温培养室中继续培养12天；至肉眼可见胚状体时，置于25°C培养摇床上摇动培养7天后得到子叶期胚状体，放入4°C冰箱中冷藏保存；5)将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天16小时光照、25°C条件下培养M 天，直接形成再生幼芽；6)切取生长健康的再生幼芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、25°C条件下进行生根培养；25天后将根生长健壮的苗用蒸馏水洗净组培苗根部培养基，减去较长的根，以便于移栽。随后植于装好灭菌土的穴盘中，塑料膜罩住保湿5天，在温室中培养15天后移栽到大的盆钵中，得到再生植株。7)取再生植株的嫩叶，用美国BD公司的BD FACSCanto流式细胞仪进行倍性分析， 检测各植株倍性，仅保存双单倍体植株。检测方法如下以四倍体甘蓝型油菜作为对照样品，先用流式细胞仪对四倍体甘蓝型油菜进行检测，并将四倍体甘蓝型油菜PI-DNA-A的峰值的指数调为50，000。再通过流式细胞仪对各植株进行检测得到的直方图中的数据，可以很容易估计出样品的倍性水平。用流式细胞仪检测上述实施例1所得的各植株倍性，分别得到检测结果。当检测结果中PI-DNA-A峰值为 35，000，显示相应植株倍性为未成功加倍的六倍体油菜小孢子来源的单倍体，不保存该单倍体植株；当检测结果中PI-DNA-A峰值为70，000,显示相应植株倍性为成功完成加倍的六倍体油菜的双单倍体，保存该双单倍体植株。结果六倍体油菜出胚率为81个/蕾。实施例2:(1)培养基配制①NLN液体培养基，同实施例1。②NLN-13液体培养基，组成为NLN液体培养基IL和蔗糖130g，pH6. 0，过滤灭菌。③1/2B5-13液体培养基，组成为Austratec 公司的Gamborg，B5完全培养基粉末1.6g(即，减半的B5完全培养基粉末)，IL无菌水，和蔗糖130g，PH6.0，过滤灭菌。④再生培养基，组成为Austratec 公司的Gamborg，B5完全培养基粉末3. 21g， IL无菌水，蔗糖25g，琼脂粉2. 5g，植物凝胶4. 5g，1. 5ml细胞分裂素(lmg/ml)，ρΗ6· 0，高温高压灭菌。⑤生根培养基，组成为Austratec 公司的Gamborg，B5完全培养基粉末3. 21g， IL无菌水，蔗糖25g，琼脂粉2. 5g，植物凝胶4. 5g，pH6. 0,高温高压灭菌。Austratec 公司的 NLN 培养基粉末 1. 92g、Austratec 公司的 Gamborg，B5 完全培养基粉末3. 21g、减半的B5完全培养基粉末的组成同实施例1。(2)六倍体油菜小孢子再生植株的培养1)供体植株花蕾的选择取六倍体油菜生长健康、无病虫害的初花期的花序作为小孢子培养的供体；取花蕾长度为3mm、单核晚期至双核早期的花蕾90个；(2)花蕾的灭菌用次氯酸钠80ml/L+无水乙醇100ml/L+洗洁精8滴+无菌水配制成的体积百分浓度为8. 0%的次氯酸钠水溶液灭菌液；把花蕾放入小瓶中，加入50ml次氯酸钠水溶液灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒15分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗4次后，备用；(3)在超净工作台上将灭菌后的花蕾一并置于无菌烧杯中，加入少量1/2B5-13培养基，用灭过菌的平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液，加入新鲜1/2B5-13培养基至30ml ；该悬浮液用44 μ m无菌滤网过滤到50ml离心管中，盖紧，1000rpm/min离心％iin，离心后倒掉上清液，往沉淀中再加入30ml的1/2B5-13培养基，按上述方法再离心1次，弃上清液；往沉淀中加入NLN-13液体培养基30ml，取1. 5ul溶液用血细胞计数器在5X显微镜下计算小孢子细胞密度为10X IO5个细胞/mL。所需的密度为5 X IO5个细胞/mL，因此再补加30mL的NLN-13液体培养基，分装到6个灭菌的培养皿中，每皿IOmL小孢子悬浮液，每皿中依次加入 40ul秋水仙碱溶液(质量百分浓度为0. 6% )及IOOul高压灭菌后的活性炭混合液(1L活性炭混合液的组成为NLN液体培养基1L、琼脂糖3g和8g活性炭)。(4)将装有该小孢子混合悬浮液的培养皿，加盖后用parafilm 封口膜(美国 parafilm公司)封口，锡纸包裹后置于30°C恒温生化培养箱里、黑暗条件下热激处理2天； 再置于25°C恒温培养室中继续培养10天；至肉眼可见胚状体时，置于25°C培养摇床上摇动培养8天后，得到子叶期胚状体，放入5°C冰箱中冷藏保存；(5)将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天16小时光照、25°C条件下培养 20天，直接形成再生幼芽；(6)切取生长健康的再生幼芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、25°C条件下进行生根培养；观天后将根生长健壮的苗用蒸馏水洗净组培苗根部培养基，减去较长的根，以便于移栽。随后植于装好灭菌土的穴盘中，塑料膜罩住保湿6天，在温室中培养18 天后移栽到大的盆钵中，得到再生植株。(7)取再生植株的嫩叶，用美国BD公司的BD FACSCanto流式细胞仪进行倍性分析，采用与实施例1相同的方法检测各植株倍性，仅保存双单倍体植株。结果六倍体油菜出胚率为65个/蕾。实施例3 (1)培养基配制①NLN液体培养基，同实施例1。②NLN-13液体培养基，组成为NLN液体培养基IL和蔗糖130g，pH5. 6，过滤灭菌。③1/2B5-13液体培养基，组成为Austratec 公司的Gamborg，B5完全培养基粉末1.6g(即，减半的B5完全培养基粉末)，IL无菌水，和蔗糖130g，PH5.6，过滤灭菌。④再生培养基，组成为Austratec 公司的Gamborg，B5完全培养基粉末3. 21g， IL无菌水，蔗糖30g，琼脂粉3. 5g，植物凝胶3. 5g，1. 5ml细胞分裂素(lmg/ml)，ρΗ5· 6，高温高压灭菌。⑤生根培养基，组成为Austratec 公司的Gamborg，B5完全培养基粉末3. 21g， IL无菌水，蔗糖30g，琼脂粉3. 5g，植物凝胶3. 5g，pH5. 6，高温高压灭菌。Austratec 公司的 NLN 培养基粉末 1. 92g、Austratec 公司的 Gamborg，B5 完全培养基粉末3. 21g、减半的B5完全培养基粉末的组成同实施例1。(2)六倍体油菜小孢子再生植株的培养1)供体植株花蕾的选择取六倍体油菜生长健康、无病虫害的初花期的花序作为小孢子培养的供体；取花蕾长度为4mm、单核晚期至双核早期的花蕾100个；(2)花蕾的灭菌用次氯酸钠100ml/L+无水乙醇100ml/L+洗洁精9滴+无菌水配制成的体积百分浓度为10%的次氯酸钠水溶液灭菌液；把花蕾放入小瓶中，加入50ml次氯酸钠水溶液灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒30分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗5次后，备用；(3)在超净工作台上将灭菌后的花蕾一并置于无菌烧杯中，加入少量1/2B5-13培养基，用灭过菌的平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液，加入新鲜1/2B5-13培养基至30ml ；该悬浮液用44 μ m无菌滤网过滤到50ml离心管中，盖紧，1200rpm/min离心5min，离心后倒掉上清液，往沉淀中再加入30ml的1/2B5-13培养基，按上述方法再离心1次，弃上清液；往沉淀中加入NLN-13液体培养基30ml，取1. 5ul溶液用血细胞计数器在5X显微镜下计算小孢子细胞密度为8X IO5个细胞/mL。所需的密度为4X IO5个细胞/mL，因此再补加30mL的 NLN-13液体培养基，分装到6个灭菌的培养皿中，每皿IOmL小孢子悬浮液，每皿中依次加入 40ul秋水仙碱溶液(质量百分浓度为0. 8% )及IOOul高压灭菌后的活性炭混合液(1L活性炭混合液的组成为NLN液体培养基1L、琼脂糖3g和12g活性炭)。(4)将装有该小孢子混合悬浮液的培养皿，加盖后用parafilm 封口膜(美国 parafilm公司)封口，锡纸包裹后置于33°C恒温生化培养箱里、黑暗条件下热激处理1天； 再置于25°C恒温培养室中继续培养15天；至肉眼可见胚状体时，置于25°C培养摇床上摇动培养10天后，得到子叶期胚状体，放入6°C冰箱中冷藏保存；(5)将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天16小时光照、25°C条件下培养观天，直接形成再生幼芽；(6)切取生长健康的再生幼芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、25°C条件下进行生根培养；30天后将根生长健壮的苗用蒸馏水洗净组培苗根部培养基，减去较长的根，以便于移栽。随后植于装好灭菌土的穴盘中，塑料膜罩住保湿7天，在温室中培养20 天后移栽到大的盆钵中，得到再生植株。(7)取再生植株的嫩叶，用美国BD公司的BD FACSCanto流式细胞仪进行倍性分析，采用与实施例1相同的方法检测各植株倍性，仅保存双单倍体植株。结果多倍体油菜出胚率为78个/蕾。
权利要求
1.一种人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取人工杂交六倍体油菜的花序作为小孢子培养的供体；(2)将灭菌后的六倍体油菜花蕾加入到1/2B5-13培养基中研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在所述沉淀中加入NLN-13液体培养基，将小孢子细胞浓度调至3X IO5 5X IO5个细胞/mL后，再依次加入秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到六倍体油菜小孢子培养的混合悬浮液；(3)将所述六倍体油菜小孢子培养的混合悬浮液在黑暗条件下于30°C 33°C恒温热激处理1 3天后，在黑暗条件下于20°C 培养10天 15天，直至肉眼可见时，在黑暗条件下于20°C 再震荡培养5天 10天，得到子叶期胚状体；(4)将所述子叶期胚状体接种到含有细胞分裂素的再生培养基中，在每天12小时 18 小时光照和20°C 下培养，形成再生芽；(5)切取再生芽接种至不含激素的生根培养基中，在每天12小时 18小时光照和 20°C 条件下进行生根培养，将根生长健壮的苗炼苗后移栽到土壤里，得到再生植株， 鉴定倍性。
2.如权利要求1所述的人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，所述 1/2B5-13 液体培养基，以 IL 计，组成为=NaH2PO4. H2O 75mg，CaCl256. 62mg，KI 0. 375mg, KNO3 1250mg, (NH4)2SO4 67mg, MgSO4 · 7H2062. 5mg, H3BO3 1. 5mg, MnSO4 · H2O 5mg, ZnSO4 · 7H20 lmg, Na2MoO4 · 2H200. 125mg, CuSO4 · 5H20 0. 0125mg, CoCl2 · 6H20 0. 0125mg, 5mg 维生素 Bi，0. 5mg 维生素 B6，Na2EDTA 18. 65mg,FeSO4 ·7Η20 13. 9mg，肌醇 50mg，烟酸 0. 5mg, 蔗糖130g, IL无菌水，PH5. 6 6. 2 ；所述NLN-13液体培养基，以IL计，组成为NLN液体培养基IL和蔗糖130g，PH 5. 6 6. 2 ；所述秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0. 3% 0. 8% ；所述活性炭混合液，以IL计，组成为NLN液体培养基1L、琼脂糖2 5g和8 15g活性炭；所述 NLN 液体培养基，以 IL 计，组成为=KNO3 l25mg，Ca (NO3)2 .4H2O5OOmgJgSO4 61mg， KH2PO4 125mg, H3BO3 6. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 IOmg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg，0. 5mg 维生素 B1，0. 5mg 维生素 B6，生物素 0. 05mg,叶酸 0. 5mg, NaFeEDTA 36. 70mg,肌醇 IOOmg,甘氨酸 2mg,烟酸 5mg, L-谷氨酰胺 800mg,谷胱甘肽30mg，丝氨酸lOOmg，IL无菌水；所述再生培养基，以 IL 计，组成为=NaH2PO4. H2O 150mg, CaCl2113. 24mg, KI 0. 75mg， KNO3 2500mg, (NH4)2SO4 134mg，MgSO4 .7H20125mg，H3BO3 3. OmgjMnSO4 'H2O 1 Omg，ZnSO4 ·7Η20 2mg, Na2MoO4 · 2H200. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, IOmg 维生素 Bi, lmg 维生素 B6, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4 · 7H20 27. 8mg，肌醇 lOOmg，烟酸 lmg, IL 无菌水，蔗糖20 30g，琼脂粉2 4g，植物凝胶3 5g，1 3ml浓度为0. 5 1. 5mg/ml的细胞分裂素以及PH5. 6 6. 2 ；所述生根培养基，以 IL 计，组成为=NaH2PO4. H2O 150mg, CaCl2113. 24mg, KI 0. 75mg，KNO3 2500mg, (NH4)2SO4 134mg，MgSO4 .7H20125mg，H3BO3 3. Omg，MnSO4 ·Η20 1 Omg，ZnSO4 ·7Η20 2mg, Na2MoO4 · 2Η200. 25mg, CuSO4 · 5Η20 0. 025mg, CoCl2 · 6Η20 0. 025mg, IOmg 维生素 Bi, Img 维生素 B6, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4 · 7H20 27. 8mg，肌醇 lOOmg，烟酸 lmg，IL 无菌水，蔗糖20 30g，琼脂粉2 4g，植物凝胶3 5g，以及PH5. 6 6. 2。
3.如权利要求1或2所述的人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，所述花蕾的长度为2 4mm，花粉母细胞处于单核晚期至双核早期，花蕾的数目为 80 100个。
4.如权利要求1或2所述的人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，所述步骤( 为将灭菌后的六倍体油菜花蕾加入到1/2B5-13培养基中研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀后；在沉淀中再次加入1/2B5-13培养基研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液，再次得到沉淀；再在所述沉淀中先加入NLN-13 液体培养基，在显微镜下利用血细胞计数器计算小孢子细胞浓度，并用一定量的NLN-13液体培养基小孢子细胞浓度调至3X IO5 5X IO5个细胞/mL，再依次加入秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到六倍体油菜小孢子培养的混合悬浮液。
5.如权利要求1或2所述的人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤O)中，所述的过滤采用44 μ m无菌滤网。
6.如权利要求1或2所述的人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤O)中，所述的离心的条件为900 1200rpm/min离心3 5min。
7.如权利要求1或2所述的人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，在黑暗条件下培养温度为25士2°C。
8.如权利要求1或2所述的人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述子叶期胚状体在;TC 8°C保存。
9.如权利要求1或2所述的人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤中，培养条件为每天16小时光照和25°C下培养，培养时间为20 30天。
10.如权利要求1或2所述的人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，其特征在于，步骤(5)中，培养条件为每天16小时光照和25°C下培养，培养时间为25 30天。
全文摘要
本发明公开了一种人工杂交六倍体油菜小孢子再生植株的培养方法，包括取人工杂交六倍体油菜的花序作为小孢子培养的供体；将灭菌后的六倍体油菜花蕾加入到1/2B5-13培养基中研磨成悬浮液，过滤、离心得到沉淀；先后加入NLN-13液体培养基、秋水仙碱和活性炭的混合液，得到小孢子混合悬浮液；黑暗条件下热激处理后培养，得到子叶期胚状体；接种到再生培养基中培养直接形成再生芽；切取再生芽接种至生根培养基中进行生根培养，移栽得到再生植株，鉴定倍性。本发明首次公开了人工杂交六倍体油菜小孢子培养的方法，首次培育出六倍体油菜小孢子来源的双单倍体群体，为后续建立ABC基因组的连锁遗传图提供便利。
文档编号A01H4/00GK102362579SQ201110355698
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者周伟军, 王兵, 耿鑫鑫, 许玲 申请人:浙江大学