专利名称：一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法
技术领域：
本发明涉及组织工程技术领域，具体的说是涉及一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法。
背景技术：
羊膜和绒毛膜是人胎盘的两个主要组成部分。羊膜在胎盘的最内层，膜体光滑，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性 ，其含有丰富的具有多潜能性、移植后不会诱导免疫排斥反的多能干细胞，人胎盘羊膜细胞还可表达神经细胞特异标记，分泌神经营养因子，用于神经系统疾病，除此之外人胎盘羊膜还可以作为眼科手术的基底膜；而绒毛膜是胎盘主体部分，与羊膜相邻，绒毛膜上同样含有丰富的具有多分化潜能的干细胞，可应用于由于衰老和病变引起的组织器官损伤修复以及移植中。理想化的工程化组织，除了需要具备很高的生物活性外，还需要能随时满足移植等手术的需要，因此，如人胎盘羊膜和绒毛膜这样含有多能干细胞的工程化组织就需要长期保存。低温冷冻保存是活体组织保存的常用方法，它一般是在0 -196°c进行保存。尽管低温冷冻技术能够使工程化组织长期保存，但是也带来了冷冻损伤的问题。为了减少冷冻损伤的问题，在保存细胞和组织的时候需要加入冷冻保护液，从而减轻或避免冷却、复苏过程中的冰晶对细胞的损伤。中国专利申请号201010528721. I的专利提供了一种“人脐带华通氏胶组织块冻存保护液”，其根据所要保护的间充质干细胞的特点，公开了由渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂以及基础液等等多种成分组成保护液，应对间充质干细胞在冷冻保存中可能出现的损伤情况。但是，目前尚未有针对人胎盘羊膜和绒毛膜的低温冷冻保存技术报道。因此，提供一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的技术，无疑会提高羊膜和绒毛膜的保存质量，保证羊膜和绒毛膜干细胞临床应用的效果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法，使得所述方法能够有效保护人胎盘羊膜和绒毛膜，使其复苏后的干细胞活性达到90%以上。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案—种冷冻保护液，由胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40组成，所述胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40的体积比为7-9:1: I。其中，作为优选，所述胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40的体积比为8:1:1。二甲基亚砜(DMSO)是一种重要的渗透型细胞保护剂。在深低温(零下196度)保存细胞时冻存过程中，能防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。而右旋糖酐40属于非渗透性抗冻剂，能溶于水，但不能进入细胞，使溶液呈过冷状态，可在特定温度下降低溶质浓度，从而起到保护作用。由于其分子量大，分子浓度低，对溶剂的活性作用很小，能降低溶液中低分子溶质(电解质)浓度，减轻盐损伤，慢速冷冻效果较好。冻存细胞是个缓慢的过程，胎牛血清给冻存细胞提供必要的营养，而且血清中含有丰富的蛋白质对细胞也有保护作用。胎牛血清、右旋糖酐40与DMSO按照本发明所述比例混合作为人胎盘羊膜和绒毛膜冻存时的保护液，右旋糖酐40是细胞外防护剂，DMSO具有高渗透性，是细胞内保护剂，胎牛血清是营养物质，三者适应于羊膜干细胞和绒毛膜干细胞的特性，协同保护细胞的活性，防止细胞在冻存和复苏的时候形成冰晶，进而影响细胞的活性。因此，本发明所书冷冻保护液能够应用在低温冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜中。此外，本发明还提供一种冷冻保存人胎盘 羊膜和绒毛膜的方法，以胎牛血清二甲基亚砜右旋糖酐40为7-9:1 I的体积比称量胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40，配制成冷冻保护液，待储存的人胎盘羊膜和绒毛膜分别浸入到冷冻保护液中，然后降温至-100°C,最后转移至液氮中保存。作为优选，所述胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40的体积比为8:1:1，所述降温操作优选为先以1°C /min的速率降至_40°C，然后再以5°C /min的速率降温。将按照本发明所述方法冻存过的人胎盘羊膜和绒毛膜进行复苏，然后分离、培养干细胞，同利用新采集的人胎盘羊膜和绒毛膜制备的干细胞进行活性对比，两者活性均在90%，无明显差异，表明了本发明所述冷冻保护液和方法能够极其有效的保护羊膜和绒毛膜细胞活性，细胞几乎没有受到冷冻损伤，与新制备的羊膜和绒毛膜干细胞无差别。由以上技术方案可知，本发明在深入研究人胎盘羊膜和绒毛膜结构性的基础上，选择适合于保护人胎盘羊膜干细胞和绒毛膜干细胞的二甲基亚砜、右旋糖酐40和胎牛血清组成保护液，三者协同保护细胞的活性，防止细胞形成冰晶受到损伤，确保了复苏后的干细胞活性与新制备的羊膜和绒毛膜干细胞活性无差别。
具体实施例方式本发明实施例公开了一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法进行详细说明。实施例I :利用本发明所述方法冻存人胎盘羊膜和绒毛膜I、冻存方法选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯储液瓶作为运送瓶，内装市售细胞培养液，采集后4°C条件下12小时内送到冻存处。
无菌环境下，用有齿镊轻轻的分离开羊膜和绒毛膜，手术剪剪取羊膜和绒毛膜。用生理盐水分别冲洗羊膜和绒毛膜2-3次，去除表面血块等污物后，将羊膜和绒毛膜分别在培养皿里剪成约Icm2大小。以胎牛血清二甲基亚砜右旋糖酐40为8:1:1的体积比称量胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40，配制成冷冻保护液，待储存的人胎盘羊膜和绒毛膜分别浸入到冷冻保护液中，再分装入冻存管中，拧紧管盖。将冻存管放入程序降温仪，先以1°C /min的速率降至-40°C，然后再以5°C /min的速率降温至-100°C，最后将冻存管转入液氮中，_196°C长期保存。
2、活性对比按照I中采集标准重新取新鲜胎盘并分离羊膜和绒毛膜，用生理盐水分别冲洗羊膜和绒毛膜2-3次，去除表面血块等污物后，将羊膜和绒毛膜分别在培养皿里剪成约Icm2大小置于离心管中，加入0. 2%的II型胶原酶，37°C水浴消化40min。往离心管加入生理盐水，300目筛网过滤；滤液300G离心5min，洗涤2_3次。然后完全培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，于37°C、5%C02培养。大约12-24小时后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后即获得干细胞，检测干细胞活性达到90%以上。将I中冻存的羊膜和绒毛膜取出，立即投入到37°C水浴锅中，并迅速晃动，待冻存液溶解后立即取出冻存管。冻存管表面消毒后，在超净工作台内打开，将羊膜和绒毛膜悬液转移入离心管中，加入预冷生理盐水，300G离心5min，洗涤2_3次。之后按照前述新采集胎盘的羊膜和绒毛膜制备干细胞的方法，制备复苏后羊膜干细胞和绒毛膜干细胞，检测干细胞活性同样达到90%以上。结果表明，冻存后的羊膜和绒毛膜干细胞几乎没有受到冷冻损伤，与新制备的羊膜和绒毛膜干细胞无差别，细胞活性均在90%以上，且两者细胞生长至融合所用时间也相同。实施例2 :利用本发明所述方法冻存人胎盘羊膜和绒毛膜I、冻存方法选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯储液瓶作为运送瓶，内装市售细胞培养液，采集后4°C条件下12小时内送到冻存处。无菌环境下，用有齿镊轻轻的分离开羊膜和绒毛膜，手术剪剪取羊膜和绒毛膜。用生理盐水分别冲洗羊膜和绒毛膜2-3次，去除表面血块等污物后，将羊膜和绒毛膜分别在培养皿里剪成约Icm2大小。以胎牛血清二甲基亚砜右旋糖酐40为7:1:1的体积比称量胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40，配制成冷冻保护液，待储存的人胎盘羊膜和绒毛膜分别浸入到冷冻保护液中，再分装入冻存管中，拧紧管盖。将冻存管放入程序降温仪，先以1°C /min的速率降至-40°C，然后再以5°C /min的速率降温至-100°C，最后将冻存管转入液氮中，_196°C长期保存。2、活性对比按照I中采集标准重新取新鲜胎盘并分离羊膜和绒毛膜，用生理盐水分别冲洗羊膜和绒毛膜2-3次，去除表面血块等污物后，将羊膜和绒毛膜分别在培养皿里剪成约Icm2大小置于离心管中，加入0. 2%的II型胶原酶，37°C水浴消化40min。往离心管加入生理盐水，300目筛网过滤；滤液300G离心5min，洗涤2_3次。然后完全培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，于37°C、5%C02培养。大约12-24小时后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后即获得干细胞，检测干细胞活性达到90%以上。将I中冻存的羊膜和绒毛膜取出，立即投入到37°C水浴锅中，并迅速晃动，待冻存液溶解后立即取出冻存管。冻存管表面消毒后，在超净工作台内打开，将羊膜和绒毛膜悬液转移入离心管中，加入预冷生理盐水，300G离心5min，洗涤2_3次。之后按照前述新采集胎盘的羊膜和绒毛膜制备干细胞的方法，制备复苏后羊膜干细胞和绒毛膜干细胞，检测干细胞活性同样达到90%以上。
结果表明，冻存后的羊膜和绒毛膜干细胞几乎没有受到冷冻损伤，与新制备的羊膜和绒毛膜干细胞无差别，细胞活性均在90%以上，且两者细胞生长至融合所用时间也相同。实施例3 :利用本发明所述方法冻存人胎盘羊膜和绒毛膜I、冻存方法选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯储液瓶作为运送瓶，内装市售细胞培养液，采集后4°C条件下12小时内送到冻存处。无菌环境下，用有齿镊轻轻的分离开羊膜和绒毛膜，手术剪剪取羊膜和绒毛膜。用生理盐水分别冲洗羊膜和绒毛膜2-3次，去除表面血块等污物后，将羊膜和绒毛膜分别在培养皿里剪成约Icm2大小。以胎牛血清二甲基亚砜右旋糖酐40为9:1:1的体积比称量胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40，配制成冷冻保护液，待储存的人胎盘羊膜和绒毛膜分别浸入到冷冻保护液中，再分装入冻存管中，拧紧管盖。将冻存管放入程序降温仪，先以1°C /min的速率降至-40°C，然后再以5°C /min的速率降温至-100°C，最后将冻存管转入液氮中，_196°C长期保存。2、活性对比按照I中采集标准重新取新鲜胎盘并分离羊膜和绒毛膜，用生理盐水分别冲洗羊膜和绒毛膜2-3次，去除表面血块等污物后，将羊膜和绒毛膜分别在培养皿里剪成约Icm2大小置于离心管中，加入0. 2%的II型胶原酶，37°C水浴消化40min。往离心管加入生理盐水，300目筛网过滤；滤液300G离心5min，洗涤2_3次。然后完全培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，于37°C、5%C02培养。大约12-24小时后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后即获得干细胞，检测干细胞活性达到90%以上。将I中冻存的羊膜和绒毛膜取出，立即投入到37°C水浴锅中，并迅速晃动，待冻存液溶解后立即取出冻存管。冻存管表面消毒后，在超净工作台内打开，将羊膜和绒毛膜悬液转移入离心管中，加入预冷生理盐水，300G离心5min，洗涤2_3次。之后按照前述新采集胎盘的羊膜和绒毛膜制备干细胞的方法，制备复苏后羊膜干细胞和绒毛膜干细胞，检测干细胞活性同样达到90%以上。结果表明，冻存后的羊膜和绒毛膜干细胞几乎没有受到冷冻损伤，与新制备的羊膜和绒毛膜干细胞无差别，细胞活性均在90%以上，且两者细胞生长至融合所用时间也相同。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利 要求的保护范围内。
权利要求
1.一种冷冻保护液，其特征在于，由胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40组成，所述胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40的体积比为7-9:1: I。
2.根据权利要求I所述冷冻保护液，其特征在于，所述胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐 40的体积比为8:1 I。
3.权利要求I所述冷冻保护液在低温冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜中的应用。
4.一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法，其特征在于，以胎牛血清二甲基亚砜右旋糖酐40为7-9:1:1的体积比称量胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40，配制成冷冻保护液，待储存的人胎盘羊膜和绒毛膜分别浸入到冷冻保护液中，然后降温至_100°C，最后转移至液氮中保存。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40的体积比为8:1:1。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述降温具体为 先以1°C /min的速率降至_40°C，然后再以5°C /min的速率降温。
全文摘要
本发明涉及组织工程技术领域，公开了一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法。本发明所述由胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40组成，所述胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40的体积比为7-9:1∶1。本发明在深入研究人胎盘羊膜和绒毛膜结构性的基础上，选择适合于保护人胎盘羊膜干细胞和绒毛膜干细胞的二甲基亚砜、右旋糖酐40和胎牛血清组成保护液，三者协同保护细胞的活性，防止细胞形成冰晶受到损伤，确保了复苏后的干细胞活性与新制备的羊膜和绒毛膜干细胞活性无差别。
文档编号A01N1/02GK102763642SQ20121028870
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月14日 优先权日2012年8月14日
发明者吕康涛, 李春波, 江鹤, 燕舞 申请人:郑州赛英科干细胞技术有限公司