粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂的制备方法

文档序号:243223阅读:244来源:国知局
专利名称:粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物杀线虫剂的制备方法,特别是淡紫拟青霉生物杀线虫剂的制备方法,属于淡紫拟青霉生物杀线虫剂制备领域。
背景技术
在引起植物侵染性病害的四大病原中,植物寄生线虫的危害超过细菌和病毒,仅次于真菌病害。植物寄生线虫每年造成世界农业生产的损失约1000亿美元,其中根结线虫(Meloidogyne spp.)是危害最大的一类植物寄生线虫,每年仅对世界上重要的经济作 物造成的经济损失就高达数百亿美元。在根结线虫属(Meloidogyne)内,以南方根结线虫(M. incognita)、花生根结线虫(M. arenaria)、爪睡根结线虫(M. javanica)和北方根结线虫(M. hapla)四个种的根结线虫病害发生最为普遍,对大多数的粮食作物、油料作物、纤维作物、烟草、茶叶、果树、蔬菜、药材和花卉等均可造成严重损失。在控制该类病害的方法中,由于根结线虫通常存活于土壤中和植物根内,所以一般化学农药难以控制其危害,剧毒农药又对农产品生产的安全性构成严重威胁,而化学杀线虫剂只能在短期内控制线虫数量,同时还存在成本高、持效短和抗药性等问题。此外,一些传统的防治方法,如轮作、种植抗病品种等虽可起到一定的防治作用,但在实际生产中能够轮作的作物并不多,对根结线虫具有抗性的作物品种十分有限。因此,传统控制方法并不能解决该类病害。杀线虫生物农药由于其安全和高效而逐渐引起关注,具有非常广阔的应用价值和市场前景。其中,淡紫拟青霉(P. Iilacinus)是目前防治植物寄生线虫的最有前途的天敌真菌之一,具有广泛的研究和开发价值。淡紫拟青霉属真菌门半知菌纲丛梗孢目,可寄生许多植物病原线虫的卵及雌虫,包括危害最为严重的根结线虫(Meloidogyne spp.)和胞囊线虫(Heterodera spp.),国际马铃薯中心昆虫系Jatala博士 1979年首次报道,淡紫拟青霉对南方根结线虫的卵寄生率高达60%-70%。淡紫拟青霉菌株可在作物根际定殖,抵抗根际有害线虫侵染,对作物根际土壤微生物菌群产生一定影响,利于植物生长发育。虽然淡紫拟青霉的培养方法已经有较多研究,如中国专利CN101845398A中公开了一种淡紫拟青霉的培养方法,中国专利CN102286421A中公开了一种淡紫拟青霉的液体发酵培养方法,中国专利CN101671210A中公开了一种淡紫拟青霉生物肥药的制备方法,CN101165016A中公开了一种防治线虫危害的生物有机肥制备方法,CN1756482A中公开了一种粒状杀线虫剂的制造方法。但这些方法限于少量生产制备,规模化生产则受到限制。

发明内容
本发明为克服现有技术的不足,通过对淡紫拟青霉生物杀线虫剂制备方法中各种工艺条件的选择,提供一种可大规模生产淡紫拟青霉生物杀线虫剂的方法,获得的淡紫拟青霉生物杀线虫剂的袍子产量高、生产成本低。本发明通过如下技术方案实现
一种粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂的制备方法,其包括如下步骤准备菌株、制备菌种、第一次发酵、第二次发酵和造粒,其特征在于,所述制备菌种中采用的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgSO4, KC1、ZnSO4 · 7H20和蒸馏水;所述第一次发酵中的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgS04、KCl、ZnS04 · 7H20和蒸馏水;所述第二次发酵中的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnS04 · 7H20 和蒸馏水。如上所述制备方法,所述制备菌种中采用摇瓶培养,其摇瓶装量< 150ml/500ml瓶、摇床转速为150rpm、培养温度为29 30° C、时间为72h。如上所述制备方法,所述第一次发酵中的发酵罐的接种量为4%体积比,发酵罐的装罐系数为O. 6-0. 7、温度为27-29° C、搅拌速度为200-300rpm,发酵周期为45-54小时。如上所述制备方法,所述第二次发酵中的发酵罐的接种量为4%体积比,发酵罐的装罐系数为O. 6-0. 7、温度为27-29° C、搅拌速度为200-300rpm,发酵周期为42-50小时。
如上所述制备方法,所述制备菌种中的培养基的组成为蔗糖15g,酵母6. 12g,MgSO4 O. 5g,KCl O. 5g,ZnSO4 · 7H20 IOmg 和蒸馏水 1000ml。所述培养基的 pH 优选为 6. 5。如上所述制备方法,所述第一次发酵中的培养基的组成为蔗糖15g,酵母6. 12g,MgSO4 O. 5g,KCl O. 5g,ZnSO4 · 7H20 IOmg 和蒸馏水 1000ml。所述培养基的 pH 优选为 6. 5。如上所述制备方法,所述第二次发酵中的培养基就的组成为蔗糖15g,酵母
6.12g,MgSO4O. 5g,KCl O. 5g,ZnSO4 ·7Η20 IOmg 和蒸馏水 1000ml。所述培养基的 pH 优选为6. 5o本发明的有益效果本发明的方法每批次可获得杀线虫剂(微球制剂)250kg以上,每克微球制剂中有效成分含量> 107CFU/g制剂菌落数,微球制剂颗粒大小范围为4±lmm,千粒微球重量范围为10-15克,且生产成本低,可以大规模的生产粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂。
具体实施例方式根据本发明的制备方法,其中菌株为淡紫拟青霉菌株,是可以购买得到的,也可以通过以下方法培养得到采用马铃薯琼脂培养基(PDA),通过本领域技术人员已知的方法获得,所述培养中具体的参数选择如下菌株生长的温度范围为8-38° C,最佳为25-30° C ;菌株生长的pH为2-11,优选pH值为5-9。所述培养基的制备方法为马铃薯去皮后切成块,200g煮沸20min,纱布过滤后,向滤液中加葡萄糖20g,琼脂粉15g,用蒸馏水定容至1000ml,分装,高压蒸汽灭菌20分钟后备用。所述菌株可通过以下方法保存将上述获得的菌株采用普通试管PDA培养基块法,即切取生长在PDA培养基上生长良好的菌块放置在I毫升无菌离心管中,低温下(4° C)至少保存I年。根据本发明的制备方法,所述菌种的制备方法包括(I)菌种活化将低温保存的菌种转接至PDA培养基斜面上,28 30° C条件下培养3 4天,实现菌种的充分活化。活化培养后的菌种可接种摇瓶进行种子培养。(2)制备摇瓶菌种
采用液体培养基,其组成为蔗糖、酵母、MgS04、KCl、ZnS04 · 7H20和蒸馏水。所述培养基可以使用如下的配方蔗糖15g,酵母6. 12g,MgS04 O. 5g,KCl O. 5g,ZnSO4 ·7Η20 IOmg,蒸懼水 1000ml, pH=6. 5。摇瓶培养的参数如下摇瓶装量< 150ml/500ml瓶,摇床转速为150rpm,培养温度为29 30° C,时间为约72h。接种时采用培养基块直接接种摇瓶即可,具体而言,接入直径O. 5mm培养基块4块到一个摇瓶即可。所得的菌种在PDA培养基上颜色正常,镜检无其他杂菌孢子存在,无细菌菌脓等杂质,无酸性气味存在。
根据本发明的制备方法,所述第一次发酵(也称为种子罐发酵)具体为采用液体培养基,其组成为蔗糖、酵母、MgSO4, KC1、ZnSO4 · 7H20和蒸馏水。所述培养基具体可以采用以下配方蔗糖15g,酵母6. 12g,MgSO4 O. 5g,KCl O. 5g,ZnSO4 · 7H20IOmg,蒸懼水 1000ml, pH=6. 5。第一次发酵即种子罐发酵,其种子罐灭菌、接种量和接种温度具体为121° C灭菌30min,此时pH范围在6. O 6. 5 ;发酵液按一级种子罐装量的4%体积比接种,接种温度为30。C以下。发酵控制及发酵时间具体为装罐系数0.6-0.7,28±1° C,搅拌速度为200-300rpm,取样间隔时间为4小时;发酵时间为18-24小时。发酵周期45 54小时。所得种子液(即菌液)呈土黄色至深褐色,较为粘稠,孢子含量达到SXlOVml以上。根据本发明的制备方法,所述第二次发酵(也称为生产罐发酵)具体为采用液体培养基,其组成为蔗糖、酵母、MgSO4, KC1、ZnSO4 · 7H20和蒸馏水。所述培养基具体可以采用以下配方蔗糖15g,酵母6. 12g,MgSO4 O. 5g,KCl O. 5g,ZnSO4 · 7H20IOmg,蒸懼水 1000ml, pH=6. 5。第二次发酵即生产罐发酵,其生产罐灭菌、接种量和接种温度具体为培养液经121° C灭菌30min,接种量4%体积比,接种温度为30° C以下。发酵控制及发酵时间具体为装罐系数0.6-0.7,发酵温度28±1° C,搅拌速度为200-300rpm,不需调节pH值;取样间隔时间为3小时;发酵周期为42 50小时。所得菌液呈土黄色至深褐色,较为粘稠,发酵液中液生孢子含量在4X 108/ml以上,菌体干重在1.5%以上。根据本发明的制备方法,所述造粒具体为淡紫拟青霉菌在上述生产罐发酵完成后,在发酵罐中经过充分搅拌,分散菌丝以及孢子,制备成菌悬液备用。将已经充分溶解好的海藻酸钠溶液与罐内菌悬液按照1:1比例在搅拌罐中彻底搅拌混勻,随即加入无菌娃藻土,混合均勻成为矿土溶液。将该矿土溶液加入准备好的微球发生器内,液滴自小孔滴出,形成海藻酸钠微球。微球用无菌水冲洗,室温条件下阴干,干燥至微球制剂含水量降至2 %以下后包装使用。每克微球制剂中有效成分含量> 107CFU/g制剂菌落数,微球制剂颗粒大小范围为4± 1mm,千粒微球重量范围为10-15克。根据本发明的制备方法,所述制剂通过以下步骤包装、储存
采用塑料袋抽真空保存,本制剂在室温条件下存放6个月后,制剂有效成分仍然保持活力。本发明的有益效果本发明的方法每批次可获得杀线虫剂(微球制剂)250kg以上,优选在280-360kg,每克微球制剂中有效成分含量>107CFU/g制剂菌落数,微球制剂颗粒大小范围为4± Imm,千粒微球重量范围为10-15克,且生产成本低,可以大规模的生产粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂。下面结合实施例对本发明作进一步说明,但本发明的保护范围并不限于实施例。一、培养基及其配方I、马铃薯琼脂培养基(PDA)马铃薯去皮后切成块,200g煮沸20min,纱布过滤后,向滤液中加葡萄糖20g,琼脂 粉15g,用蒸馏水定容至1000ml,分装,高压蒸汽灭菌20分钟后备用。2、液体培养基鹿糖15g,酵母 6. 12g, MgSO4 O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H20 IOmg,蒸懼水 1000ml,pH=6. 5。二、菌株的培养和保存I、马铃薯琼脂培养基(PDA)马铃薯去皮后切成块,200g煮沸20min,纱布过滤后,向滤液中加葡萄糖20g,琼脂粉15g,用蒸馏水定容至1000ml,分装,高压蒸汽灭菌20分钟后备用。2、菌株培养该菌株生长的温度范围为8-38° C,最佳为25-30° C。该菌株在pH 2_11之间均可以生长,适宜pH值为5-9。(I)在上述马铃薯琼脂培养基中,菌株的具体培养条件为温度25° C,pH=6. 5,所得菌株编号为Al。(2)在上述马铃薯琼脂培养基中,菌株的具体培养条件为温度30° C,pH=7,所得菌株编号为A2。(3)在上述马铃薯琼脂培养基中,菌株的具体培养条件为温度28° C,pH=9,所得菌株编号为A3。3、菌种保存将上述获得的菌株采用普通试管PDA培养基块法(切取生长在PDA培养基上生长良好的菌块放置在I毫升无菌离心管中),低温下(4° C)保存。三、制备菌种I、活化菌种(I)将上述低温保存的菌株Al转接至PDA培养基斜面上,28°C条件下培养3天,可用于接种摇瓶进行种子培养(记为All)。(2)将上述低温保存的菌株Al转接至PDA培养基斜面上,28°C条件下培养4天,可用于接种摇瓶进行种子培养(记为A12)。(3)将上述低温保存的菌株Al转接至PDA培养基斜面上,30°C条件下培养3天,可用于接种摇瓶进行种子培养(记为A13)。(4)将上述低温保存的菌株A2转接至PDA培养基斜面上,28 °C条件下培养3天,可用于接种摇瓶进行种子培养(记为A21)。(5)将上述低温保存的菌株A2转接至PDA培养基斜面上,28 °C条件下培养4天,可用于接种摇瓶进行种子培养(记为A22)。(6)将上述低温保存的菌株A2转接至PDA培养基斜面上,30°C条件下培养3天,可用于接种摇瓶进行 种子培养(记为A23)。(7)将上述低温保存的菌株A3转接至PDA培养基斜面上,28 °C条件下培养3天,可用于接种摇瓶进行种子培养(记为A31)。(8)将上述低温保存的菌株A3转接至PDA培养基斜面上,28 °C条件下培养4天,可用于接种摇瓶进行种子培养(记为A32)。(9)将上述低温保存的菌株A3转接至PDA培养基斜面上,30°C条件下培养3天,可用于接种摇瓶进行种子培养(记为A33)。2、制备摇瓶菌种(I)摇瓶培养基液体培养基鹿糖15g,酵母 6. 12g, MgSO4 O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H2010mg,蒸懼水 1000ml, pH=6. 5。(2)摇瓶培养控制摇瓶装量彡150ml/500ml瓶,摇床转速为150rpm,培养温度29 30° C,时间为约72h。(3)接种采用培养基块直接接种摇瓶即可,由于该菌可以产生大量分生孢子,因此接入直径O. 5mm培养基块4块到一个摇瓶即可。(4)获得菌种以上获得的菌种在PDA培养基上颜色正常,镜检无其他杂菌孢子存在,无细菌菌脓等杂质,无酸性气味存在。四、第一次发酵(种子罐发酵)I、种子罐培养基液体培养基鹿糖15g,酵母 6. 12g, MgSO4 O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H2010mg,蒸懼水 1000ml, pH=6. 5。2、种子罐灭菌、接种量和接种温度121° C灭菌30min,此时pH范围在6. O 6. 5。发酵液按一级种子罐装量的4%体积比接种,接种温度为30° C以下。3、发酵控制及发酵时间装罐系数0.6-0.7,28±1° C,搅拌速度为200_300rpm,取样间隔时间为4小时。发酵时间为18-24小时。发酵周期45 54小时。4、获得种子液获得的种子液(即菌液)呈土黄色至深褐色,较为粘稠,孢子含量达到8XlOVml以上。五、第二次发酵(生产罐发酵)I、生产罐培养基
液体培养基鹿糖15g,酵母 6. 12g, MgSO4 O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H2010mg,蒸懼水 1000ml, pH=6. 5。2、生产罐灭菌、接种量和接种温度培养液经121° C灭菌30min,接种量4%体积比,接种温度为30° C以下。3、发酵控制及发酵时间装罐系数O. 6-0. 7,温度28 ±1° C,搅拌速度为200 300rpm,不需调节pH值。取样间隔时间为3小时,发酵周期为42 50小时。
4、获得菌液获得的菌液呈土黄色至深褐色,较为粘稠,发酵液中液生孢子含量在4X 108/ml以上,菌体干重在1.5%以上。六、制剂及储存I、发酵液的后处理经生产罐发酵后的淡紫拟青霉菌在发酵罐中经过充分搅拌,分散菌丝以及孢子,制备成菌悬液备用。2、混合物料将已经充分溶解好的海藻酸钠溶液与罐内菌悬液按照I :1比例在搅拌罐中彻底搅拌混勻,随即加入无菌娃藻土,混合均勻成为矿土溶液。将该矿土溶液加入准备好的微球发生器内,液滴自小孔滴出,形成海藻酸钠微球。3、制备成品微球用无菌水冲洗,室温条件下阴干,干燥至微球制剂含水量降至2%以下后包装使用。4、成品的质量所得微球中,每克微球制剂中有效成分含量> 107CFU/g制剂菌落数,微球制剂颗粒大小范围为4± 1mm,千粒微球重量范围为10-15克。5、产品的储存采用塑料袋抽真空保存,本制剂在室温条件下存放6个月后,制剂有效成分仍然保持活力。具体的操作参数及产品参数见表I。表I操作参数及产品参数
权利要求
1.一种粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂的制备方法,其包括如下步骤准备菌株、制备菌种、第一次发酵、第二次发酵和造粒,其特征在于,所述制备菌种中采用的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgSO4, KC1、ZnSO4 · 7H20和蒸馏水;所述第一次发酵中的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgS04、KCl、ZnS04 · 7H20和蒸馏水;所述第二次发酵中的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnS04 · 7H20 和蒸馏水。
2.如权利要求I所述制备方法,所述制备菌种中采用摇瓶培养,其摇瓶装量(150ml/500ml瓶、摇床转速为150rpm、培养温度为29 30°C、时间为72h。
3.如权利要求I或2所述制备方法,所述第一次发酵中的发酵罐的接种量为4%体积t匕,发酵罐的装罐系数为O. 6-0. 7、温度为27-29° C、搅拌速度为200_300rpm,发酵周期为45-54小时。
4.如权利要求I至3之一所述制备方法,所述第二次发酵中的发酵罐的接种量为4%体积比,发酵罐的装罐系数为O. 6-0. 7、温度为27-29° C、搅拌速度为200_300rpm,发酵周期为42-50小时。
5.如权利要求I至4之一所述制备方法,所述制备菌种中的培养基的组成为蔗糖15g,酵母 6. 12g, MgSO4 O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H20 IOmg 和蒸馏水 1000ml ;pH=6. 5。
6.如权利要求I至5之一所述制备方法,所述第一次发酵中的培养基的组成为蔗糖15g,酵母 6. 12g, MgSO4O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H20 IOmg 和蒸馏水 1000ml ;pH=6. 5。
7.如权利要求I至6之一所述制备方法,所述第二次发酵中的培养基的组成为蔗糖15g,酵母 6. 12g, MgSO4O. 5g, KCl O. 5g, ZnSO4 · 7H20 IOmg 和蒸馏水 1000ml ;pH=6. 5。
全文摘要
本发明提供一种粒状淡紫拟青霉生物杀线虫剂的制备方法,其包括如下步骤准备菌株、制备菌种、第一次发酵、第二次发酵和造粒,所述方法中采用的培养基的组成为蔗糖、酵母、MgSO4、KCl、ZnSO4·7H2O和蒸馏水。通过对淡紫拟青霉生物杀线虫剂制备方法中各种工艺条件的选择,提供一种可大规模生产淡紫拟青霉生物杀线虫剂的方法,获得的淡紫拟青霉生物杀线虫剂的袍子产量高、生产成本低。
文档编号A01N63/04GK102960369SQ20121048011
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者梁洪柱, 田会鹏, 陈倩, 李学燕 申请人:北京市西山试验林场
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