专利名称：一种液泡膜定位序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术以及植物学领域；更具体地，本发明涉及一种液泡膜定位序列及其应用。
背景技术：
细胞是各种生命形式的基本组成单位，形形色色的蛋白质根据其自身的特性有序地分布在细胞的每个分区中行使相应的生物学功能(Cavalier-Smith，2009)。植物细胞的主要分区包括质膜和其它内膜系统、细胞核、细胞质以及位于其中的线粒体、叶绿体、高尔基体、内质网、核糖体、过氧化物酶体、液泡等各种细胞器。这些构成细胞的微小结构或分区统称为亚细胞结构。在植物细胞中，每个亚细胞结构上都分布着多种具有生物活性的蛋白质。蛋白质亚细胞定位的研究对于系统地理解植物形态建成、生长发育以及对环境的适应等方面都是必不可少的环节，不仅已成为功能基因组学的重要研究内容，而且具有生物工程上的实际应用价值。植物中各种蛋白质都是依据其自身基因编码的氨基酸序列所包含的定位信息，通过各种精确的分子机制定位到细胞特定的亚细胞部位的。人们通过各种定位技术，对各亚细胞结构中蛋白质的分布情况了解的越来越多。质膜和细胞内膜是一个蛋白质种类较多的区域，膜上的蛋白质主要有载体蛋白、通道蛋白、离子转运蛋白和蛋白受体等，还分布着一些重要的酶以及某些植物逆境相关蛋白；细胞质中分布着各种代谢活动所需的相关酶类；线粒体是有氧呼吸的主要场所，主要含有与有氧呼吸相关的酶类；叶绿体是植物光合作用的场所，因此也是光合作用所需酶类的主要存在部位；细胞核中也含有种类繁多的蛋白质，包括控制遗传信息合成、复制、代谢的酶与一些核定位信号相关的蛋白质
坐寸ο液泡是细胞质中由单层膜包围的充满水溶液的泡状结构，是植物细胞中普遍存在并具有多种功能的重要 细胞器(Wink M(1993)The plant vacuole:a multifunctioncompartment.J Exp Bot 44:231-246)。大部分植物细胞没有液泡就难以存活。植物液泡的形成起源于内质网-高尔基体-反式高尔基网络等内膜系统，通过生物合成、分泌途径的运输以及自体吞噬形成植物细胞特有的中央大液泡(Zouhar J, Rojo E(2009)Plantvacuoles:where did they come from and where are they heading Curr Opin PlantBiol 12:677-684)。随着细胞生物学与分子生物学研究的深入，人们逐渐认识到液泡不仅仅是简单的物料储藏室或者蛋白降解库，它参与调节细胞代谢与生长发育，控制细胞内物质累积和运输，维持细胞内环境稳定性，并提高植物适应环境变化和的生命活力。一般认为蛋白质在内质网上加工后通过分泌与内吞途径(secretory and endocytic pathways)运输到液泡内。在分泌途径的早期，高尔基体的分泌出芽点就已经将定位于液泡中的可溶性蛋白和膜蛋白与即将运送到细胞表面的蛋白质区分开来。液泡可溶性蛋白需要一类特殊的定位信号(vacuolar sorting determinant, VSD)加以标记，以便离开高尔基体后被相应的分拣受体蛋白VSR或类受体蛋白RMR等受体识别，从而顺利地向液泡进行运输。液泡分拣信号VSD主要包括序列特异性信号(ssVSD)、C-末端定位信号(CtVSD)和结构定位信号(psVSD)这三种类型。它们可以单独或者共同起作用。例如，在大豆IlS球蛋白中，多种VSD共同决定了它液泡定位的特性。尽管目前人们对蛋白的液泡定位机制有一定的认识，然而目前对于液泡膜上蛋白的亚细胞定位决定因子的研究非常缺乏，国际上也罕有相关报道。液泡膜具有较为复杂的结构，其上的蛋白数量也很多，在拟南芥蛋白质组的研究中鉴定出有195种不同的蛋白整合在液泡膜上(Carter C, Pan S, Zouhar J, Avila EL, Girke T,Raikhel NV(2004)The vegetative vacuole proteome of Arabidopsis thaliana revealspredicted and unexpected proteins.Plant Cell 16:3285-3303)。液泡膜上的蛋白不仅参与膜电位平衡与渗透调节，还负责运输储存营养元素，调控代谢过程并参与细胞的信号转导。本领域目前尚未有报道表明在植物中分离到决定液泡膜定位的专一性信号序列。因此，迫切需要找到一种液泡膜的专一性信号序列，以填补本领域的空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种液泡膜定位序列及其应用。在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽(液泡膜定位多肽)，其是:(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽；(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第I (20-50)位所示的多肽；(c)氨基酸序列如SEQ ID NO:5中第I (20-50)位所示的多肽；(d)将(a)多肽经过一个或多个(如1-5个；较佳地1-4个；更佳地1_3个；更佳地1-2个)氨基酸残基的取代或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽；(e)将(b)或 (C)多肽经过一个或多个(如1-5个；较佳地1-4个；更佳地1_3个；更佳地1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽；或(f)与(a)或(b)或(C)多肽的氨基酸序列相同性高于50% (较佳地高于60%;更佳地高于70% ;更佳地高于80% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于99% )，且具有液泡膜定位功能的多肽。在一个优选例中，(b)中，所述的多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第I (20-28)位(如第1-21位，第1-22位，第1-23位，第1-24位，第1-25位，第1-26位，第1-27位)所示的多肽；或(c)中，所述的多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO:5中第I (20-28)位(如第1-21位，第1-22位,第1_23位,第1_24位,第1_25位,第1_26位,第1_27位)所不的多妝。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸(液泡膜定位核酸)，其编码所述的多肽。在一个优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中第I (57-150)位所示的核苷酸序列。在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于引导目的蛋白定位到细胞的液泡膜(即:用于目标蛋白的液泡膜亚细胞定位)。在一个优选例中，所述的多肽用于减少或防止目的蛋白表达于细胞的液泡膜以外的其它部位(包括细胞器)。
在本发明的另一方面，提供一种表达构建物，其中含有所述的多核苷酸。在一个优选例中，所述的表达构建物不含有全长的编码SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5的多核苷酸。在另一优选例中，所述的表达构建物中，所述的多核苷酸(液泡膜定位核酸)的5'端和/或3'端，还包括多克隆位点(限制性内切酶位点)，用于连接编码目的蛋白的多核苷酸。在另一优选例中，所述的表达构建物中还含有与所述的多核苷酸操作性连接的编码目的蛋白的多核苷酸。在另一优选例中，所述的目的蛋白是外源蛋白。在另一优选例中，所述的目的蛋白是可溶性蛋白。在另一优选例中，所述的目的蛋白是结构蛋白、调控蛋白、转录因子等任何需要定位于液泡膜的蛋白(如植物品质、性状、抗性或代谢相关的蛋白)。在另一优选例中，所述的编码目的蛋白的多核苷酸位于所述的多核苷酸(液泡膜定位核酸)的下游，且与所述的多核苷酸的间隔小于500bp ;优选的，小于300bp ;更优选的，小于200bp ;更优选的，小于IOObp ;更优选的，小于50bp ;更优选的，小于30bp。在另一优选例中，所述的表达构建物是表达载体。在另一优选例中，所述编码目的蛋白的多核苷酸位于所述的多核苷酸(液泡膜定位核酸)的5'端和/或3'端。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞:含有外源的所述的多核苷酸；或含有所述的表达构建物。在一个优选例中，所述的宿主细胞为不能简单地借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞为非植物繁殖材料。在本发明的另一方面，提供所述的表达构建物的用途，用于在细胞的液泡膜上表达目的蛋白。在本发明的另一方面，提供一种在细胞的液泡膜上表达目的蛋白的方法，包括:(I)提供所述的表达构建物；(2)将(I)的表达构建物转化细胞。
在本发明的另一方面，提供一种制备转基因植物的方法，所述植物的细胞的液泡膜上特异表达目的蛋白，所述方法包括:将所述的表达构建物转入植物中。在一个优选例中，通过农杆菌转化的方法将所述的表达构建物转入植物中。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、拟南芥CBL2与CBL3蛋白的亚细胞定位。(A) CBL2与CBL3在拟南芥原生质体中的亚细胞定位；(B)转基因拟南芥植株35S:CBL2_YFP的亚细胞定位；
(C)转基因拟南芥植株35S:CBL3_YFP的亚细胞定位(Bar = 10 μ m)。图2、CBL2的N端前16个氨基酸是其亚细胞定位所必需的。图3、CBL2的N端前19个氨基酸(TTS序列)能够决定蛋白的液泡膜定位。图4、TTS序列在融合蛋白中的位置不影响其决定的液泡膜亚细胞定位。图5、TTS序列引导目标蛋白(CBL5，CIPK14，eIF4A，SND2)定位于植物细胞液泡膜应用实例。
具体实施例方式本发明人致力于细胞或组织专一性信号序列的研究，经过广泛的研究，分离到一段细胞液泡膜专一'I"生定位的信号序列(1noplast Targeting Sequence, TTS),该序列可引导蛋白精确高效地定位于细胞内液泡膜上。利用该序列可进行目的蛋白的定位改造，减少或阻止目的蛋白表达于液泡膜以外的其它部位(包括液泡膜以外的其它细胞器)。术语所述的“氨基酸”为同时含有一个或多个氨基和羧基的脂肪族有机酸，其根据氨基和羧基的位置，有α氨基酸和β氨基酸等类型。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使它的分子具有生化活性。参与蛋白质合成的常见氨基酸是20种L-α -氨基酸。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷 酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。所述的“液泡”包括植物细胞中的各种类型液泡，如中央大液泡、水解液泡、储藏液泡、囊泡状小液泡等。植物“液泡”也涵盖不同细胞类型与植物不同发育时期中的各种液泡。所述的“液泡膜”是指细胞质与液泡相隔的界面上存在的一层生物膜。它的组成和特性与细胞的质膜相同，主要由蛋白质和磷脂组成，其中磷脂形成磷脂双分子层，是膜的基本骨架，蛋白质分子以各种方式分布于其中，在功能上具有选择透过性。这里的液泡膜包括植物细胞中所有类型的液泡外层的生物膜。本发明中，所述的“植物(或作物)”没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于):双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于):小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、梓檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笑、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于:十字花科、禾本科、蔷薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于:十字花科芸薹属的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥属植物如拟南芥，禾本科的水稻、小麦、玉米等，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。如本文所用，所述的“目的蛋白”是指生物工程操作中的对象蛋白，包括任何可由本发明的液泡膜定位蛋白引导表达于液泡膜的蛋白。只要能够与所述的液泡膜定位蛋白相融合、结合或偶联的蛋白均可作为目的蛋白。例如，所述的目的蛋白包括但不限于:改良植物品质、性状、抗性或代谢相关的基因。较佳地，所述的目的蛋白是可溶性蛋白。所述的目的蛋白本身也可以是一种融合蛋白。所述的“可溶性蛋白”指可以以小分子状态溶于水或其他溶剂的蛋白，这里也代表生物体内具有生物活性的亲水性蛋白。如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果TTS序列与目的蛋白序列的组合通常不是天然存在的，则TTS序列对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。如本文所用，术语“专一性定位”、“专一性表达”、“特异性定位”、“特异性表达”是指目的蛋白在特定的细胞器(如液泡膜)上表达。通常，如果在某组织或器官(如液泡膜)中蛋白量比在其它组织或器官中高至少5倍，优选至少高10倍，更优选至少高100倍，最优选至少高1000倍，则该蛋白被认为是组织或器官专一性定位的。液泡膜定位多肽(TTS)本发明提供一种液泡膜定位多肽，其是:(a)氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:2 (MSQCIDGFKHVCSS FFRCF，如图 2下图CBL3前19位)所 示的多肽；(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:3中第I (20-50)位所示的多肽；(c)氨基酸序列如SEQ ID NO:5中第I (20-50)位所示的多肽。其中，氨基酸序列如SEQ ID NO:3(或SEQ ID NO:5)中第I (20-50)位指定了一系列的序列，所述序列起始于SEQ ID N0:3(或SEQ ID NO:5)中第I位，终止于SEQ IDNO:3(或SEQ ID NO:5)中第20位至第50位中的任一位的氨基酸。本发明的TTS多肽(蛋白)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括TTS的衍生物和类似物(如TTS的保守性变异多肽)。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的TTS相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。TTS的衍生物和类似物包括(但并不限于):若干个(通常为1-5个，较佳地1-4个，更佳地1-3个，最佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(如50个以内，较佳地为30个以内，较佳地为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或减少一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。氨基酸的取代或替换最好根据表I进行。表I
权利要求
1.一种分离的多肽，其是 (a)氨基酸序列如SEQID NO :1或SEQ ID NO : 2所示的多肽； (b)氨基酸序列如SEQID NO :3中第I (20-50)位所示的多肽； (c)氨基酸序列如SEQID NO 5中第I (20-50)位所不的多妝； (d)将(a)多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽； (e)将(b)或(C)多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有液泡膜定位功能的多肽；或 (f)与(a)或(b)或(C)多肽的氨基酸序列相同性高于50%，且具有液泡膜定位功能的多肽。
2.如权利要求I所述的多肽，其特征在于，(b)中，所述的多肽是氨基酸序列如SEQIDNO :3中第I (20-28)位所示的多肽；或 (c)中，所述的多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO :5中第I (20-28)位所示的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求I或2所述的多肽。
4.权利要求1-2任一所述的多肽的用途，用于引导目的蛋白定位到细胞的液泡膜。
5.—种表达构建物,其中含有权利要求3所述的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的表达构建物，其特征在于，其中还含有与权利要求3所述的多核苷酸操作性连接的编码目的蛋白的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞 含有外源的权利要求3所述的多核苷酸；或 含有权利要求5-6任一所述的表达构建物。
8.权利要求5或6所述的表达构建物的用途，用于在细胞的液泡膜上表达目的蛋白。
9.一种在细胞的液泡膜上表达目的蛋白的方法，包括 (1)提供权利要求6所述的表达构建物； (2)将(I)的表达构建物转化细胞。
10.一种制备转基因植物的方法，所述植物的细胞的液泡膜上特异表达目的蛋白，所述方法包括将权利要求6所述的表达构建物转入植物中。
全文摘要
本发明涉及一种液泡膜定位序列及其应用。本发明人首次分离到一段细胞液泡膜专一性定位的信号序列(Tonoplast Targeting Sequence，TTS)，该序列可引导蛋白精确高效地定位于细胞内液泡膜上。利用该序列可进行目的蛋白的定位改造，减少或阻止目的蛋白表达于液泡膜以外的其它部位。
文档编号A01H5/00GK103254293SQ20121003434
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月15日 优先权日2012年2月15日
发明者张洪霞, 唐仁杰 申请人:中国科学院上海生命科学研究院