专利名称：钠通道调制剂BmK I的新应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种钠通道调制剂BmK I的新应用。
背景技术：
电压门控钠离子通道(Voltage Gates of Sodium Channels, VGSCs)在神经元和其他可兴奋细胞动作电位形成和传导过程中有非常重要的作用。目前，钠离子通道的研究主要还是依赖于之前的一部分知识积累，这些信息能够提供对于钠通道功能重要性以及可兴奋细胞的功能紊乱等的的更深理解。以及钠通道呈现出的亚型多样性，为理解钠通道在生理 /病理下的功能特性及其动态平衡调控带来了复杂性，同时，也正在引发通道药理与毒理基因组学研究的挑战性。由于钠通道在细胞兴奋性中的基础性作用，它的任何改变都将对机体的生理功能造成复杂的影响。Navl. UNavl. 2,Navl. 3和Navl. 6的改变将会导致众多神经系统性疾病的产生。电压门控钠通道生理学特性的改变被认为是导致癫痫、疼痛、先天性肌肉强直症等多种神经系统疾病的重要因素，一直是研究的热点。目前临床上癫痫、神经病理性痛等的治疗药物通常以钠通道为靶器，但由于其选择性不高，可能产生严重的副作用。因此，开拓对不同通道亚型具有特异选择性作用的配体/调制剂并解析新型通道亚型的基因编码特征，不仅有利于各亚型生理功能的阐明与药理价值的评估，同时也为钠通道关联的临床疾病治疗药物研制提供理论的可行性和新分子先导物。帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是常见的一种以运动障碍为主要临床表现的神经退行性疾病，帕金森病的主要病理改变为进行性的中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺能神经元的丧失以及由此而产生的多巴胺衰竭。造成帕金森病运动障碍可能与黑质-纹状体环路多巴胺神经递质减少所致基底神经节环路功能障碍。另外，在很多神经退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病)中，膜离子通道(例如电压门控钠离子通道VGSCs)在这些患者的病理生理学机制中扮演着重要的角色。对于帕金森病人和动物模型的电生理研究显示苍白球和丘脑底核神经元放电活动增加，呈现为同步有节律的高频脉冲式放电。苍白球和丘脑底核神经元自发性放电主要依赖电压门控钠离子通道产生的钠电流驱动，研究显示电压门控钠离子通道阻断剂TTX能够抑制基底神经节的自发性放电活动以及阈下膜电位震荡。在成年哺乳动物中枢神经系统中，钠离子通道除了在细胞和组织分布上的差异， 其在发育过程中的表达以及亚细胞的定位也是不同的。在成年期的中枢神经系统中， Navl. 6是分布最丰富的钠通道类型。Navl. 6主要在颗粒细胞中表达，高丰度表达于外周和中枢神经系统有髓鞘神经元的郎飞氏节处，在无髓神经元的轴突以及皮层锥体神经元和小脑Purkinje细胞的树突也有分布。综合比较相关文献可发现，迄今没有一篇文献就全脑扫片描述Navl. 6在中枢神经系统中胶质细胞的亚细胞定位，以及在6-0HDA单侧脑损毁的帕金森大鼠的中枢神经系统中的Navl. 6的分布改变。钠通道在维持细胞的兴奋性和正常生理功能上起着重要的作用，同时它还是许多药物作用的靶点。目前国际上已经有研究者应用包括蝎毒素在内的一些钠离子通道调制剂进行帕金森病发病机制以及治疗的报道，如Mlthun-Lassalle等的研究显示钠离子通道调制剂Veratridine (藜芦定)以及α-ScTx对培养中的原代神经元有神经保护作用； Schiavon的研究显示β类蝎毒素Cn2能够诱发出Navl. 6通道的复活电流，并提出Cn2可以作为帕金森病研究中的先导化合物。东亚钳蝎(^zifel5Karsch，BmK)是我国传统的中医药经常采用的名贵药材，被用于治疗各种神经系统疾病。现代生化和药理研究表明，东亚钳蝎粗毒中富含多种膜离子通道特异性的天然肽类调制剂，尤其是一些电压门控钠离子通道调制剂。BmK I是由东亚短钳蝎中提取分离纯化而得到的一类钠通道特异性靶向药物，是一个由60-70个氨基酸组成的长链肽类，能够作用于钠通道受体位点3，改变钠通道的电生理特征，显著延缓其失活过程。其机理是由于钠通道由一个形成孔道的功能性α亚基，一个或数个辅助β亚基组成。α亚基是钠通道行使功能的关键亚基，由四个高度同源的结构域(DI-DIV)组成，每个结构域含有六个跨膜α螺旋片段(S1-S6)。在其结构上目前已经鉴定了至少七个通道靶向药物的受体位点，而本发明的钠通道靶向药物BmK I能够与钠通道上受体位点3结合。 受体位点 3 由 VGSCs 的 DI/S5-S6、DIV/S5-S6、以及 DIV/S3-S4 组成，其中 DIV/S3-S4 这段序列中的氨基酸对通道与位点3靶向药物结合至关重要。钠离子通道调制剂α类蝎毒素BmK I作为Navl. 6 一种可能的药物作用靶标，具有成为一种工具药在帕金森病研究中的前景，以及在帕金森病发病机制和治疗措施研究中存在的潜在前景。
发明内容
本发明的目的之一根据对正常大鼠及6-0HDA单侧脑损毁的帕金森大鼠的全脑扫片，显示Navl.6在脑内的分布情况和表达丰度，提供一种钠通道调制剂BmK I作为药物靶标在建立帕金森疾病模型中的应用。本发明通过对正常大鼠及6-0HDA单侧脑损毁的帕金森大鼠进行Navl. 6全脑扫片，观察Navl. 6在脑内神经元细胞及胶质细胞中的分布及亚细胞定位。结果证明，Navl. 6 不论在神经元还是在星形胶质细胞中，都有高丰度的表达。在正常大鼠脑内，在大脑皮层呈现弥散性分布，在神经元聚集的区域高度表达在神经元的轴突上，在神经纤维富集的大脑脚、胼胝体有大量表达，另外，在星形胶质细胞上也有大量分布。在6-0HDA单侧脑损毁的帕金森大鼠全脑脑片免疫荧光结果显示，在损毁侧的胼胝体、海马CA4区、海马齿状回、丘脑后侧核区、黑质网状部较之未损毁侧有不同程度表达量的升高，在胼胝体和丘脑后侧核区表达的Navl. 6可以和GFAP-标记的星形胶质细胞共标，在海马CA4区、中脑红核的主要表现为神经元胞体形态，在海马齿状回主要聚集在神经元轴突出聚集表达。在大脑皮层和海马区，存在一些胞外Navl. 6聚集的斑块状(Plaque)形态存在。本发明中，还利用了人神经瘤母细胞SH-SY5Y作为体外模型，在验证了经过维甲酸诱导后的SH-SY5Y可以表达Navl. 6 的前提下，在施加500nM的BmK I后，发现稳态激活曲线向超极化方向移动5个毫伏左右，而对激活曲线的斜率没有显著影响。表明在BmK I的作用下，通道变得更易激活。并且发现 500nM的BmK I也可以使快失活曲线向超极化方向偏移9mV，并且增大了失活曲线的K值， 使得曲线变缓，表明BmK I针对SH-SY5Y表达的中枢型电压门控钠通道有调制作用。
本发明在验证正常大鼠和6-0HDA单侧脑损毁的帕金森大鼠全脑的Navl. 6表达分布检测的基础上，又探讨了 BmK I对人神经瘤母细胞SH-SY5Y的电生理的改变。为钠离子通道调制剂BmK I作为药物靶标提供了可靠的理论基础，为研究帕金森病的细胞分子机制以及治疗策略提供了研究载体，为其新型治疗药物的研究提供丰富的理论和实验依据。同时也为研发新型治疗神经退行性疾病药物提供了可靠的筛选平台。
图1为正常大鼠脑内Navl. 6的分布。A 外侧中央前区(Prcl) ；B 前嗅核(Aop)， 后部；C:扣带前皮质(ACd)，背侧部；D 外侧嗅束(LOT)和梨状前皮质(PCa)，前部(10X)。 图2 正常大鼠脑内Navl. 6阳性细胞与星形胶质细胞标志物GFAP共标。A，B, C为乳头体 (MMP) ；D, E，F为外侧中央前区(Prcl) ；A, D为Nav 1. 6阳性细胞；B, E为GFAP阳性细胞； C，F为Merge图。(红色为Nav 1. 6阳性细胞，绿色为GFAP阳性细胞)。图3为帕金森大鼠脑内Navl. 6阳性细胞与星形胶质细胞标志物GFAP共标。A，B， C为丘脑腹后外侧核(Vpl);D，E，F为胼胝体压部(SCC)(Anti-NaV1.6红色；Anti-GFAP绿色)；A, D为Nav 1. 6阳性细胞；B, E为GFAP阳性细胞；C, F为Merge图。图4帕金森大鼠脑内Navl. 6阳性细胞与星形胶质细胞标志物GFAP共标。A，B，C 为丘脑腹后外侧核(Vpl) ;D，E，F为胼胝体压部(SCC) (Anti-Navl. 6红色；Anti-GFAP绿色)；A, D为Nav 1. 6阳性细胞；B, E为GFAP阳性细胞；C, F为Merge图。(红色为Nav 1. 6 阳性细胞，绿色为GFAP阳性细胞)
图5为分别使用ΙΟΟΟηΜ，500nM, 250nM, 125nM不同浓度的BmK I处理维甲酸诱导三天的SH-SY5Y细胞。图6为维甲酸诱导后的SH-SY5Y细胞Nav 1.6的表达情况。图7为膜片钳记录到IOOnM的TTX可以完全阻断SH-SY5Y细胞产生的内向纳电流。图8为维甲酸诱导SH-SY5Y六天以后的稳态激活曲线。图9为维甲酸诱导SH-SY5Y六天以后的稳态失活曲线。图10为维甲酸诱导SH-SY5Y六天以后的快失活曲线。图11为维甲酸诱导SH-SY5Y六天以后的慢失活曲线。
具体实施例方式实施例一正常大鼠脑内Navl. 6的分布情况和表达丰度
正常大鼠麻醉后，开胸灌流，生理盐水去血以及4%多聚甲醛固定，断头取脑，4°C条件下继续在4%多聚甲醛后固定过夜，20%、30%的蔗糖溶液梯度脱水。用恒冷箱切片机(MICR0M HM525型)，_22°C进行大鼠全脑冰冻冠状切片，片厚18 μ m。切片直接贴覆于经明胶-硫酸铬钾处理的载玻片上，置于_20°C冰箱保存。各脑区脑切片进行免疫荧光双标实验。切片，回温处理。5% Goat Serum封闭，室温 lh。加兔抗 Navl.6 抗体(1 500，abcam，USA)，4°C孵育过夜。0. OlM PBS CpH 7. 4)冲洗10 min，重复3次。加山羊抗兔Cy3标记荧光二抗(红色标记，1 :800，millipore，USA)室温下置湿盒中孵育2h (或者4°C过夜)。0. 05M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.4)30 min终止反应。5% donkey Serum 封闭，室温 lh。加小鼠抗 GFAP 抗体(1 300，cell signaling,USA)。加用0. OlM羊抗鼠FITC标记荧光二抗(绿色标记，1 :200，santa cruz，Europe)室温下置湿盒中孵育池(或者4°C过夜)。50%甘油封片。每步骤之间均用0. OlM PBS CpH 7. 4) 冲洗10 min，重复3次。图1为正常大鼠脑内Navl. 6的分布。A 外侧中央前区(Prcl) ；B 前嗅核(Aop)， 后部；C:扣带前皮质(ACd)，背侧部；D 外侧嗅束(LOT)和梨状前皮质(PCa)，前部(10X)。图2为正常大鼠脑内Navl. 6阳性细胞与星形胶质细胞标志物GFAP共标。A，B，C 为乳头体(MMP) ；D, E，F为外侧中央前区(Prcl) ；A, D为Nav 1. 6阳性细胞；B, E为GFAP阳性细胞；C, F为Merge图。(红色为Nav 1. 6阳性细胞，绿色为GFAP阳性细胞)。图1显示的结果明显表示，在正常大鼠脑内，Navl. 6不论在大脑皮层还是大脑白质都有表达。在正常大鼠脑内，在大脑皮层呈现弥散性分布，在神经元聚集的区域高度表达在神经元的轴突上，在神经纤维富集的大脑脚、胼胝体有大量表达，另外，在星形胶质细胞上也有大量分布。故后续实验进行了 Navl. 6和GFAP免疫荧光双标的实验。在图2显示的结果中，Navl. 6阳性能够和GFAP阳性较好程度的共标，同时也存在少量颗粒弥散状的分布。结果显示，在正常大鼠脑内，Navl. 6的阳性主要有GFAP标记的星形胶质细胞所贡献， 同时弥散性的分布也表示，在脑内，Navl. 6的阳性并不仅仅由星形胶质细胞所提供。该结果为进一步深入了解脑内Navl. 6的研究提供了新的实验依据。实施例二 6_0HDA单侧脑损毁的帕金森大鼠脑内Navl. 6的分布情况和表达丰度 6-0HDA单侧脑损毁的帕金森大鼠进行脑灌注、固定、脱水、冰冻切片、免疫染片。具体实
验步骤参照实施例一所述。图3 帕金森大鼠脑内Navl. 6阳性细胞与星形胶质细胞标志物GFAP共标。A，B，C 为丘脑腹后外侧核(Vpl) ;D，E，F为胼胝体压部(SCC) (Anti-Navl. 6红色；Anti-GFAP绿色)；A, D为Nav 1. 6阳性细胞；B, E为GFAP阳性细胞；C, F为Merge图。(红色为Nav 1. 6 阳性细胞，绿色为GFAP阳性细胞)。图4:Nav 1. 6在帕金森大鼠模型不同脑区的分布。A，B为海马齿状回(DG_CA4);C， D为胼胝体压部(SCC);E，F为黑质网状部(Snr);G，H为红核(Red nucleus)； Contralteral sections代表对照侧，Ipsilateral sections代表损毁侧。在图3的6-0HDA单侧脑损毁的帕金森大鼠全脑脑片免疫荧光结果显示，在PD大鼠模型的脑内，不论以丘脑腹侧核为代表的基底神经节神经元区，还是以胼胝体压部为代表的大脑白质神经纤维富集区，都显示了 Navl. 6和GFAP明显共标。在图4中，Navl. 6单标结果中，显示了在海马CA4区、中脑红核的主要表现为神经元胞体形态，在海马齿状回主要聚集在神经元轴突出聚集表达。在大脑皮层和海马区，存在一些胞外Navl. 6聚集的斑块状(Plaque)形态存在。图3、4结论表示，在PD大鼠脑内，特别在大脑白质区域，Navl. 6的阳性贡献者也主要是由星形胶质细胞所提供，而在大脑皮层区域、海马区域或者神经核团等区域，Navl. 6的阳性主要在神经元胞体和轴突上表达，另外，还存在部分胞外Navl. 6聚集的斑块状(Plaque)形态存在。在图4，显示的Nav 1. 6和GFAP双标的实验结果，在PD模型大鼠的脑内，损毁侧与未损毁侧，Navl. 6在一些脑区存在着明显的差异。在损毁侧的胼胝体、海马CA4区、海马齿状回、丘脑后侧核区、黑质网状部较之未损毁侧有不同程度表达量的升高。以上的结果，为了解PD大鼠脑内Navl. 6的改变提供了实验数据，为进一步的深入研究PD脑内电压门控钠离子通道的平衡，研究帕金森病发病机制提供实验依据。实施例三不同浓度的BmK I不能降低SH-SY5Y细胞的细胞活性
参见图5，图5为使用MTS法测细胞活性统计图。在均勻铺板的96孔板上，利用不同浓度的 BmK I (125nM, 250nM, 500nM, IOOOnM)处理 SH-SY5Y —天，再分别加入 MTS 溶液显色 4 小时，在波长490nm下检测吸光度，统计作图。结果显示不同浓度的BmK I不能降低SH-SY5Y的细胞活性。提示BmK I作为特异性钠通道的调制剂，并没有明显的细胞毒性。实施例四维甲酸(RA)诱导后的SH-SY5Y细胞表达Nav 1. 6
SH-SY5Y细胞用维甲酸分别诱导3天组、6天组和不诱导组三组，利用免疫荧光化学的方法Navl. 6的表达。细胞用4%多聚甲醛固定，含l%Triton-X的PBS处理30分钟后PBS洗三遍，5%的羊血清孵育1小时，直接上一抗(Rabbit polyclonal to Nav 1. 6, abeam, UK), 4° C 冰箱过夜。二抗(Goat anti Rabbit CY3. conjugated, Millpore, USA)，孵育两小时， PBS洗四遍，必要时可以镜检一下荧光颗粒有没有洗干净。DAPI，5分钟，PBS洗净后甘油封片。参见图6，图6为钠通道亚型Navl. 6在SH-SY5Y的表达情况。CT3标记为Navl. 6， DAPI标记细胞核。Con组为不加一抗的空白对照，标尺为10 μ m。经过维甲酸诱导的SH-SH5Y细胞，3天与6天都检测到Navl. 6的表达，表达丰度没有明显差别。而没有RA诱导的细胞，也有Navl.6的表达，但是信号并不强烈。根据这一结果，以下膜片钳记录均采用维甲酸诱导六天的SH-SY5Y细胞进行实验。实施例五BmK I对维甲酸诱导六天后的SH-SY5Y细胞系的调制作用
按照Hamill等报道的方法，在室温(21 V -25 °C )下利用EPC-9放大器(德国，HEKA Eletronik)进行全细胞电压膜片钳实验。通过PC-IO拉制仪(日本，Narishige)将玻璃毛细管拉制成尖端阻抗为2-3 ΜΩ的膜片钳电极。利用Pulse/PusleFit 8.3软件(德国， HEKA Eletronik)来采样和制定刺激方案。电容电流由系统补偿。串联电阻误差由系统补偿75%，串联电阻高于15 ΜΩ的细胞不可用。线型漏电流采用P/4的方法由系统给予补偿。数据的采样频率为20 kHz，低通滤波频率为10 kHz。采用重力灌流系统进行换液，不同浓度的NaCl溶液在20 s内约更换95%。SH-SY5Y 细胞膜片钳实验中，细胞内液(mM) :CsF 120, HEPES 10, EGTA 10, NaCl 10，CsCl 10，CaCl2 (以 CsOH 调整 pH 至 7. 3)。细胞外液(mM) :NaCl 135，HEPES 10，MgCl2 4，Glucose 10，KCl 5, Tetraethylammonium 10，EGTA 1 (以 NaOH 调整 pH 至 7. 4)。内液和外液的渗透压分别用蔗糖矫正为观5-四0和四5-300 mOsm。毒素溶于含1 mg/ml牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的细胞夕卜液中。稳态激活曲线利用电导公式和波尔兹曼方程拟合(图8);稳态失活曲线、快慢失活曲线直接利用波尔兹曼方程拟合(图9，10，11)。拟合后参数半数激活(失活)电压/2，电压常数K分别统计后制成表一。1 . SH-SY5Y细胞系表达TTX敏感的钠通道
参见图7，IOOnM的TTX可以完全阻断SH-SY5Y细胞产生的内向纳电流。
2 .BmK I可使SH-SY5Y的稳态激活曲线向超极化方向偏移
参见图8，图8为维甲酸诱导SH-SY5Y六天以后的稳态激活曲线，圆点黑线代表对照组(n=24)，三角灰线代表加BmK I后10分钟之后的稳态激活曲线(n=24)。通过给予一系列脉冲刺激后诱发纳电流，统计后得到SH-SY5Y细胞电流稳态激活曲线。在施加500nM的BmK I后，可以使曲线向超极化方向移动5个毫伏左右，参见图9。 而对稳态激活曲线的斜率没有显著影响。参见表1，表1中的Activation表示通道在BmK I的作用下，变得更易激活。表一不同刺激的半数激活(失活)电压和电压常数K的比较
3. BmK I可以使SH-SY5Y的稳态失活曲线向超极化方向偏移
施加500nM的BmK I下，可以使SH-SY5Y的稳态失活曲线向超级化方向偏移5mV左右， ？ ' KJaL^ 1 Φ steady-State Inactivgitiori。4 BmK I针对SH-SY5Y内向纳电流的快失活向超极化方向偏移，但对慢失活动力学的无影响。图10甲酸诱导SH-SY5Y六天以后的快失活曲线(n=9，15)，图11为B为同条件下得慢失活曲线(n=7，10)。500nM的BmK I可以使快失活曲线向超极化方向偏移5mV左右， 但是对于慢失活曲线没有影响(图11)。表明在SH-SY5Y细胞系中，BmK I主要调制了钠通道快失活的组分，而对慢失活组分调制没有显著性差异。此外500 nM的BmK I可以增大快组分失活曲线的斜率因子，(参见表1，Fast inactivation)，这一结果提示，BmK I影响到了第四结构域的电压感受器。
权利要求
1. 一种钠通道调制剂BmK I作为药物靶标在建立帕金森疾病模型中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种钠通道调制剂BmKI的新应用。本发明在验证正常大鼠和6-OHDA单侧脑损毁的帕金森大鼠全脑的Nav1.6表达分布检测的基础上，又探讨了BmKI对人神经瘤母细胞SH-SY5Y的电生理的改变。为钠离子通道调制剂BmKI作为药物靶标提供了可靠的理论基础，为研究帕金森病的细胞分子机制以及治疗策略提供了研究载体，为其新型治疗药物的研究提供丰富的理论和实验依据。同时也为研发新型治疗神经退行性疾病药物提供了可靠的筛选平台。
文档编号A01K67/027GK102552878SQ201210046118
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日
发明者冯琦, 吉永华, 吴凌燕, 朱红艳, 裴虓 申请人:上海大学