专利名称：制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法
技术领域：
本发明涉及一种制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法的方法。
背景技术：
目前，生产转基因动物的方法有原核内显微注射法、精子载体法、脂质体转染法、 反转录病毒载体法、以及细胞核移植方法，但这些方法皆因成本高、转基因效率低或者插入片段小等缺点而无法广泛应用。慢病毒载体法的出现，不仅克服了以往逆转录病毒表达沉默的缺陷，而且转基因的效率远远高于传统的显微注射法，是转基因动物研究领域的突破性进展。随后，利用该方法，已经有转基因猪、转基因牛、转基因鼠、转基因鸡、绵羊、猕猴等出生。在我国，朱作言等就通过显微注射的方法获得了转草鱼生长激素的转基因鲤鱼， 黑龙江水产研究所也通过同样的方法获得了转大马哈生长激素基因的转基因鲤鱼，而使用慢病毒生产转基因鲤鱼还未见报道。因此，本发明期望获得转基因鲤鱼的慢病毒方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种基于慢病毒的转基因鲤鱼生产方法，该处理方法既能提高转基因的效率，又能降低转基因鲤的生产成本。本发明为实现上述目的，采用如下技术方案
制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法，其特征在于首先构建所要转基因的慢病毒载体， 其次，获得人工授精的鲤鱼未分裂的受精卵并进行脱粘处理；使用显微注射的方式进行慢病毒注射；
具体操作步骤为
制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法，其特征在于按如下步骤实现 (1)、根据鲤鱼IGF2b基因cDNA序列Genbank登录号为AF4(^958，设计引物 IGF2b-BamHI-F, GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCA IGF2b-NheI-R, CAGTTGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG ； 扩增其CDS区
ATGGAGGACCAACTAAAACATCATTCTTTGTGCCATACTTGTTTGAGAACAGACAGTGTCATAAATAAGG TCATAAAGATGTACTGGTCCATACGAATGCCCATATGCATACTGTTTTTAACCCTGTCTGCCTTCGAAGT GGCTTCAGCTGAAACGTTATGCGGCGGAGAGCTGGTGGACGCGCTACAGTTTGTGTGTGGAGACAGAGGT TTCTATTTCAGTCGACCAACTAGCAGGTTGAGCAGTCGACGTTCTCAAAATCGTGGGATTGTGGAAGAGT GTTGTTTTAACAGTTGTAACCTAGCTCTTCTAGAACAGTACTGCGCTAAACCTGCCAAGTCAGAGAGGGA CGTTTCAGCCACATCCCTACAGGTCATCCCGGTGATGCCCACATTAAAACAGGAGGTCCCAAGAAAACAT GTGACCGTGAAATATTCCAAATACGACATGTGGCAACGAAAGGCCGCCCAGAGGCTACGGAGGGGCGTCC CCGCCATCCTGCGGGCCAAGAAGTTTAGGCGGCAGGCGGAGAGAATCAGGGCCCAAGAGCAACTGCACCA CCACAGGCCTCTCATCACGCTTCCCAGCAAGCTCCCGCCCATCCTTTTTGCACAGAGTCGATGA,用Trizol (购自南京基天生物)抽提2个样品中的RNA，反转录成cDNA ；PCR扩增条件优化用iTaq DNA polymerse (Fermentas)(购自上海英骏英骏生物技术有限公司)扩增目的片段，摸索PCR条件；以cDNA为模板，用高保真酶扩增目的片段，PCR体系如下
权利要求
1.制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法，其特征在于按如下步骤实现 (1)、根据鲤鱼IGF2b基因cDNA序列Genbank登录号为AF4(^958，设计引物 IGF2b-BamHI-F :GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCA IGF2b-NheI-R :CAGTTGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG ； 扩增其CDS区ATGGAGGACCAACTAAAACATCATTCTTTGTGCCATACTTGTTTGAGAACAGACAGTGTCATAAATAAGGT CATAAAGATGTACTGGTCCATACGAATGCCCATATGCATACTGTTTTTAACCCTGTCTGCCTTCGAAGTGGCTTCA GCTGAAACGTTATGCGGCGGAGAGCTGGTGGACGCGCTACAGTTTGTGTGTGGAGACAGAGGTTTCTATTTCAGTC GACCAACTAGCAGGTTGAGCAGTCGACGTTCTCAAAATCGTGGGATTGTGGAAGAGTGTTGTTTTAACAGTTGTAA CCTAGCTCTTCTAGAACAGTACTGCGCTAAACCTGCCAAGTCAGAGAGGGACGTTTCAGCCACATCCCTACAGGT CATCCCGGTGATGCCCACATTAAAACAGGAGGTCCCAAGAAAACATGTGACCGTGAAATATTCCAAATACGACAT GTGGCAACGAAAGGCCGCCCAGAGGCTACGGAGGGGCGTCCCCGCCATCCTGCGGGCCAAGAAGTTTAGGCGGCA GGCGGAGAGAATCAGGGCCCAAGAGCAACTGCACCACCACAGGCCTCTCATCACGCTTCCCAGCAAGCTCCCGCC CATCCTTTTTGCACAGAGTCGATGA，用Trizol抽提鲤鱼中的RNA，反转录成cDNA ；PCR扩增条件优化以cDNA为模板，用高保真酶扩增目的片段，PCR体系如下ComponentFinalCon.Volume ( μL)IOXBufferIX5MgSO4 (50mM)2. 5mM2dNTP(IOmM)0. 2mM1IGF2b-BamHI-F(10u Μ)0. 5μ M1IGF2b-NheI-R(10u Μ)0. 5μ M1Template1TaqHIFI(5U/μ L, Invitrogen)IU0. 2(WH2OTo50ul循环条件, 5 rutinI y t 1 r W>*C、 3O ； 3 f'· c-y < IWC*, 3 O s CifcTC.::, Os6S"0 IO rniii1 cy .:l e回收PCR产物，后克隆测序验证，而后进行慢病毒载体包装，同样会的包装后的慢病毒载体同样要进行IGF2b基因克隆测序验证；(2)在(1)的基础上，通过荧光显微镜观察法进行慢病毒滴度测定，在感染细胞后观察GFP表达状况以及IGF2b基因mRNA的表达情况；(3)在(2)基础上，通过人工授精的方式获得鲤鱼的未分裂的受精卵；通过显微注射的方法进行转基因鲤鱼的生产。
全文摘要
本发明公布了一种制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法的方法，其特征在于通过构建含有靶基因的慢病毒载体来进行转基因鱼的生产，其含有GFP报告基因可用于检测转基因的效果。本发明能够生产慢病毒转基因鱼，转基因鱼的成活率12.2%。
文档编号A01K67/027GK102363792SQ201110356210
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者张成锋, 朱健, 苏胜彦, 董在杰, 邴旭文 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心