专利名称：一种蛹虫草子实体液态培养培养基及其培养方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌子实体培殖方法，更加具体的说涉及一种蛹虫草液态培养的培养基及其培养方法。
背景技术：
蛹虫草(Cordyceps militaris)与冬虫夏草同属虫草属(Cordyceps),亲缘关系十分接近。蛹虫草始载于《新华本草纲要》，其“味甘、性平”，有“益肺肾、补精髓、止血化痰”之功效。蛹虫草富含虫草素、腺苷、多糖、超氧化物歧化酶(S0D)、虫草酸、氨基酸等活性成分，以及硒、锌、铁等矿物质元素。大量的药理及临床试验证明，蛹虫草的功效成分和药理作用接近或超过冬虫夏草，可作为冬虫夏草的替代品，具有较大的开发利用价值。·
蛹虫草又名北冬虫夏草、北虫草等,分类学上属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、核菌纲(Pyrenomycetes)、球壳菌目(Sphaeriales)、麦角菌科(Claviciptiaceae)、虫草属(Cordyceps)，与冬虫夏草为同属。它是由蛹虫草菌的菌丝体通过各种方式浸染鳞翅目等昆虫，以昆虫体内的营养物质为营养基础，生长成子座(子实体)，子座单生或丛生，橙黄色，长2-5cm。相对来说,蛹虫草的生长环境远没有冬虫夏草那样狭窄,主产于云南、吉林、辽宁、内蒙古等省区，寄生于针叶林地、阔叶林或混交林地表土层中的鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫幼虫或蛹体上。蛹虫草的天然资源非常有限，规模化利用困难。随着科学技术的进步，经科研人员的攻关，人工培育蛹虫草已获成功，目前主要有以下3种培养方法一是以终产物虫草菌丝体为目的，将蛹虫草液体菌种，接种到麦麸、稻糠等固体培养基上，经发酵后获得蛹虫草菌丝体；二是以虫草子实体为目的，将蛹虫草菌种接种到大米等固体培养基上，在一定的环境适宜条件下，培养可得蛹虫草子实体(又名虫草花)；三是以虫菌复合体为目的，将蛹虫草菌种接种在活体柞蚕、家蚕幼虫或蛹体内，适宜的环境条件下，培养可获得虫菌复合体-蚕蛹虫草。
发明内容
为解决蛹虫草子实体培养中原料价格过高、培养基灭菌难度大等问题，本发明提供了一种蛹虫草子实体的生产方法，用液态的碳源和氮源替代在蛹虫草发菌和培养阶段采用的固态培养基，蛹虫草子实体的子座固定在无机培养介质上，具体的发明内容为—种蛹虫草子实体液态培养培养基，所述培养基由固体无机培养介质和液态营养液组成。所述无机培养介质为粒度分布维度值介于I. 2-3. 5之间的无机多孔材料。所述无机培养介质为浮石、煤渣、矿渣中的一种。所述无机培养介质在培养基中的铺垫厚度为3cm ;所述无机培养介质为颗粒状，颗粒直径为I-IOmm之间。所述发菌培养液和出草培养液两部分组成；其中，每30CmX30Cm面积的发菌培养液的配方为麦芽糖IOOg,酵母膏20g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁2g, VB1IOmg,水lOOOmL，pH6.5 ；每30CmX30Cm面积的出草培养液为蔗糖250g，酵母膏30g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁 O. 8g, VB1IOmg,水 IOOOmL, ρΗ7· 5。一种蛹虫草子实体液态培养方法，包括以下步骤I)将蛹虫草菌株从PDA培养基直接接种到权利要求4所述的发菌培养液中，置于发酵罐发酵，至发菌培养液产生菌丝；2)将步骤I)所述产生菌丝的发菌培养液直接注入到权利要求3所述的无机培养介质中；3)在洁净度优于10级的条件下进行发菌阶段培养，培养为25±2°C，湿度为80-95%，暗室培养至菌丝长满无机培养介质；
4)完成发菌阶段培养后继续出草阶段的培养，培养为18±2°C，湿度为75-85%，光照12小时强度1000-50001uX，暗室12小时，培养至无机培养介质中物流动水时，加入权利要求4所述的出草培养液；5)继续出草阶段的培养得到蛹虫草子实体。所述发菌培养时间为7-10天，所述出草阶段的培养时间为25-30天。本发明的有益技术效果是本发明的提供的蛹虫草子实体液态培养培养基及其培养方法，其解决了传统培养基需要菌盒整体灭菌的问题，培养基的活性成分利用度高，培养基残留物经过烁烧灭菌后可以继续使用。
具体实施例方式实施例I培养基碳源的考察发菌培养液配方碳源I，酵母膏20g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁2g，VB11OmgjjC lOOOmL，pH6 ;试验中更换相应碳源；出草培养液配方基础配方碳源II，酵母膏30g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁0. Sg,VBlIOmgjjC lOOOmL，pH7. 5 ;试验中添加相应小分子碳源。将试验菌种接入PDA培养基中，置于20°C恒温生化培养箱中培养7-10d，菌丝长满斜面备用以上述发菌培养液配方为基础，分别加入等含碳量的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖及可溶性淀粉，制作液体培养基，观察菌丝生长状况。将液体培养基装入300mL三角瓶中，每瓶装入120mL，在0. 15MPa湿热高压蒸汽下灭菌30min，冷却后接人蛹虫草菌种，20°C下转速120rpm摇床震荡培养。空白对照，每批次20个重复，观察菌丝生长状况。终止发酵后，用冷冻离心机8000rpm，离心lOmin，55°C下烘干至恒重，10个重复，计算IOOmL中菌丝干重。其中菌丝生长速率测定采用试管斜面测定法。即在上述液体培养基中添加18g琼脂，制作试管斜面。接人蛹虫草菌种后，测定菌种萌发后菌丝体在试管斜面上的生长速度。栽培培养基制作以发菌培养液配方为基础，分别添加等含碳量的葡萄糖或蔗糖，观察发菌及出草情况。培养基装入300mL罐头瓶后，在0. 15MPa湿热高压蒸汽下灭菌lh，冷却后接人液体菌种中长势最优液体菌种，每批次30个重复。接种固体无机培养介质和发菌培养液的培养基中，应在超净工作台中进行，培养室的洁净度要求优于10万级。接种完毕，将培养瓶移人25°C左右恒温培养室中进行发菌管理，湿度为80-95%，避光培养，其间注意通风，约4天后菌丝长满瓶。菌丝长满瓶后，给予散射光照射，进行转色管理，一定昼夜温差刺激虫草原基分化形成。在虫草子座表面形成子囊壳时及时采收。不同碳源对液体菌种菌丝生长状况直接决定着菌种的优劣，对菌种接种后的发菌及出草情况有着重要影响。表I不同碳源对发酵罐液体菌种菌丝生长状态的影响
权利要求
1.一种蛹虫草子实体液态培养培养基，其特征在于所述培养基由固体无机培养介质和液态营养液组成。
2.根据权利要求I所述的蛹虫草子实体液态培养培养基，其特征在于所述无机培养介质为粒度分布维度值介于I. 2-3. 5之间的无机多孔材料。
3.根据权利要求2所述的蛹虫草子实体液态培养培养基，其特征在于所述无机培养介质为浮石、煤洛、矿洛中的一种。
4.根据权利要求3所述的蛹虫草子实体液态培养培养基，其特征在于所述无机培养介质在培养基中的铺垫厚度为3cm。
5.根据权利要求I所述的蛹虫草子实体液态培养培养基，其特征在于所述发菌培养液和出草培养液两部分组成；其中，每30cmX30cm面积的发菌培养液的配方为麦芽糖100g，酵母膏20 g,葡萄糖20 g,磷酸二氢钾2 g,硫酸镁2 g, VB1 10 mg,水IOOOmL, pH6. 5 ; 每30cmX 30cm面积的出草培养液为蔗糖250 g，酵母膏30 g，磷酸二氢钾I g，硫酸镁 O. 8g, VB1 10 mg，水 1000 mL, ρΗ7· 5。
6.一种蛹虫草子实体液态培养方法，其特征在于包括以下步骤 1)将蛹虫草菌株从PDA培养基直接接种到权利要求4所述的发菌培养液中，置于发酵罐发酵，至发菌培养液产生菌丝； 2)将步骤I)所述产生菌丝的发菌培养液直接注入到权利要求3所述的无机培养介质中； 3)在洁净度优于10级的条件下进行发菌阶段培养，培养温度为25±2°C，湿度为80-95%，暗室培养至菌丝长满无机培养介质； 4)完成发菌阶段培养后继续出草阶段的培养，培养温度为18±2°C，湿度为75-85%，光照12小时强度1000-50001uX，暗室12小时，培养至无机培养介质中物流动水时，加入权利要求4所述的出草培养液； 5)继续出草阶段的培养得到蛹虫草子实体。
7.根据权利要求5所述的蛹虫草子实体液态培养方法,其特征在于所述发菌培养时间为7-10天，所述出草阶段的培养时间为25-30天。
全文摘要
本发明的提供的蛹虫草子实体液态培养培养基及其培养方法，所述培养基由固体无机培养介质和液态营养液组成,其解决了传统培养基需要菌盒整体灭菌的问题，培养基的活性成分利用度高，培养基残留物经过烁烧灭菌后可以继续使用。
文档编号C05G3/00GK102942422SQ20121053668
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者陈均, 龙新, 刘飞 申请人:重庆慈恩生物科技有限公司