专利名称：云南杜鹃高效再生体系的建立方法
云南杜鹃高效再生体系的建立方法技术领域
本发明属于杜鹃花生物技术育种领域，具体涉及一种云南杜鹃高效再生体系的建立方法，可用于云南杜鹃基因工程和无性突变系筛选。
背景技术：
云南杜醇(Rhododendron为杜醇花科,杜醇属灌木或小乔木,主要分布于云南(西、西北、北、东北部)、陕西南部、四川西部、贵州西北、西藏东南部，境外緬甸东北部也有分布。生于山坡杂木林、灌丛、松林、松-栎林、云杉或冷杉林缘，海拨1600米一 4000 米。
本发明人于2008年开始从云南的中甸、大理、师宗、梁王山引种云南杜鹃至云南省农科院花卉所资源圃(昆明)，发现云南杜鹃是杜鹃花基因工程育种理想的基因表达受体材料，因云南杜鹃植株移栽易于成活，次年即可开花，播种实生苗3年后也可开花，可见云南杜鹃抗逆性强，具有很强的适应性和比较广的适应范围。
植物遗传转化即转基因技术是近四十年来发展起来的一项生物技术。利用转基因技术可以在保持木本植物原有较好遗传背景的前提下定向改变某些性状，同时还能大大缩短育种时间，这为克服木本植物传统育种局限性，加速木本植物遗传育种进展提供了便利。 目前转基因技术已成为木本植物遗传育种的主要研究领域。然而转基因技术极大的依赖于体外培养物能够高效稳定再生成完整植株的技术，建立高效稳定的遗传转化受体系统是转基因育种的基础。而木本植物组织培养和植株再生的难度较大。如缺乏合适的转化受体材料，难以建立高效稳定的遗传转化体系。其次是基因型依赖性较强，转化效率不高。因此， 系统深入研究影响云南杜鹃植株再生因子、诱导植株再生的方法并获得再生植株，建立专门针对云南杜鹃的高效稳定的再生体系，具有重要意义，可为云南杜鹃转基因育种工作提供理论基础和实验依据，同时将有效推进杜鹃花生物技术育种进程。云南杜鹃的再生体系研究至今未见报道。发明内容
本发明目的是提供一种专门针对云南杜鹃的高效再生体系的建立方法。
本发明所述的云南杜鹃高效再生体系的建立方法，包括以下步骤(1)无菌苗的获得取侧芽饱满的云南杜鹃半木质化茎段，剪成带有I 2个侧芽的茎段，用洗衣粉水清洗，之后清水漂洗干净，在无菌条件下依次用质量分数为O. 12%的升汞溶液浸泡15min，质量分数为2%的次氯酸钠溶液浸泡8min，无菌水冲洗3 5次，切去茎段两头接种于诱导培养基上诱导侧芽萌发，待不定芽长至2 3cm时切下不定芽转入增殖培养基上培养获得无菌苗，所述的诱导培养基为MS + 6-BA lmg/L+ NAA O. I mg/L，pH值为5. 4 ;所述的增殖培养基为WPM + ZT 2 mg/L, pH值为5. 4 ；(2)再生体系的建立①叶片直接再生不定芽将步骤(I)中获得的28 32天苗龄无菌苗的中上部叶片，切成O. 5cm2 O. 8cm2的叶盘，并在叶盘背面划伤口，叶盘背面朝下接种于叶盘分化培养基A中或叶盘分化培养基B 中，叶盘分化培养基A为WPM+TDZ O. 4 mg/L+ NAAO. 05 mg/L+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为 5. 4，叶盘分化培养基B为WPM+ZT 2 4mg/L+NAA0. O lmg/L+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为 5. 4 ；或②叶片间接再生不定芽A.将步骤(I)中获得的28 32天苗龄无菌苗的中上部叶片，切成约O.5cm2 O. 8cm2 的叶盘，并在叶盘背面划伤口，叶盘背面朝下接种于愈伤组织诱导培养基中培养，所述的愈伤组织诱导培养基为WPM+TDZ O O. 5 mg/L+2, 4-D1. O mg/L+水解酪蛋白O 500 mg/L+ 蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为5. 4 ；B.将步骤(2)②A中得到的愈伤组织转接入愈伤组织分化培养基中诱导不定芽，所述的愈伤组织分化培养基为WPM+ZT4. Omg/L+NAA O. I mg/L+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为 5. 4 ；(3)壮苗培养将步骤(2)①叶片直接再生不定芽培养出的不定芽或将(2)②叶片间接再生不定芽培养出的不定芽分棵切开或切成3-5棵为一丛放入壮苗培养基中培养20 25天，所述的壮苗培养基为=WPM+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为5. 4 ;(4)生根培养将经步骤(3)壮苗培养的苗分棵切开，接种于生根培养基中培养，所述的生根培养基为1/2 WPM+ IAA1. O I. 5mg/L+ 蔗糖 3%+ 琼脂 O. 6%，pH 值为 5. 4 ；以上各步骤培养条件均为温度为23°C士 2°C，光照强度为20001x，光照时间为I 2 h · cT1，各培养基中蔗糖和琼脂含量的百分数为质量百分数。
步骤(2)①优选的叶盘分化培养基B为WPM+ZT4mg/L+NAA0. O lmg/L+蔗糖3%+琼脂 O. 6%，pH 值为 5.4。
步骤(2)②A优选的愈伤组织诱导培养基为WPM+TDZ O. 5 mg/L+2, 4-D 1.0 mg/ L+水解酪蛋白500 mg/L+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为5. 4。
步骤(4)优选的生根培养为1/2WPM + IAA I. 5mg/L+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为 5. 4。
本发明的有益效果是I、本发明首次针对云南杜鹃叶片诱导植株再生进行了系统深入的研究，采用叶片直接诱导或间接诱导植株再生两条途径，以及特定的培养基，使叶片直接诱导不定芽的诱导率可达62 73%，每个叶盘上的平均芽数可达6. 93个，叶片愈伤组织的诱导率达62 100%， 愈伤组织疏松、体积大，质量好，愈伤组织分化成不定芽的分化率在70%以上，叶片直接诱导或间接诱导的不定芽的生根率均达69 89%，图I-图9也表明，本发明方法所建立的云南杜鹃高效再生体系能使云南杜鹃叶片在叶片直接再生不定芽或叶片间接再生不定芽，不定芽的壮苗培养、生根培养各个环节均生长表现良好，培养的植株健壮、根系发达，表明本发明方法建立了能高频率产生愈伤组织和不定芽，并能高频率生根获得完整植株的云南杜鹃再生体系。表明本发明方法建立云南杜鹃高效再生体系是切实可行和有效的。
2、叶盘和愈伤组织两种材料是进行目的基因浸染的常用材料，本发明能高效地诱导不定芽和愈伤组织，为云南杜鹃后续的转基因育种工作，实现高频转化提供了良好的再生体系及其建立的方法。
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图I是云南杜鹃叶盘直接诱导不定芽过程中诱导出的不定芽点。2是云南杜鹃叶盘直接诱导不定芽过程中不定芽点长成不定芽。3是云南杜鹃叶盘间接诱导不定芽过程中诱导出愈伤组织。4是云南杜鹃叶盘间接诱导不定芽过程中愈伤组织增殖。5是云南杜鹃叶盘间接诱导不定芽过程中愈伤组织分化不定芽。6是云南杜鹃叶盘间接诱导不定芽过程中愈伤组织分化的不定芽长大。 7是云南杜鹃壮苗培养的生长表现。8是云南杜鹃生根培养的生长表现。9是云南杜鹃生根培养的生长表现。
具体实施方式
以下各实施例所用的材料及试剂均为市售，各实施例无特殊说明均为常规方法。
本发明提供的一种云南杜鹃高效再生体系的建立方法，具体实施步骤如下I、无菌苗的获得取侧芽饱满的云南杜鹃半木质化茎段，剪成带I 2个侧芽的小段，洗衣粉水振荡清洗之后用清水漂洗干净，无菌条件下消毒，依次用质量分数为O. 12%的升汞溶液浸泡15min， 质量分数为2%的次氯酸钠溶液浸泡8min，其间不断摇晃，之后无菌水冲洗3 5次，切去茎段两头接种于MS + 6-BA (6-苄基腺嘌呤)lmg/L+ NAA (萘乙酸)0·1 1^/1^!1值为5.4 的诱导培养基上诱导侧芽萌发，20d后待不定芽长至2 3cm时切下不定芽转入WPM + ZT 2 mg/L, pH值为5. 4的增殖培养基上获得无菌苗，用于再生体系建立的材料为28 32天苗龄的无菌苗的中上部叶片。
2、再生体系的建立(I)叶片直接再生不定芽将步骤I中30天苗龄的无菌苗的中上部叶片，切成O. 5cm2 O. 8cm2的叶盘，并在叶盘叶背面划“井”字伤口，叶盘背面朝下接种于表I所列的激素组合的各叶盘分化培养基中培养。
权利要求
1.云南杜鹃高效再生体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤 (1)无菌苗的获得 取侧芽饱满的云南杜鹃半木质化茎段，剪成带有I 2个侧芽的茎段，用洗衣粉水清洗之后，清水漂洗干净，在无菌条件下依次用质量分数为O. 12%的升汞溶液浸泡15min，质量分数为2%的次氯酸钠溶液浸泡8min，无菌水冲洗3 5次，切去茎段两头接种于诱导培养基上诱导侧芽萌发，待不定芽长至2 3cm时切下不定芽转入增殖培养基上培养获得无菌苗，所述的诱导培养基为MS + 6-BA lmg/L+ NAA O. I mg/L，pH值为5. 4 ;所述的增殖培养基为WPM + ZT 2 mg/L，pH 值为 5. 4 ； (2)再生体系的建立 ①叶片直接再生不定芽 将步骤(I)中获得的28 32天苗龄无菌苗的中上部叶片，切成O. 5cm2 O. 8cm2的叶盘，并在叶盘背面划伤口，叶盘背面朝下接种于叶盘分化培养基A中或叶盘分化培养基B中，叶盘分化培养基A为WPM+TDZ O. 4 mg/L+ NAAO. 05 mg/L+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为.5. 4，叶盘分化培养基B为WPM+ZT 2 4mg/L+NAA0. O lmg/L+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为.5.4 ； 或②叶片间接再生不定芽 A.将步骤(I)中获得的28 32天苗龄无菌苗的中上部叶片，切成约O.5cm2 O. 8cm2的叶盘，并在叶盘背面划伤口，叶盘背面朝下接种于愈伤组织诱导培养基中培养，所述的愈伤组织诱导培养基为WPM+TDZ O O. 5 mg/L+2, 4-D1. O mg/L+水解酪蛋白O 500 mg/L+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为5. 4 ； B.将步骤(2)②A中得到的愈伤组织转接入愈伤组织分化培养基中诱导不定芽，所述的愈伤组织分化培养基为WPM+ZT4. Omg/L+NAA O. I mg/L+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为.5.4 ； (3)壮苗培养 将步骤(2)①叶片直接再生不定芽培养出的不定芽或将(2)②叶片间接再生不定芽培养出的不定芽分棵切开或切成3-5棵为一丛放入壮苗培养基中培养20 25天，所述的壮苗培养基为=WPM+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为5. 4 ; (4)生根培养 将经步骤(3)壮苗培养的苗分棵切开，接种于生根培养基中培养，所述的生根培养基为:1/2 WPM+ IAA1. O I. 5mg/L+ 蔗糖 3%+ 琼脂 O. 6%，pH 值为 5. 4 ； 以上各步骤培养条件均为温度为23 °C 士 2 °C，光照强度为2000 lx，光照时间12h · cT1，各培养基中蔗糖和琼脂含量的百分数为质量百分数。
2.根据权利要求I所述的云南杜鹃高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤(2)①所述的叶盘分化培养基B为WPM+ZT4mg/L+NAA0. O lmg/L+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为5. 4。
3.根据权利要求I或2所述的云南杜鹃高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤(2)②A所述的愈伤组织诱导培养基为WPM+TDZ 0.5 mg/L+2, 4-D 1.0 mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+ 蔗糖 3%+ 琼脂 O. 6%，pH 值为 5. 4。
4.根据权利要求I或2所述的云南杜鹃高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤(4)所述的生根培养为1/2WPM + IAA I. 5mg/L+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为5. 4。
5.根据权利要求3所述的云南杜鹃高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤(4)所述的生根培养为1/2WPM + IAA I. 5mg/L+蔗糖3%+琼脂O. 6%，pH值为5. 4。
全文摘要
本发明为一种云南杜鹃高效再生体系的建立方法，属于植物生物技术育种领域。该方法以云南杜鹃无菌苗的中上部叶片为材料，在WPM培养基的基础上，主要配有激素TDZ、ZT、2,4-D、NAA、IAA、水解酪蛋白中一种或几种及适宜的浓度，通过叶片直接再生和间接再生两条途径获得完整植株。本发明首次对云南杜鹃建立了高效再生体系，为云南杜鹃的基因工程育种工作提供了良好的理论基础和实验依据，同时将有效推动杜鹃花生物技术育种进程。
文档编号A01H4/00GK102919125SQ20121045010
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者彭绿春, 解玮佳, 张艺萍, 瞿素萍, 李世峰, 苏艳, 宋杰 申请人:云南省农业科学院花卉研究所