非洲栽培稻基因渗入恢复系和部分种间杂交水稻选育方法
【专利摘要】本发明公开了一种非洲栽培稻基因渗入恢复系和部分种间杂交水稻选育方法。该方法包括下列步骤：首先是通过种间远缘杂交和复交（三交、四交），经系谱选择获得非洲栽培稻基因渗入恢复系；其次是利用非洲栽培稻基因渗入恢复系为父本，细胞质雄性不育系或光温敏不育系为母本测交，选配部分种间杂交水稻；最后用SSR标记进行分子验证。该方法拓宽了杂交水稻亲本选育可资利用的种质资源库，有利于聚合非洲栽培稻抗逆性与普通栽培稻高产特性的有利基因；实现对两个栽培稻种间杂种优势的利用,进一步提高水稻杂种优势利用水平。本发明提供了一种选育高产抗逆新型部分种间杂交水稻的技术方法，是适用于杂交水稻抗逆性育种和超高产育种的一条新途径。
【专利说明】非洲栽培稻基因渗入恢复系和部分种间杂交水稻选育方法
【技术领域】
[0001]本发明属于作物杂种优势利用的【技术领域】，更具体涉及一种利用非洲栽培稻与普通栽培稻籼稻进行种间杂交和复(回)交选育具有非洲稻基因的基因渗入恢复系，并以该基因渗入恢复系为父本选配新型部分种间杂交稻的方法。
【背景技术】
[0002]杂种优势(Heterosis)这一现象最早由Shull于1908年提出，用以描述遗传基础不同的两个亲本间杂交产生的杂种F1在某些性状上或综合表现上较双亲表现优秀的现象。杂种优势主要表现在生长势和营养体、抗逆性和适应性、生理功能、产量因素、品质和生化表现等方面。它在各类作物遗传育种中均具有非常重要的地位。德国植物学家Koeireuter研究在对烟草等植物的研究中描述了杂种优势的存在。盖特纳、达尔文(1877)和孟德尔(1866)在各自的试验中也都证实了杂种优势的存在。
[0003]Jones (1926)最早报道了水稻中存在杂种优势。随后，印度，日本，美国，中国等国的科学家开始投入水稻杂种优势的研究与利用。袁隆平等1964年开始在我国进行水稻杂种优势利用研究，1973年我国实现了籼型杂交稻的三系配套，1975年实现了粳稻的三系配套，1976年杂交水稻在生产上实现了大面积推广，迄今生产上推广利用的杂交水稻品种主要是籼稻品种间杂交稻，粳稻品种间杂交稻也有一定面积。80年代以后，水稻籼粳亚种间杂种优势的利用研究受到重视，近年推广的超高产籼稻杂交稻品种中，有些品种的亲本之一有粳稻亲缘或具有粳稻基因，可视为部分亚种间杂交稻。
[0004]水稻杂种优势利用可分为三个发展阶段，即品种间杂种优势利用，亚种间杂种优势利用及远缘杂种优势利用(杨守仁，1996)。我国目前杂种优势利用仍处于前二个发展阶段，其中第一个发展阶段，即籼稻或粳稻品种间杂种优势利用的技术已经成熟；第二个发展阶段，即籼粳亚种间杂种优势利用，由于广亲和基因的研究利用也取得了长足进步；而对于第三个发展阶段，即远缘杂种优势利用，迄今开展的具体研究很少，此前尚无人提出系统的远缘杂交稻育种途径和方法。
[0005]稻属(Oryza)包括23个物种，其中两个为栽培种，即普通(亚洲)栽培稻(Oryzasativa)和非洲栽培稻(Oryza glaberrima),两个栽培稻种分别在亚洲和非洲地区由不同的野生稻祖先种驯化起源，均具有AA染色体组。目前全球范围内种植的水稻主要是普通栽培稻，包括籼稻和粳稻两个亚种。在普通栽培稻1000多年前由亚洲引种到非洲后，非洲稻的原始种植区域逐步被更高产的普通栽培稻品种取代，并衍生发展出大量普通栽培稻的非洲地方品种。目前非洲栽培稻仅作为旱稻有零星种植，非洲栽培稻具有较强的抗逆性。育种学家期望把非洲栽培稻的优良性状引入普通栽培稻进行水稻遗传改良，但普通栽培稻与非洲栽培稻间存在生殖隔离，种间杂交困难且Fl代表现为雄性不育。20世纪90年代，西非水稻发展协会(WARDA)的Monty Jones等利用胚拯救技术获得种间杂交Fl种子，再与普通栽培稻品种进行回(复)交，由其后代选育成稳定的新型纯系品种，命名为非洲新稻(NERICA)，在非洲推广应用 。徐鹏等(2005)研究表明通过两次回交，再自交2_3代，种间杂种不育的障碍基本可得到克服，并可引入非洲栽培稻的有利基因，并通过该法成功将非洲稻基因引入云南粳稻。也有研究表明利用同源四倍体水稻为桥梁，更容易将非洲栽培稻的遗传物质引入普通栽培稻(梁芳等，2004)。上述研究的目的均是通过种间杂交导入非洲栽培稻的有利基因进行普通栽培稻常规品种的遗传改良。
[0006]胡凤益等(2002)报道了两个栽培稻种间杂种具有较强的营养生长优势，普通栽培稻籼稻与非洲栽培稻种间杂交比籼粳亚种间杂交显著提高分蘖期的单株干重及单株茎蘖数，而粳稻与非洲栽培稻种间杂交是除籼粳杂交外的另一条增加生物产量的重要途径。由于种间杂种的高度不育，此前尚无关于两个栽培稻种间杂种谷物产量优势的研究报道。发明人的研究团队最近首先报道了利用具有非洲稻基因的基因渗入恢复系选配的几个部分种间杂交稻组合具有产量潜力(单穗谷重)的超亲优势(Adedze Y.M.Nevame, etc.,2012)。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供了一种非洲栽培稻基因渗入恢复系和部分种间杂交水稻的选育方法。该方法利用种间杂交选育具有非洲栽培稻基因的基因渗入恢复系作为新型杂交水稻亲本，拓宽杂交水稻选育可资利用的种质资源库，有利于聚合非洲栽培稻抗逆性与普通栽培稻高产特性的有利基因；以非洲栽培稻基因渗入恢复系为父本配组的新型部分种间杂交稻的基因组具有部分种间杂合基因位点，可以实现对两个栽培稻种间杂种优势的利用，进一步提高杂种优势利用水平，为杂交水稻的高产抗逆育种提供了一条新途径。适用于新型部分种间杂交水稻的抗逆性选育和超高产育种等方面的应用。
[0008]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施:[0009]一种非洲栽培稻基因渗入恢复系和部分种间杂交水稻的选育方法，其步骤是:
[0010]1、非洲栽培稻基因渗入恢复系的选育:
[0011]I)非洲栽培稻与普通栽培稻的种间杂交:
[0012]利用19 个非洲栽培稻(Oryza glaberrima Steud.)品系 RAM3、RAM48、RAM54、RAM111、RAM131、RAM152 与多个 138 个普通栽培稻籼稻品种(Oryza sativa L.ssp.1ndica)进行大量人工饱和授粉杂交，克服种间远缘杂交的高度不孕性，获得种间F1代种子:以热带地区(纬度18° 32' 11" N以南，年平均温度25°C左右)春季短日照条件下抽穗的非洲栽培稻品系或籼稻品种为母本，温汤去雄:水温44-46°C，处理时间5-6min，以籼稻品种或非洲栽培稻品系为父本进行人工饱和授粉，杂交配组1000对，每组合5个杂交袋，每袋2-3穗，1.8%以上的组合可获得F1代种子；
[0013]2)通过复交和系谱选择获得非洲栽培稻基因渗入系的选系:
[0014]在温带地区(纬度30° 28' 17" N左右，年平均温度16°C左右)初夏播种上季收获的种间F1代种子，45%组合的种子发芽成苗，种间杂种F1植株在温带地区夏秋相对较长日照的生长季节不能抽穗，将其稻蔸移栽到热带地区，再生的种间杂种F1植株在热带地区春季短日照条件下抽穗，所有植株均为雄性不育，以不育的种间F1植株为母本与籼稻品种父本进行一、二次复交(三交、四交)，获得复交组合的F1代种子；
[0015]随后，分别在热带地区和温带地区种植复交组合F1及以后世代，在热带地区和温带地区穿梭育种，对复交组合自交后代用系谱法选择至Fltl — F12代，育成群体遗传性状稳定的非洲栽培稻基因渗入系；[0016]3)测交筛选非洲栽培稻基因渗入恢复系:
[0017]以选定的水稻细胞质不育系或光温敏不育系为母本，非洲栽培稻基因渗入系为父本进行测交，根据测交组合F1代的花粉育性、结实率等育性指标与株高、穗长、有效穗数、穗粒数、千粒重等农艺和产量性状表现，筛选非洲栽培稻基因渗入系作为三系或者两系杂交稻的恢复系；
[0018]a.以选定的水稻细胞质不育系为母本，非洲栽培稻基因渗入系为父本进行测交，筛选F1花粉育性3 90%，结实率3 80%，综合农艺性状优良的组合，对其父本进行复测筛选，最终筛选出恢复能力强、一般配合力高、综合农艺性状好的非洲栽培稻基因渗入系作为三系杂交稻的恢复系。
[0019]b.以选定的水稻光温敏不育系为母本，非洲栽培稻基因渗入系为父本进行测交，筛选F1花粉育性3 90%，结实率3 80%，且综合农艺性状优良的组合，对其父本进行复测筛选，最终筛选出恢复能力强、一般配合力高、综合农艺性状好的非洲栽培稻基因渗入系作为两系杂交稻的恢复系。
[0020]2、部分种间杂交水稻的选育:
[0021]I)以筛选获得的一般配合力高的非洲稻渗入恢复系作父本骨干系，以水稻细胞质雄性不育系或光温敏不育系材料作为母本，进行测交配组，获得部分种间杂交组合F1代种子;
[0022]2)种植鉴定各测交组合F1代，田间试验以推广品种为对照，对比法排列；抽穗期镜检花粉育性，成熟期取样考种，考察相关农艺性状，收获计产；
[0023]3)比较分析各测交组合F1的产量和农艺性状，筛选组合进入复测鉴定，进行品种产量比较实验，品比试验按随机区组设计，设3次重复，小区面积13.3m2，周围设置保护区；
[0024]4)经过品比产量试验进行`产量、农艺性状和抗逆性鉴定，对选定的部分种间杂交稻组合进行小面积制种，提供种子参加区域试验和生产试验，进入品种审定程序。
[0025]3、通过SSR标记对非洲稻渗入系进行分子验证
[0026]根据已发表的水稻微卫星引物序列(http://www.gramene.0rg/),选取分布于水稻12条染色体上的53对SSR引物。对供试的非洲稻渗入系、其选育过程中涉及的非洲栽培稻及普通栽培稻供体材料进行PCR扩增与多态性分析。
[0027]I)相关水稻材料的DNA提取:
[0028]对非洲稻渗入系、其选育过程中涉及的非洲栽培稻及普通栽培稻供体材料提取基因组总DNA，采用常规CTAB的DNA提取法(参照张涛等(2007 )改良的McCouch等(2002 )的CTAB提取方法。)，简要说明如下:
[0029](I)分别取0.1g供试材料的水稻嫩叶，剪碎后放入研钵中，加入适量液氮研磨成粉，装入一 1.5ml离心管中，加入700 μ I CTAB提取液和20 μ L β -巯基乙醇，65°C水浴45min。
[0030](2)在水浴后的离心管中加入500 μ I氯仿:异戊醇(体积比24:1)，充分混匀，台式离心机上1000Orpm离心IOmin,取上清转移至另一 1.5ml离心管。
[0031](3)加入2/3体积的异丙醇，充分混匀，_20°C或冰上放置30min，1000Orpm离心3min,倒掉上清液；
[0032](4)以75% (v/v)乙醇对DNA沉淀洗涤2_3次，随后以无水乙醇脱水漂洗一次，1000Og离心I~2min ;弃上清，将离心管倒置IOmin使酒精滤干，然后溶于60 TE,-20 °C保存；使用时稀释至20ng/iil。
[0033]2) PCR扩增与产物检测
[0034](I)PCR 反应体系:总体积为 20iiL，其中 10XPCR buffer (with Mg2+) 2 u L,IOmmoI/L 的 dNTP0.4 y L，5U/ y L 的 Taq 聚合酶 0.2 y L, 20ng/ y L 的 DNA 模板 2 y L,20 u mol/L的前后引物各0.5u L,加去离子水至20 u L。
[0035](2)扩增程序:94°C预变性5min，扩增循环为:94°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，35次循环；72°C延伸10分钟，最后转入4°C保存。
[0036](3)电泳检测:扩增后的产物在浓度为6% (w/v)的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，经过银染直接观察并照相保存。
[0037]3) SSR标记分析:
[0038](I)SSR为共显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性。每对SSR引物作为一个位点，视同一迁移位置每一扩增条带为一个等位基因，有此带记为I，没有的记为0,缺失则记为9。
[0039](2)按DICE (1945)的方法计算品种间的相似系数(GS)和遗传距离(⑶)计算公式如下:
[0040]GS=2Nxy/ (2Nx y+Nx+Ny), GD=1-GS
[0041]其中，Nxy为材料x、y公有条带数；Nx为材料x的条带数；Ny为材料y的条带数。
[0042]通过NTsys2.1e软件进行聚类分析，建立相似性树状图，结合农艺性状及考种数据分析材料间的部分种间遗传差异与杂种优势的相关性。
[0043]本方法育成的非洲栽培稻基因渗入恢复系中非洲稻核基因占12.5% (四交后代)至25.0% (三交后代)，经分子标记检测证实其核基因组中非洲栽培稻基因达10%以上，相应的部分种间杂交稻具有10%以上的种间杂合基因位点。
[0044]本发明的优点
[0045]本发明具有以下优点和效果:
[0046]I)利用种间杂交选育非洲栽培稻基因渗入恢复系，可聚合非洲栽培稻与普通栽培稻的有利基因，拓宽杂交水稻亲本选育可资利用的种质资源库，有利于实现杂交水稻高产与抗逆的结合。
[0047]2)以非洲栽培稻基因渗入恢复系为父本配组新型部分种间杂交稻，可以实现对两个栽培稻种间杂种优势的利用，进一步提高杂种优势利用水平，为杂交水稻超高产育种提供了新的途径。初步研究结果表明，部分种间杂交组合的超亲优势最高可达80.27%，竞争优势可达57.78%。
【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1为一种涉及的部分非洲栽培稻与普通栽培稻亲本之间的SSR多态性标记示意图。
[0049]其中R为非洲栽培稻亲本，J为普通栽培稻亲本；M=Marker，1-12分别为在两个亲本间具有多态性的 SSR 标记引物:1=RM247, 2=RM224, 3=RM11, 4=RM25, 5=RM433, 6=RM474, 7=RM215, 8=RM257, 9=RM501, 10=RM404, 11=RM239, 12=RM294[0050]图2:为15份水稻材料(非洲栽培稻品系RAM3、RAM54和RAM152、非洲栽培稻基因渗入恢复系R1-R7、普通栽培稻光温敏不育系M1S、M163S、M175S和广占63S、普通栽培稻常规恢复系9311)基于SSR标记的UPGMA聚类树状图。
[0051]图3:为一种基于非洲栽培稻基因渗入恢复系(IL1-15)、原始普通栽培稻亲本金23B及不育系(M6S，广占63S与非洲稻细胞质的籼型不育系新中9A)遗传差异性所构建的聚类分析示意图。
【具体实施方式】
[0052]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如:J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；或直接按照制造厂商所建议的条件。具体步骤如下:
[0053]实施例1:
[0054]一种非洲栽培稻基因渗入恢复系的选育方法，其步骤是:
[0055]I)非洲栽培稻与普通栽培稻的种间杂交:
[0056]以海南春季短日照条件下抽穗的非洲栽培稻19个品系RAM3、RAM48、RAM54、RAM111、RAM1 31、RAM152等为母本，温汤去雄:水温44至46°C，处理时间5至6min，以138个籼稻品种父本进行人工饱和授粉，杂交配组1200对，每组合5个杂交袋，每袋2-3穗，从其中9个非洲栽培稻材料与16个籼稻品种杂交的22个组合中获得种间F1代种子，本实例中收获的种间Fl杂交种均为发育不完全的皱缩干瘪种子。
[0057]2)通过复交和系谱选择获得非洲栽培稻基因渗入系的选系:
[0058]在武汉初夏播种上季收获的种间F1代种子，45%组合的种子发芽成苗，种间杂种F1植株营养生长旺盛，在温带地区夏秋相对较长日照的生长季节均不能抽穗；
[0059]将种间杂种F1稻蔸移栽到海南，再生的种间杂种F1植株在海南春季短日照条件下抽穗，所有植株均为雄性不育，以不育的种间F1植株为母本与籼稻品种父本进行一、二次复交(三交、四交)，获得复交组合的F1代种子；
[0060]随后，分别在武汉和海南种植复交组合F1及以后世代，结合10至12代的系谱选择和不育系测交筛选，育成群体遗传性状稳定的包括ILR4、ILR5在内的非洲栽培稻基因渗入系选系。
[0061]3)测交筛选非洲栽培稻基因渗入恢复系:
[0062]以选定的水稻细胞质雄性不育系为母本，非洲栽培稻基因渗入恢复系选系材料为父本进行测交，种植测交F1代，筛选出F1正常可育且综合农艺性状优良的组合；对其父本进行复测筛选，最终筛选出恢复能力强、一般配合力高、综合农艺性状好的非洲栽培稻基因渗入系选系作为三系杂交稻的恢复系。本实例中ILR4所配组合其Fl材料平均花粉可育率达94.5%，套袋自交结实率82.2%，恢复能力强；而ILR5则表现不佳，不宜作为三系恢复系。且由下表可知，ILR4在穗粒数、结实率和单株产量等重要性状上的一般配合力较高，分别高达10.493,11.993,24.583，且在穗长、剑叶长、结实率等多数性状上均具有正向的一般配合力。因此ILR4可作为重点待选的骨干恢复系与三系或者两系不育系组配部分种间杂交稻。
[0063]以选定的水稻光温敏不育系为母本，非洲栽培稻基因渗入系选系的为父本进行测交，筛选Fl正常可育且综合农艺性状优良的组合；对其父本进行复测筛选，最终筛选出一般配合力高、综合农艺性状好的非洲栽培稻基因渗入系的选系作为两系杂交稻的恢复系。由下表可知，ILR5在结实率、千粒重和单株产量等产量性状上的一般配合力较高，分别高达13.186,2.294和18.815，且在穗长、株高、生育期等多数性状上均具有正向的一般配合力。因此ILR5可作为重点待选的骨干恢复系与两系不育系组配两系部分种间杂交稻。
[0064]待测选系ILR4、ILR5的农艺及产量性状的一般配合力见下表:
[0065]
【权利要求】
1.一种非洲栽培稻基因渗入恢复系和部分种间杂交水稻选育方法，其步骤是: a、非洲栽培稻基因渗入恢复系的选育: (1)非洲栽培稻与普通栽培稻的种间杂交: 利用非洲栽培稻与普通栽培稻籼稻品种进行人工饱和授粉杂交，获得种间F1代种子:以热带地区春季短日照条件下抽穗的非洲栽培稻或籼稻品种为母本，温汤去雄:水温44-46°C，处理时间5-6min，以籼稻品种或非洲栽培稻品系为父本进行人工饱和授粉，杂交配组1000对，每组合5个杂交袋，每袋2-3穗，1.8%以上的组合获得F1代种子； (2)通过复交和系谱选择获得非洲栽培稻基因渗入系: 在温带地区初夏播种上季收获的种间F1代种子，45%组合的种子发芽成苗，种间杂种F1植株在温带地区夏秋相对较长日照的生长季节不能抽穗，将其稻蔸移栽到热带地区，再生的种间杂种F1植株在热带地区春季短日照条件下抽穗，所有植株均为雄性不育，以不育的种间F1植株为母本与籼稻品种父本进行一、二次复交，获得复交组合的F1代种子； 随后，分别在热带地区和温带地区种植复交组合F1及以后世代，在热带地区和温带地区穿梭育种，对复交组合自 交后代用系谱法选择至Fltl — F12代，育成群体遗传性状稳定的非洲栽培稻基因渗入系； (3)测交筛选非洲栽培稻基因渗入恢复系: 以选定的水稻细胞质不育系或光温敏不育系为母本，非洲栽培稻基因渗入系为父本进行测交，根据测交组合F1代的表现，筛选非洲栽培稻基因渗入系作为三系或者两系杂交稻的恢复系； b、部分种间杂交水稻的选育: (1)以筛选得到的非洲栽培稻基因渗入恢复系作父本骨干系与水稻细胞质雄性不育系或光温敏不育系测交配组； (2)种植鉴定各测交组合F1，在抽穗期镜检花粉育性，在成熟期收获考种和计产； (3)比较分析各测交组合F1的产量和农艺性状，筛选组合进入复测鉴定，进行品种产量比较实验； (4)对选定的部分种间杂交稻组合进行小面积制种，提供种子参加区域试验和生产试验，进入品种审定程序。
【文档编号】A01H1/02GK103704123SQ201210375198
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年9月30日 优先权日:2012年9月30日
【发明者】靳德明, 阿们, 段志杰, 贺文闯 申请人:华中农业大学