高效有机肥料及其组分的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种肥料，其包含至少一种选自由绿色木霉(NRRL?B-50520)、短尾帚霉(NRRL?B-50521)、短尾帚霉(NRRL?B-50522)及其组合组成的组的微生物；和由所述至少一种微生物施加作用以释放氮的底物。本发明还涉及一种肥料，其包含至少一种选自角蛋白降解微生物的微生物和由所述至少一种微生物施加作用以释放氮的角蛋白底物。本发明还涉及一种使用所述肥料来增强植物生长的方法，以及制造肥料的方法。本发明还涉及一种分离的绿色木霉菌株(NRRL?B-50520)和两种分离的短尾帚霉菌株(NRRL?B-50521，NRRL?B-50522)。
【专利说明】高效有机肥料及其组分
[0001] 本申请要求2011年11月23日提交的美国临时专利申请序列号61/563, 355的权 益，该申请在此通过引用整体并入。
[0002] 本申请的主题在来自美国国家科学基金会的批准号0945724的支持下做出。政府 对本发明具有一定的权利。 发明领域
[0003] 本发明涉及高效有机肥料及其组分。
[0004] 发明背景
[0005] 用于草坪和其它用途的肥料往往由提供氮、磷和钾的盐的无机混合物组成。用于 不同用途的肥料可能是液体或固体，并且含有广泛范围的氮：磷：钾（"N :P :K")，以及根据 产品预定用途的其它植物营养物。通常，肥料制品主要由无机化合物的盐组成，所以不适合 于有机状态。
[0006] 许多传统的肥料制品功能非常完善。然而，由于这些肥料释放高水平的硝酸盐进 入地下水而导致污染水，所以这些肥料制品越来越受到关注。一种肥料制品具有32:2:8 (% Ν:Ρ20:Κ205)的配方。对于此包装的分析表明，在这32%中，3. 8%是铵化合物，53%是尿素， 39%是水溶性的Ν，并且3. 8%是其它Ν。如果这些化合物没有被植物吸收，硝酸盐和尿素 可立即用于渗透到地下水。不幸的是，植物通常只使用约33%的所施用总氮肥（Arnall 等，"Relationship Between Nitrogen Use Efficiency and Response Index in Winter Wheat, "J. Plant Nutr. 32:502-515(2009))，而其余部分可被代谢为氮氧化物，这些氮氧化 物是强效的温室气体，或以硝酸盐和亚硝酸盐形式浸入土壤和地表水，在那里它们可能有 毒的（饮用水的EPA极限分别是lOppm和lppm)，并且在那里它们可能会产生藻类和其它微 生物的腐烂产生厌氧区的区域，在这些区域中植物、鱼和其它栖住动物无法生存。需要不具 有这些不利环境影响的肥料。
[0007] 由于监管机构对于水体富营养化的关注，用于草坪用途的肥料正在被改进。出于 这个原因，含磷的草坪肥料被一些地方禁止。硝酸盐是至少与磷一样严重的污染物，并且许 多地方，如长岛，打算限制这个来源的水污染。问题的严重性可从以下有关切萨皮克湾的 弓I文来说明（Dewar 等，"Urban Fertilizers and the Chesapeake Bay:An Opportunity for Major Pollution Reduction, Executive Summary, Environment Maryland, Research and Policy Center(2011))：
[0008] 超过26年，在切萨皮克湾地区的各州都试图清理海湾，但它仍然因极其有害的过 量污染而堵塞。为了实现清洁、可持续的海湾，在海湾流域的各州必须将海湾水域的氮水平 再降低30%并且将磷再降低8% -尽管到2030年预计人口增长30%。如此规模的减少只 有政府把流域的所有营养物污染来源作为目标时才是可能的。
[0009] 过量的氮和磷，以及沉淀物，是海湾和流入其的水域的水质经常较差的主要原因。 约30 %的海湾的磷负荷来自于城市和郊区径流。那些相同已开发土地占氮污染的径流的 10%。然而，减少来自已开发土地的营养物径流的措施还远远不够。
[0010] 虽然马里兰州的监管机构在要求农民控制来自各自田地的负载营养物的径流方 面做得更好，但是该州主要忽视了该流域的主要作物：草。纵观海湾流域，近380万英亩为 现在种植草坪草，并且随着住宅开发扩展并取代农田，种植面积也在增长。草坪草是迄今为 止马里兰州的最大的作物，全州栽草多达130万英亩。与此相比，2009年马里兰州所有其它 作物种植面积是150万英亩。然而，它是该州的主要作物中监管程度最小的作物。
[0011] 当草坪草覆盖着太多的含有氮和磷的肥料时，草坪草变成污染问题。肥料中的营 养物可以帮助维持健康的草坪，但是当过量时，它们会在下雨或下雪时冲到附近水体中。过 量的肥料营养物也可以直接渗入地下水。无论肥料是有机的或化学的，其营养物都会损害 海湾和当地水道。
[0012] 跟踪已开发土地上的肥料使用是如此不被重视以致于该州未对它进行统计，但马 里兰州农业部的记录显示"非农使用"肥料销售正在迅速赶上农场肥料销售。最好的估计 表明，马里兰州的土地所有者每年在该州的草坪上施用至少8600万磅氮肥。
[0013] 这种肥料进入河流和海湾。在巴尔的摩市郊的一个流域，研究人员发现一个当地 河流中的营养物的56%来自草坪肥料。得克萨斯州、威斯康星州、明尼苏达州、康涅狄格州 和加拿大的科学家们还证实，草坪肥料中的污染物可以显著危害地表水质量。
[0014] 同上 1-2。
[0015] 长岛的数项条例要求"因为[镇区]的儿童和公民的健康、他们的水、环境和长岛 海峡将会从减少使用化学肥料和草坪农药中获得好处，所以委员会敦促所有公民自愿避免 使用化学肥料和草坪农药，并敦促使用有机草坪护理"。杀虫剂/除草剂典型市政条例及规 章，康涅狄格州河联盟。存在对于具有较低污染水可能性的有机草坪肥料的需要和潜在市 场。例如上述规章并未要求只能使用有机肥料，主要是因为不存在具有足够性能的无污染、 有机和成本效益好的产品。
[0016] 主要使用的合成肥料在提供优质草坪中非常有效，但它们破坏环境。不幸的是，正 如上文指出的，有机肥料本身不是灵丹妙药。它们还可能会污染水域，因为它们仍然需要等 量的氮来提供旺盛、繁茂的草坪。通常，目前的有机肥具有严重的缺点。这些缺点包括不能 在施用后不久提供足够茂盛生长的草坪，它们通常只含有7至9%的任何形式的N。这意味 着，由于使用功效取决于使用剂量，因此除非使用高的比率，否则它们不能为繁茂的绿色草 坪提供足量的N。此外，为了获得足够的性能，它们必须以2-6倍的Sc〇ttSR施用率来施用。 因此，重约37磅的一袋Scotts"',肥料将施肥于15, 〇〇〇平方英尺，并持续1-2个月（该公司 提倡每个生长季节施用四次）；使用低N有机肥料的等效结果将需要约3袋以提供相同的 N量。这些因素使得传统的有机肥料不方便使用，当30-35磅的标准合成肥料已足够时，顾 客通常不希望携带并撒施100-125磅肥料。
[0017] 需要施用这么多量的事实使得传统的有机肥料不经济。即使一袋25磅的有机肥 料比无机肥料价格稍微低一些，超过100磅的总价格也会高得多。商业无机肥料通常零售 价为约55美元一袋，而大多数有机肥料中的相同量的N将花费超过100美元。
[0018] 本发明旨在克服本领域中的这些和其它缺陷，并为传统肥料的许多问题提供答案 同时为将满足用户的需求并且限制环境问题的新的和独特的产品提供几个不同的路径。
[0019] 发明概述
[0020] 本发明涉及一种肥料，其包括至少一种选自由以下各项组成的组的微生物：绿色 木霉（Trichoderma viride)(NRRL B-50520)、短尾帚霉（Scopulariopsis brevicaulis) (NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其组合。肥料还包括由至少一种微生物施加 作用以释放氮的底物。
[0021] 本发明的另一个方面涉及增强植物生长的方法。该方法包括提供一种肥料，其包 含至少一种选自由以下各项组成的组的微生物：绿色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其组合；和由至少一种微生物施加作用以释放氮的 底物。该方法进一步包括在与不施用肥料的植物或植物种子相比可有效地提高植物或植物 种子的生长的条件下使所述肥料与植物或植物种子接触。
[0022] 本发明还涉及一种肥料，其包含至少一种选自角蛋白降解微生物的微生物和由至 少一种微生物施加作用以释放氮的角蛋白底物。
[0023] 本发明的另一个方面涉及一种制造包含氨基酸和氨的肥料的方法。该方法包括提 供至少一种选自由以下各项组成的组的微生物：绿色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其组合并且提供由至少一种微生物施加作用以释放 氮的底物。该方法进一步包括在有效地使得所述至少一种微生物对底物施加作用并且产生 包含氨基酸和氨的液体悬浮液的条件下使所述至少一种微生物与底物接触。
[0024] 本发明还涉及分离的绿色木霉菌株，其在编号NRRL B-50520下保藏于农业研究服 务培养物保藏中心（Agricultural Research Service Culture Collection)。
[0025] 本发明的另一个方面涉及分离的短尾帚霉菌株，其在编号NRRL B-50521下保藏于 农业研究服务培养物保藏中心。
[0026] 本发明的另一个方面涉及分离的短尾帚霉菌株，其在编号NRRL B-50522下保藏于 农业研究服务培养物保藏中心。
[0027] 本发明涉及开发可用于多种用途并且可以使来自硝酸盐的地下水污染减至最低 或消除的高效有机肥料。它包括鉴定缓释氮形式及其使用方法。它还包括微生物剂，这些 微生物剂可以降解氮的复杂形式，特别是从农业废弃产物产生的蛋白质，并且将植物可利 用的氮释放于土壤中或发酵器中。它描述了使用增强了本文所述的肥料的活性并且也提高 了植物生长和性能的作为内生植物共生体的微生物。所述肥料是递送这些生物体的有效方 法。
[0028] 为用户可接受的并且无污染的肥料有几个要求。首先，需要植物能够藉以更有效 地吸收N肥的普遍可适用的机制。实现此举的一种方法是通过使用增加植物更有效地使用 氮肥（"氮利用效率"或"NUE"）的能力的内生植物共生真菌或细菌。NUE可以通过增加植 物根系生长和通过植物中的生理变化来诱导。许多微生物可潜在地用于这方面。例如，这些 微生物包括被命名为植物根际促生菌（"PGPR"）的细菌、担子菌纲（Basidiomycete)印度梨 形孢（Piriformospora indica)，和菌根真菌，如球囊霉（Glomus)属中的那些真菌。其它实 例包括哈茨木霉（T. harzianum)菌株RR17Bc (ATCC登记PTA9708)、哈茨木霉FllBab (ATCC 登记 PTA9709)、深绿木霉（T. atroviride)菌株 WW10TC4(ATCC PTA 登记 9707)、和绿木霉 (T. virens)菌株41 (ATCC登记20476))。这些相同的真菌还诱导植物的许多其它有益的变 化如抗病性、耐非生物胁迫如干旱和盐，和增加植物进行光合作用的能力，从而为植物提供 了其它益处。
[0029] 对于草坪，本发明提供了功能上相当于分析为30:2:8(N:P20 5:K20)的广泛销售的 无机草坪肥料的分析为12-16:0-10:5-15的有机肥料。还描述了产生适合于在标准落下或 撒播肥料撒施机中分散的颗粒肥料的原型过程，所述肥料包含在本发明中要求保护的生物 体。还描述了用于制备可掺入盆栽介质中、施用于犁沟等的粉末制剂的方法，并且还描述了 液体有机肥料的制备过程。结果是新的肥料，其可被分类为有机的。
[0030] 可以通过肥料的组分来提供的另一个有用的特性是营养物的缓慢释放。仅仅由可 溶性盐组成的肥料迅速地释放它们的营养物并使营养物被冲洗至地下水中，它们迅速成为 污染物。如本文所述，微生物，特别是所选择的木霉属（Trichoderma)菌株，可以显著地促 进植物生长、提高耐非生物胁迫、增加植物氮利用效率、增加根系的生长和发育，并且显著 地增强一般植物性能。把此类有益的微生物直接掺入肥料上或肥料中是非常有利的，这样 使得肥料及有益微生物的益处可以同时并且在同一制品中方便地施用。然而，大多数合成 肥料的高含盐量将严重损害或杀死包含在肥料内或肥料上的所施用的微生物。本发明描 述了肥料和制备主要由对微生物剂无害的蛋白质组成的肥料颗粒的方法。如果肥料被过量 施用，如果雨水或灌溉水过多，或当肥料被施用到沙质并且使营养物浸出的土壤时，特别可 能发生污染。因为不能预见在哪里施加肥料或如何施加肥料，氮可以呈缓慢释放形式，使植 物能够随着所施用的营养物的缓慢释放而吸收更多的营养物，而不是马上吸收。存在两个 基本的处理方法。首先，行业中的标准过程是产生呈各种形式的氮，其缓慢地释放氮。当今 在商业贸易中有许多缓慢释放的氮形式。这些形式包括脲醛、亚甲基脲、涂硫尿素 （sulfur coated urea)以及其它。这些在本领域中是众所周知的，参见例如King等的美国专利 8, 182, 572,其在此通过引用整体并入。其次，有各种复杂的形式的氮，通常呈蛋白质、粪肥 或堆肥的形式。由于微生物活动，这些材料缓慢地释放自身的氮。
[0031] "有机"材料可以被认证，并且与它们有关的条例依机构而定。有机材料研究所 ("0MRI"）根据自己的规范来认证产品。0MRI是具有完善认证的私人机构。许多但不是 所有的农业废弃产物，如堆肥、粪肥等，可被认证，但是它们的制造要求比较严格。可以使用 一些定义明确的化学品，但是它们的用途受到严格管制。例如，只有当硝酸钠是开采的形式 (称为智利硝酸盐），而不是制造的型式时，它才是可以接受的，并且即使对于这样的材料， 其用途也是有限的。另外，近有机认证是USDA BioPreferred产品清单。具有此名称的产 品须在总量的一定百分比下来源于生物基农产品。肥料的农场来源的产品的最低含量为 71%。这可以包括0MRI列出的许多相同材料，但也有例夕卜。例如，泥炭苔有资格获0MRI认 证，而未由BioPreferred计划认证。来自农场动物和植物的堆肥、粪肥、蛋白质来源对于这 两者都是可以接受的。一个显著的区别是，0MRI注册的产品必须100%是其认证的产品，但 对于BioPreferred,高达29%可能是BioPreferred清单上以外的产品。因此，一些合成的 缓慢释放的合成氮形式可用于BioPreferred产品，但不可用于0MRI标记产品。
[0032] 本发明描述有效地降解羽毛/羽毛粉中的角蛋白的微生物（即真菌）。这些微生 物将羽毛粉中的氨基酸和氨迅速释放至半固体介质中。例如，真菌的接种物具有许多用途 并且可以被制备为干孢子制剂或液体制剂。本发明还描述了用于产生能够被撒播的颗粒剂 的方法，所述颗粒剂含有或不含微生物的涂层，或含有或不含掺入颗粒剂内的微生物，其为 植物生长提供氮的缓慢释放微生物活化的释放，尤其是在与其它有益真菌组合时。微生物 活化的氮系统的结合几乎未将硝酸盐释放至土壤中，因此，将有很少或没有硝酸盐释放至 地下水中。如果微生物释放N与可提高根系生长并且改善植物氮利用效率的其它微生物结 合，那么此环境优势会更大。此外，同样的发明，加以细微的修改，可以被用来产生用作植物 肥料是非常有益的水溶性源或氨基酸和氨。
[0033] 本发明通过提供一个或多个系统满足了由传统肥料产生的需求，所述系统包含与 微生物组合具有特定组成和功能的肥料，所述微生物将复杂的蛋白质底物降解以提供营养 物，尤其是供植物生长的营养物。它还包括增强植物的生长和性能并为植物生长提供其它 优势的微生物（例如，内生植物共生体）。本发明的肥料是用于这些生物体的极好的递送 剂。
[0034] 本发明预计为肥料行业提供革命性的益处。首先，本发明的肥料第一次提供完全 有机或生物优先肥料，其与标准的广泛销售的无机肥料表现一样良好。它也可作为与常规 无机肥料一样便利并且易于使用的肥料，并且用作极大地减少地下水和地表水的硝酸盐污 染的草坪肥料。本发明的肥料还提供了一种产生一类新的有机水溶性肥料的方法，所述 肥料包含立即可以氨基酸和氨形式为植物生长所利用的氮。包含立即可用氮的可为有机 (0MRI认证）种植者所利用的唯一产品是智利硝酸盐，并且它的使用由0MRI规则来限制， 不久的将来可能禁止它用于有机用途。氨基酸与氨的混合物将是非常有用的新产品，既可 以用于其它肥料的成分，也可以作为液体独立肥料。本发明第一次描述产生氨基酸与氨的 0MRI可注册混合物的方法和这类产品的组成。重点是草坪肥料，它可能是要求最苛刻的材 料，并且也许是以最大量使用的材料，但原则和开发同样适用于其它应用的肥料。具有这些 功能的广品目如并不存在。
[0035] 附图简述
[0036] 图1示出了加湿两天前后使用涂覆有羽毛降解微生物的羽毛粉-明胶混合物制备 的干燥颗粒。涂覆于颗粒外侧上的真菌适度生长。将颗粒通过加入介质来改进，所述介质 支持木霉属迅速并且大量地生长。干燥的颗粒的直径大约为2mm。
[0037] 图2A-2B示出了使用本发明中所述或市售获得的制剂的肥料比较。在图2A中，所 使用的处理为PT (有机肥料，NRRL B-50521，和K1-K4,其包括哈茨木霉菌株RR17Bc(ATCC 登记 PTA9708)、哈茨木霉 FllBab(ATCC 登记 PTA9709)、深绿木霉菌株 WW10TC4(ATCC PTA 登记9707)、和绿木霉菌株41仏1'(1：登记20476))即8(8(；〇戊5'1<丁11什811丨丨(^1 :1<);?(具有 NRRL B-50521的有机肥料）；和C(未处理的对照）。在图2B中，所用的处理为PT(有机肥 料，NRRL Β-50521，和Κ1-Κ4,所述同上）；0FC(不含任何真菌的有机肥料颗粒）；和Ρ (具有 NRRL B-50521的有机肥料）。
[0038] 图3A-3D显不使用不同施肥处理的草在一段时间内的收获重量。
[0039] 图4显示了在砂：泥炭混合物中生长约6周并且用这个实例中所述的颗粒来施肥 的草皮的根发育，所述颗粒含有和不含有益微生物混合绿木霉菌株NRRL B-50521和木霉属 菌株Kl-K4(哈茨木霉菌株RR17Bc、哈茨木霉FllBab、深绿木霉菌株WW10TC4、和绿木霉菌株 41)。标记11的皮氏培养皿显示了用不带有益微生物的颗粒施肥的草坪上的根系生长。标 记12的培养皿含有以约10 5cfu/g掺入颗粒中的生物体，而标记13的培养皿用葡聚糖混合 物中涂有有益真菌的颗粒来施肥（2%木薯淀粉葡聚糖中的10 5菌落形成单位（cfu)/ml以 形成连续的薄涂层）。
[0040] 发明详述
[0041] 本发明涉及一种肥料，其包括至少一种选自由以下各项组成的组的微生物：绿色 木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其组合。肥 料还包括由至少一种微生物施加作用以释放氮的底物。
[0042] 本发明可使用由微生物施加作用以释放氮的各种底物来进行，所述底物包括毛 发、蹄和羽毛。在一个实施方案中，所述底物是选自由羽毛、羽毛粉和尿素的衍生物组成的 组的任何蛋白质。可以使用任何类型的羽毛，包括但不限于鸡羽毛、火鸡羽毛和鸭羽毛。本 发明适用于释放氮的所有底物材料的降解和利用。
[0043] 任何数目的生物体或有益微生物可以被添加到本发明的肥料。这些生物体包括 由 Harman 在 W0 2010/091337 中所描述的那些菌株；Harman, "Multifunctional Fungal Plant Symbionts:New Tools to Enhance Plant Growth and Productivity,，'New Phytol.189:647-49(2011) ;Lorito 等，"Translational Research on TrichodermaiFrom'Omics to the Field, ^Annu. Rev. Phytopathol. 48:395-417 (2010)； Shoresh 等,"Induced Systemic Resistance and Plant Responses to Fungal Biocontrol Agents, "Annu. Rev. Phytopathol. 48:21-43 (2010)，所述文献在此通过引用 整体并入。其它有益生物体包括菌根真菌、植物根际促生菌、固氮螺菌和固氮根瘤菌。这 些生物体具有非常多有用的特性。真菌改变基因表达并且使植物表现出对致病病原体的 抗性增加（"抗生物胁迫"），表现出增加的耐环境胁迫如耐干旱、盐或温度（"耐非生物胁 迫"），并且增加氮的摄取效率（"改良的氮利用效率['NUE']"）。本发明的有益微生物 和植物内生微生物可提供改进的氮利用效率。可配制或混合有益微生物以制备颗粒或液体 悬浮液。这些颗粒或液体悬浮液可以直接混合到土壤或盆栽混合物中。本说明书中的术语 土壤用于包括能够支持植物生长的任何介质，因此，包括常见土壤、腐殖质、粪肥，堆肥、砂 等，以及人工产生的植物生长介质。然后将制剂混合到土壤中或温室应用的种植混合物容 积中或田间土壤的上部容积中（Harman, G.E·，"The Dogmas and Myths of Biocontrol· Changes in Perceptions Based on Research with Trichoderma harzianum T-22, 'Tlant Dis. 84:377-393 (2000)，所述文献在此通过引用整体并入）。用于这类应用的设备和程序是 众所周知的，并且在各种农业行业中使用。在本发明的一个实施方案中，肥料进一步包含呈 木霉属物种形式的补充微生物。木霉属物种可以选自由绿木霉、哈次木霉、深绿木霉及其组 合组成的组。
[0044] 木霉属在根表皮和皮层中的细胞间生长，并诱导周围的植物细胞沉积细胞壁 材料并且产生酚类化合物。这种植物反应限制了根内的木霉属生长（参见Yedidia 等，''Induction and Accumulation of PR Proteins Activity During Early Stages of Root Colonization by the Mycoparasite Trichoderma harzianum Strain T-203, 'Tlant Physiol. Biochem. 38:863-873 (1999)，所述文献在此通过引用整体并入）。内生植物共 生体具有长得多的功效时间，因为它们具有与植物一起和在环境中生长的能力；因此， 如果条件有利于它们，它们可能几周或几个月内具有作用。这些生物体可能在植物根 部上或植物根部中形成并且至少历时一年生作物的一生，为植物提供益处（Harman，G. E. , "Myths and Dogmas of biocontrol. Changes in Perceptions Derived from Research on Trichoderma harzianum T-22,''Plant Dis. 84:377-393(2000)和 Harman 等，"Changing Paradigms on the Mode of Action and Uses of Trichoderma spp. for Biocontrol, "Outlooks Pest Manag. 19:24-29 (2008)，所述文献在此通过引用整体并入）。 在根皮层中的有益生物体的活菌丝的形成导致植物的化学通讯。在一些实施方案中，肥料 含有其它补充微生物，如选自由印度梨形孢、植物根际促生菌、菌根真菌及其组合组成的组 的那些微生物。
[0045] 因此，发生植物基因表达的重新编程，并给植物带来许多益处。根表面上的生长 或分生孢子萌发的这种能力使多种施用方法成为可能的。这些施用方法包括但不限于种 子处理、以穿透土壤容积的浸液施用至土壤或种植混合物以及在播种时的犁沟内施用、撒 播或喷雾施用到含有根部的土壤表面。它还允许使用非常少量的以种子处理施用的接种物 (10s g/公顷），但随后导致根系上的生物体的随后增殖，引起持续整个季节的效果，包括植 物保护、更大的根系增殖和根系深入土壤得到增强（Adams等，"Trichoderma harzianum Rifail295-22Mediates Growth Promotion of Crack Willow(Salix fragilis)Saplings in Both Clean and Metal-contaminated Soil,，'Microbial. Ecol. 54:306-313 (2007)； Harman, G. E. , "Myths and Dogmas of Biocontrol. Changes in Perceptions Derived from Research on Trichoderma harzianum T-22,''Plant Dis. 84:377-393 (2000)； Harman 等，"Changing Paradigms on the Mode of Action and Uses of Trichoderma spp. for Biocontrol，''Outlooks Pest Manag. 19:24-29 (2008);和 Harman 等，"Trichoderma Species-Opportunistic, Avirulent Plant Symbionts,'^Nature Rev. Microbiol. 2:43-56(2004)，所述文献在此通过引用整体并入）。
[0046] 适用于本发明的木霉属菌株（例如，绿色木霉、绿木霉、哈茨木霉和深绿木霉）是 具有定植于根系的较强能力的菌株。这种能力被称为根际能力，它在本文中用于描述在 种植时在没有大量水流的情况下施用种子或其它点源时能够定植于根表面或表面加上周 围的土壤体积（分别称为根面和根际）的那些生物体。因此，本发明的生物体具有在根 系发育时在其中和其上增殖的生理和遗传能力。根际能力并不是绝对的术语，并且不同 程度的这种能力可能会出现在菌株之间（Harman, G.E·，"The Development and Benefits of Rhizosphere Competent Fungi for Biological Control of Plant Pathogens,，'J. Plant Nutritionl5:835-843 (1992) ;Smith 的美国专利号 4, 996, 157 和 5, 165, 928,所述文 献在此通过引用整体并入）。用于测量根际能力的程序是本领域技术人员已知的（Harman 等，"Combining Effective Strains of Trichoderma harzianum and Solid Matrix Priming to Improve Biological Seed Treatments, ''Plant Disease73:631-637(1989)； Harman, G. E. , "The Myths and Dogmas of Biocontrol.Changes in Perceptions Based on Research with Trichoderma harzianum T-22, ''Plant Disease 84:377-393(2000)； Kloepper 等，"A Review of Issues Related to Measuring Colonization of Plant Roots by Bacteria, " Can. J. Microbiol. 38:1219-1232 (1992)，所述文献在此通过引用整 体并入）。
[0047] 本发明的肥料可以是颗粒、丸粒、粉尘、粉末、浆液、薄膜和/或液体悬浮液形式。 在一个实施方案中，所述肥料呈含有明胶作为固化剂的颗粒或丸粒形式。明胶可以占颗粒 或丸粒的5-20重量％，或更优选地，颗粒或丸粒的7-8重量％。在另一个实施方案中，所述 肥料包括至少1〇~4个菌落形成单位/g("cfu"）的所述底物中的至少一种微生物。在又 一个实施方案中，所述肥料呈包括氨基酸和氨的液体悬浮液形式。本发明的微生物是生长 的，因此以重量计，它们的数量是微乎其微的。KT4cfU相当于微生物制剂所占的比例仅仅 是底物中的1〇~7中的一小部分。然而，该制剂可以许多不同方法来制成，因此，颗粒或丸粒 中的木霉属或其它微生物的浓度可以很容易地变化ΙΟΟχ。
[0048] 本发明的肥料也考虑了添加营养物的补充来源。这些来源包括例如土壤、水、尿 素、硝酸铵，提供氮、磷、钾、钙、镁、硫和其它微量营养物的来源。已知在植物生长和存活中 有用的至少16种化学元素。16种化学元素分为两大类：非矿物和矿物。非矿物营养物包 括氢（H)、氧（0)和碳（C)并且存在于空气和水中。其余13种营养物是矿物，其来自土壤， 溶解于水中并通过植物的根来吸收。矿物营养物可进一步分为两组：大量营养物和微量营 养物。大量营养物包括但不限于队？、5、1(、0 &、1%、似和51。微量营养物包括但不限于？6、 Mn、Cu、Zn、Mo、B和C1。只需要非常小（即微）量的微量营养物。这些营养物和它们对于 植物的益处为本领域技术人员所熟知。本发明的肥料也可含有选自由硝酸盐、氨、铵盐、氨 基酸、尿素、鱼粉或提取物、堆肥提取物、海藻提取物、虾提取物、贝类提取物及其组合组成 的组的可溶性氮源。
[0049] 本发明的底物可掺合植物营养物的其它来源，所述植物营养物包括钾、磷、铁或微 量营养物。
[0050] 在一个实施方案中，所述肥料进一步包含选自由葡聚糖、淀粉、聚氯乙烯及其组合 组成的组的非蛋白质结合剂。
[0051] 在另一个实施方案中，所述肥料可以包括选自由磷酸岩、磷酸钠、磷酸钾、骨粉及 其组合组成的组的磷源。
[0052] 在又一个实施方案中，所述肥料可以包括选自由氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、新泽西 绿砂、钾的有机源、动物粪肥及其组合的组的钾源。对于有机用途，钾的来源包括新泽西绿 砂以及有机上所列的硫酸钾和氯化钾。
[0053] 该肥料可以替代地包括微量营养物，所述微量营养物选自由盐，含有铁、钴、锰、 镁、铜、钙、硼、锌的物质及其组合组成的组。这些容易从各种来源获得。
[0054] 硫已经存在于包含在所述底物中的氨基酸中，包括，例如，羽毛粉。有用的肥料可 以在含有或不含其它营养物的情况下通过混合或添加除了 N以外的其它有机底物来源以 各种N :P :K比率来制备。在一个实施方案中，所述肥料具有介于10-20重量％之间的氮含 量。
[0055] 在一个实施方案中，所述肥料含有生长介质。本发明的生长介质可以包括但不限 于土壤、砂堆肥、泥炭、稻壳、椰纤维、椰糠（cocopeat)、含有有机和/或无机成分的无土生 长介质、人造植物生长基质、基于聚合物的生长基质、水栽营养物和生长溶液、有机土壤改 良剂、水和它们的混合物。
[0056] 肥料可以包括选自由水、水溶液、浆液和粉末组成的组的载体。
[0057] 或者，肥料可以包括添加剂，如但不限于，杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、额外有机 肥料、生物杀虫剂、生物杀真菌剂、生物杀线虫剂、农业或园艺佐剂、粘着剂、撒施剂、表面活 性剂、分散剂、湿润剂、UV防护剂及其混合物。肥料也可含有有机碳来源，如但不限于，堆肥 和生物炭。
[0058] 本发明的另一个方面涉及一种肥料，其包含至少一种选自角蛋白降解微生物的微 生物和由至少一种微生物施加作用以释放氮的角蛋白底物。
[0059] 本方面的方法按照以前的方面进行。
[0060] 在一个实施方案中，所述肥料包含至少一种选自由绿色木霉（NRRL B-50520)、短 尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其组合组成的组的微生物。
[0061] 本方面的角蛋白降解微生物可以包括链霉菌属（Streptomyces)的微生物，包 括但不限于除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor)和紫红链霉菌（Streptomyces violaceoruber) 〇
[0062] 本发明的这一方面可以使用以上关于任何上述植物所描述的任何添加剂及任何 应用方式来进行。
[0063] 本发明的另一个方面涉及增强植物生长的方法。该方法包括提供一种肥料，其包 含至少一种选自由以下各项组成的组的微生物：绿色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其组合；和由至少一种微生物施加作用以释放氮的 底物。该方法进一步包括在与不施用肥料的植物或植物种子相比可有效地提高植物或植物 种子的生长的条件下使所述肥料与植物或植物种子接触。
[0064] 本方面的方法按照以前的方面进行。
[0065] 在本发明的本方面的一个实施方案中，所述肥料含有占颗粒或丸粒的5-20重 量％的明胶。
[0066] 在实施本发明的各个方面中，可以将肥料制备成含有有机或无机材料的制剂，所 述有机或无机材料有助于将生物体递送或接触到受体植物或植物种子。此外，在本文中 所描述的本发明的所有方面中，肥料与植物或植物种子或其它植物材料的接触可以在将植 物、植物种子或其它植物繁殖材料引入生长介质或区域中的同时、之前或之后进行。植物、 植物种子或其它植物材料可以如上文所述但不限于在任何合适的种植介质中以及在任何 合适的环境（例如，温室或田间环境）中形成（繁殖）。本领域技术人员将能够容易地确立 适用于维持和/或繁殖植物的要求。
[0067] 不管生物体与植物、种子或其它植物材料进行接触的顺序，以下都是根据本发明 用于使肥料与所选择的植物材料进行接触的合适的方法。这些方法的非限制性实例包括撒 播施用、落下施用、旋转施用、液体或干式犁沟施用、直接掺入到土壤或温室种植混合物中、 喷雾施用、灌溉、注射、喷粉、粒化，或用肥料涂覆植物或植物种子或种植介质。也可产生适 合于落下或撒播施用的颗粒制剂、添加至盆栽混合物中或直接在田间施用的粉末状制剂， 或使用本文描述的系统的液体肥料。
[0068] 可以将本发明的肥料以与常规肥料相同的方式来施用。如相关领域技术人员已 知，可以使用许多方法和设备。在一个实施方案中，本发明的微生物与底物的混合物被直接 施用到土壤或植物。在另一个实施方案中，本发明的微生物与底物的干燥粉末被施用到土 壤或植物。肥料可以通过撒施机、喷雾器以及可以自动化的其它机械化装置施用于土壤。月巴 料可以例如通过浸泡种子和/或根，或喷到叶子上来直接施用于植物。可定期进行这类施 用，如每年一次，或每个生长季节一次，或根据需要更频繁地进行。虽然不是必需的，但是本 发明的肥料也可以与其它类型的肥料一起或轮换使用。
[0069] 可配制或混合有益微生物以制备颗粒、粉剂或液体悬浮液。可以将这些制剂直接 混合到土壤或种植混合物中。然后将制剂混合到土壤中或温室应用的种植混合物容积中或 田间土壤的上部容积中（Harman, G, "The Myths and Dogmas of Biocontrol· Changes in Perceptions Based on Research with Trichoderma harzianum T-22， ''Plant Disease 84:377-393(2000)，所述文献在此通过引用整体并入）。用于这类接触的设备和程序是众 所周知的并且在各种农业行业中使用。典型比率是每立方米种植混合物或土壤含有1〇 7至 109个菌落形成单位（cfu)的0· 2至10kg产品。
[0070] 接触也可以通过用于温室或苗圃土壤和土壤混合物的液体施用（浸液）来进行。 有益微生物的液体悬浮液可以通过以下方法来制备：通过将干粉制剂混合到水或其它载 体，包括肥料溶液中，或通过将含有生物体的液体制剂在水或其它水溶液，包括含有肥料的 那些溶液中稀释。在任一情况下，该制剂可包括其它有机或无机添加剂以有助于溶解或施 用所述混合物。然后，在种植之前或当植物活跃生长时，溶液可以用于如通过田间灌溉来浇 洒种植混合物。通常，含有1〇 7至109cfu的10至400ml产品（粒径通常为150/inn或更 小）与100L水混合以用于这样的应用。
[0071] 种子通常通过行业中众所周知的的方法使用浆料、薄膜包衣或丸粒化 来处理(Harman 等,"Factors Affecting Trichoderma hamatum Applied to Seeds As a Biocontrol Agent, Phytopathology71 : 569-572 (1981) ；Taylor 等,"Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments, "Ann. Rev. Phytopathol. 28:321-339 (1990)，所述文献都在此通过引用整体并入）。可以将本发明的微 生物有效地添加到任何这样的处理，条件是制剂不含对有益生物体有害的材料。根据讨论 的生物体，这可能包括化学杀真菌剂。通常，将生物体的粉末或液体制剂（1〇 7至l〇1(lCfu/g) 悬浮于水性悬浮剂中以得到生物活性水平的生物体。液体通常含有粘合剂和其它材料以提 供良好覆盖水平的种子，并且也可以改善其种植形状或美化外观。
[0072] 接触还可以通过含有有益生物体的干粉来实现，这些干粉以粉剂形式施用至根、 球茎或种子。通常，将细粉末（通常为250/英寸或更小）撒在种子、球茎或根上直至最大 承载粉末（即，直到没有更多的粉末会粘附在处理过的表面上为止）。这些粉末通常含有 10 7 至 109cfu/g。
[0073] 有益微生物的液体悬浮液可以通过以下方法来制备：通过将干粉制剂混合到水或 其它水性载体，包括肥料溶液中，或通过将含有微生物的液体制剂在水或其它水溶液中稀 释。然后，在种植之前或当植物活跃生长时，这些溶液可以用于浇洒种植混合物。通过位于 施用所需深度的中空管，产品的液体悬浮液可在压力下注入到适当的植物根区。用于这类 施用的设备在园艺业中是众所周知的。或者，可以将含有适当生物体的悬浮液或粉末施用 到土壤的孔或其它水性环境中。可如上针对制备浸液所述来制备产品的液体悬浮液。这类 材料可以被添加到其中种植种子或移栽小植物的犁沟中。用于这类施用的设备广泛用于农 业。典型的施用率是〇. 5至10kg产品（107至109cfu/g)/公顷田地。
[0074] 颗粒可以被撒播到含有生长植物的土壤表面、种植时的土壤，或撒播到种子或 植物将被种植的土壤上。根据要处理的植物和处理的目标，典型施用率的范围是含有 10 7至109cfu/g的1到500kg产品。或者，可以制备并施用喷雾溶液以得到相似速率 (Harman, G. E.，"The Dogmas and Myths of Biocontrol. Changes in Perceptions Based on Research with Trichoderma harzianum T-22,''Plant Dis. 80:736-741 (1996) ；Lo 等，''Biological Control of Turf grass Diseases with a Rhizosphere Competent Strain of Trichoderma harzianum,''Plant Disease80:736-741 (1996) ;Lo等，''Improved Biocontrol Efficacy of Trichoderma harzianuml295_22for Foliar Phases of Turf Diseases by Use of Spray Applications,'Tlant Dis.81:1132_1138(1997)，所述文献在 此通过引用整体并入）。
[0075] 出于本发明的目的，设计描述施用的所有方法来实现相同目的，即，以提供将产 生有益生物体在根系有效定植的施用方法（Harman等/'Potential and Existing Uses of Trichoderma and Gliocladium For Plant Disease Control and Plant Growth Enhancement, 〃于Trichoderma and Gliocladium, Harman等编辑，第2卷，London:Taylor and Francis(1998)中，所述文献在此通过引用整体并入）。
[0076] 本发明可用于处理多种植物的种子。如本文所用，本发明的肥料支持或增强植物 的生长，如果土壤中的肥料在存在的情况下，或施用到根、茎、叶或植物的其它部分，植物或 植物的其它部分获得生存力、大小、重量、发芽率、生长率，或者成熟率。因此，肥料适用于任 何种类的农业、园艺和林业实践。肥料可在户外或温室中，或甚至在装饰性工厂的内部用 于大规模的商业性农业。优选地，肥料用于提高作物植物的生长，如但不限于谷类作物、蔬 菜作物、水果作物、花卉作物和草作物。例如，可以将肥料组合物用于双子叶植物和单子叶 植物。更具体地说，按照本发明处理的植物包括易受真菌或植物病原体感染的任何植物。 例如，按照本发明处理的植物包括但不限于，农艺中耕或其它大田作物，其包括荞麦、豆类 (大豆、食荚菜豆、干豆）、玉米（谷物、种子、甜玉米、青贮饲料、爆米花、高油玉米）、棉花、油 菜、豌豆（干燥、多汁）、花生、红花和向日葵；苜蓿干草和饲料作物，其包括苜蓿、三叶草、野 豌豆和车轴草；浆果和小水果，其包括黑莓、蓝莓、醋栗果、接骨木果、醋栗、越橘、罗甘莓、树 莓、草莓、葡萄、球茎作物：大蒜、韭菜、洋葱、青葱、和观赏球茎；柑橘类水果，其包括柑橘杂 交、葡萄柚、金橘、酸橙、橙子和柚子；瓜类蔬菜，其包括黄瓜、甜瓜、葫芦、南瓜（pumpkin)、 南瓜（squash)和鲜花；花坛植物和观赏植物；果类蔬菜，其包括茄子、甜辣椒、粘果酸浆、 番茄、药草、香料和薄荷；水培作物，其包括黄瓜、西红柿和莴苣；药草和香料；叶菜类蔬菜 和油菜作物，其包括芝麻菜、芹菜、山萝卜、菊苣、茴香、莴苣（头和叶）、欧芹、菊苣、大黄、 菠菜、唐莴苣、花椰菜、球芽甘蓝、甘蓝、花椰菜、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大头菜、芥菜和芦笋； 豆类蔬菜和大田作物，其包括食荚菜豆和干豆、扁豆、多汁和干豌豆、花生和大豆；梨果类水 果，其包括梨和温柏温柏；作物，其包括甜菜根、甜菜、红甜菜、胡萝卜、块根芹、菊苣、山葵、 欧洲防风草、萝卜大头菜、婆罗门参、芜菁；遮阴和其它苗圃作物，其包括落叶树（枫木、橡 木）、观赏植物、葡萄、柑橘、松树；小粒谷类作物，其包括黑麦、小麦、高粱和小米；核果，其 包括杏、樱桃、油桃、桃子、李子、李子干、木本坚果：杏仁、山毛榉坚果、巴西坚果、灰核桃，腰 果、栗子、榛子、山核桃、澳洲坚果、美洲山核桃、开心果和核桃；块茎作物，其包括马铃薯、红 薯、山药、菊芋、木薯和姜。其它实例包括与草坪草、草皮、运动场、公园、已建和新建高尔夫 球场发球台、球穴区、球道和深草区、种子产生和草皮生产相关的那些草。可处理的植物还 包括矮牵牛、天竺葵、一品红、菊花、康乃馨和百日草。
[0077] 本发明的植物生长的增强可能会呈更大的根群、更大的生根深度、更大的芽群、更 大的芽叶长度、增加的叶绿度、增加的产量、以及改善的群丛和活力的形式。植物的生长可 以通过除了上面列出的外在特性以外的其它方法来确立和确定。本领域技术人员将能够容 易地确立物理、生化或基因测试以确定和/或定量植物生长或存活力。
[0078] 由本文公开的肥料定植于根部植物得到许多优势。一个优势是通过微生物菌株对 于病原微生物（参见Chet, L，"Trichoderma_Application，Mode of Action, and Potential as a Biocontrol Agent of Soilborne Plant Pathogenic Fungi,，' 于 Innovative Approaches to Plant Disease Control,第 l37_l6〇 页，1. Chet 编辑，J. Wiley and Sons:New York(1987)中，所述文献在此通过引用整体并入）或其它有害的土壤微生物区 系的直接作用来防止植物患病（Bakker等，"Microbial Cyanide Production in the Rhizosphere in Relation to Potato Yield Reduction and Pseudomonas spp-Mediated Plant Growth-Stimulation, " Soil Biol. Bio-Chem. 19:451-457 (1987)，所述文献在此通 过引用整体并入）。由于抗性的系统性诱导抗性，微生物提供针对植物病原体的防护。这 使得植物在由施用微生物广泛分隔（时间上或空间上）的点处得到保护（参见Harman 等,"Trichoderma Species-Opportunistic, Avirulent Plant Symbionts, " Nature Microbiol. Rev. 2:43-56,（2004)，所述文献在此通过引用整体并入）。例如，通过诱导抗性， 即使当本文所公开的微生物只存在于根上，它们也可以控制叶面病原体。
[0079] 另一个优势是，本发明的肥料可以提供针对因干旱（缺水）、疾病或其它不利植物 生长条件而产生的非生物胁迫的保护。很多时候，可以将植物培植在这样的气候下，其中作 物暴露于许多生物和非生物胁迫如植物疾病和干旱。干旱条件影响植物的基因表达、氨基 酸范谱和光合作用从而诱导产生胁迫。在用本发明的肥料处理的植物中，这些反应中的大 多数可能会延迟。通过在田间用本发明的微生物处理植物，有可能提高植物对干旱的耐受 性。对干旱、疾病和胁迫性具有提高的耐受性的植物将通过使作物产量和盈利能力稳定而 有利于农民。
[0080] 在本发明公开的肥料中使用的微生物可能导致根部更大且更深，并且大概通过提 高氮吸收而减少植物生长对氮的需求。此能力还可以用于减少植物生产者的氮需求。这些 菌株还可以提高植物对干旱的耐受性。
[0081] 要理解本发明的相关性，考察植物产量稳定水平是很重要的。植物一般用增加 的产量和生长至某点对应于增加的氮肥水平，然后产量增加趋向平稳；这就是产量稳定水 平，超过所述水平氮肥的使用不再使产量增加。已经显示用本发明的微生物（即绿色木 霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)和短尾帚霉（NRRL B-50522))处理过的种 植种子即使在氮显著缺乏条件下也能增加植物生长和生产力（参见Harman, G.，"Myths and Dogmas of Biocontrol. Changes in Perceptions Derived from Research on Trichoderma harzianum T-22,''Plant Dis. 84:377-393(2000) ;Harman 等，"Enhancing Crop Performance and Pest Resistance with Genes from Biocontrol Fungi,，' 于 M. Vurro, J. Gressel, T. Butt, G. E. Harman, A. Pilgeram, R. J. St. Ledger 和 D. L. Nuss (编 辑),Enhancing Biocontrol Agents and Handling Risks 第 114-125 页.I0S Press, Amsterdam(2001) ;Harman 等，''Trichoderma Species-Opportunistic, Avirulent Plant Symbionts, " Nature Rev. Microbiol. 2:43-56(2004)，所述文献在此通过引 用整体并入）。在存在共生生物防治真菌的情况下生长的植物经常更绿且更有活力 (Harman, G.，''Myths and Dogmas of Biocontrol. Changes in Perceptions Derived from Research on Trichoderma harzianum T-22,''Plant Dis. 84:377-393(2000)，所述文献在 此通过引用整体并入）。先前的研究已经发现，与不存在哈茨木霉时相比，在其存在时，用少 于40-50%的氮肥达成产量稳定水平（Harman等/'Enhancing Crop Performance and Pest Resistance with Genes from Biocontrol Fungi," 于 M. Vurro, J. Gressel, T. Butt, G. E. Harman, A. Pilgeram, R. J. St. Ledger 和 D. L. Nuss (编辑），Enhancing Biocontrol Agents and Handling Risks 第 114-125 页.I0SPress，Amsterdam(2001)中，所述文献在此通过引 用整体并入）。这意味着，可以降低该量的氮肥比率而不会使产量减少。这极有可能减少从 土壤中放出的N 20,因为施用的总肥料减少，并且更大比例的施用氮必须由植物吸收，而预 期植物代谢中的氮需求不发生改变，因此，在植物中获得添加 N的唯一途径是通过增强的N 使用效率。
[0082] 本发明的另一个方面涉及制造包含氨基酸和氨的肥料的方法。该方法包括提供 至少一种选自由以下各项组成的组的微生物：绿色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其组合，并且提供由至少一种微生物施加作用以释 放氮的底物。该方法进一步包括在有效地使得所述至少一种微生物对底物施加作用并且产 生包含氨基酸和氨的液体悬浮液的条件下使所述至少一种微生物与底物接触。
[0083] 本发明的这一方面可以使用以上关于任何上述植物所描述的任何添加剂及任何 应用方式来进行。
[0084] 在本方面的这个方面，由于发酵，肥料可以呈全部或部分底物（即，角蛋白）的液 化形式。这样的发酵将产生氨基酸、肽和/或氨。
[0085] 本发明的另一个方面涉及分离的绿色木霉菌株，其在编号NRRL B-50520下保藏于 农业研究服务培养物保藏中心。分离的绿色木霉菌株可以是生物学上纯的形式。
[0086] 本发明的另一个方面涉及分离的短尾帚霉菌株，其在编号NRRL B-50521下保藏于 农业研究服务培养物保藏中心。分离的短尾帚霉菌株可以是生物学上纯的形式。
[0087] 本发明的另一个方面涉及分离的短尾帚霉菌株，其在编号NRRL B-50522下保藏于 农业研究服务培养物保藏中心。分离的短尾帚霉菌株可以是生物学上纯的形式。 实施例
[0088] 提供下列实施例以说明本发明的实施方案，而绝不是意欲限制其范围。
[0089] 实施例1-降解废物蛋白质的有效微生物的分离
[0090] 在农业废弃物中存在的最广泛的一种蛋白质是角蛋白。这是毛发、羽毛和其它类 似物质的结构成分。虽然角蛋白一般在土壤中或其它地方缓慢地降解，但是也有使该底物 降解相对快速的微生物。
[0091] 本发明的生物体可以在液体发酵中生长并且将释放氨和氨基酸。对于本文所述的 菌株NRRL的使用，可以使用附加的营养物，如胰酶解酪蛋白大豆肉汤（Difco公司产品）。 将1至10% w/v的羽毛粉添加到含胰酶解酪蛋白大豆肉汤的水中，并将该混合物通过高压 灭菌消毒。当将生物体添加到这个无菌介质中时，羽毛粉被降解。氨从羽毛粉中释放产生 碱性环境。由于高pH下的氨是强挥发性的，因此这种材料的存在易于通过气味检测。收获 和连续移除氨的系统都是现成的，并且是本领域技术人员已知的。一种方法是简单地使封 闭的无菌闭环置于包括无菌空气喷射装置的发酵容器外面。当空气被引入通过发酵液时， 氨将会被移除，并且可以通过传递至酸性溶液中而被截留，醋将是令人满意的酸性溶液。这 将导致可以很容易地用作肥料的乙酸铵的形成，而这种喷射步骤将导致氨富集供进一步使 用。如果还需要移除氨基酸，此步骤可以通过使所述发酵液穿过适当的离子交换树脂来实 现，可将氨基酸从离子交换树脂上洗脱，并由此富集。同时，该喷射过程将移除使pH值升高 的过量的氨从而使发酵继续进行。这可以被开发成用于有效生产氨的连续流动系统。
[0092] 本发明试图确定使蛋白质降解的有效微生物。要实现这一点，将羽毛粉与泥炭苔 混合并将混合物润湿（组成：1L泥炭苔、1L羽毛粉和400ml水），连续两天使混合物高压灭 菌，并用lg堆肥鸡粪来接种混合物。泥炭苔被用作增积/通气组分，并且堆肥鸡粪被认为 是角蛋白（即羽毛）降解的微生物的良好来源。在接种六天内，存在强的氨气味，表明羽 毛降解成氨，所述氨是用于植物的优良天然营养物。在氨气味介质中存在的生物体在根据 制造商的指示制备的马铃薯葡萄糖琼脂（"PDA"）（ "Difco"）和胰酶解酪蛋白大豆琼脂 ("TSA"）（ "Difco"）上使用稀释技术进行涂板。在一般为真菌介质的PDA上的微生物生 长通常较差，但在为水解的大豆蛋白的TSA上，许多真菌生长。奇怪的是，这些微生物仅由 显然能够在羽毛粉上生长良好的三种不同的微生物组成，而在堆肥中出现的其它大多数丰 富的微生物不能在羽毛粉上良好生长。通过单一孢子分离、获得这些真菌的纯的形式并储 存在-20°C的硅胶上，这是保存真菌的非常好的方式。
[0093] 将从鸡粪堆肥中分离的真菌接种到胰酶解酪蛋白大豆肉汤（"TSB"）并且生长三 天。在TSB中获得所有微生物的良好生长，并且将50ml活跃生长的培养物加入具有法兰盖 的无菌塑料盒中所包含的羽毛粉：泥炭混合物中，所述法兰盖为盒的内含物提供良好通气。 经过六天的生长，将样品移除、提取并确定可溶性氮化合物的水平。提取物针对氨基酸（茚 三酮法）或氨（Nessler试剂；LaMotte测试试剂盒）进行了分析。
[0094] 用获得的真菌获得有希望的结果。以赖氨酸为标准，对照样品的氨水平为约 19 μ g/ml，而三个菌株的值分别为600 μ g/g、3240 μ g/g和4900 μ g/g。对于相同三个菌株 来说，相同样品的氨基酸水平是2800 μ g/g、3003 μ g/g和5600 μ g/g，而对照值为约3 μ g/ ml。这些测定均重复多次，结果相似。特别是若干菌株比任何其它测试的微生物能更有效 地降解角蛋白。
[0095] 实施例2-角蛋白降解真菌和细菌的鉴定
[0096] 将以上实施例1中鉴定的真菌送到USDA典型培养物保藏中心以保藏在它们的专 利集合中。针对绿色、棕色和白色孢子菌株，这些菌株分别被命名为NRRL B-50520、NRRL B-50521和NRRL B-50522。这些真菌被鉴定为绿色木霉（NRRL B-50520)和短尾帚霉（NRRL B-50521和NRRL B-50522是该真菌的两个分离株）。这两个物种有帚状分生孢子，但分生 孢子的排列的细微差异清楚地将它们置于各自的属中。也对各分离株的ITS区进行测序并 通过GenBank BLAST查询进行了评估。结果是，它们的身份被确认如下：
[0097] NRRL B-50520-绿色木霉
[0098] NRRL B-50521-短尾帚霉
[0099] NRRL B-50522-短尾帚霉
[0100] 绿色木霉具有非常低的风险特征。美国环境保护局指出，相对于使用该属中的菌 株作为真菌病原体的生物控制剂，"该机构预计，多孢木霉和绿色木霉的当前注册地点不 需要额外的健康影响数据"（木霉属物种概要文件，注册审查：初始文案，美国环境保护局 (2007年4月），所述文献在此通过引用整体并入）。这同样适用于木霉属中的大多数其它 真菌。
[0101] 最近的评论列出了产生角蛋白酶的生物体（Brandelli等，"Biochemical Features of Microbial Keratinases and Their Production and Applications，''Applied Microbiology and Biotechnology 85:1735-1750(2010)，所述文 献在此通过引用整体并入）。短尾帚霉被描述为角蛋白酶的产生者，但绿色木霉不是。然 而，有来自印度的通过绿色木霉菌株产生角蛋白酶的单个报告（Jyoti等，"Keratinolytic Enzymes From Trichoderma viride and Graphium cuneiferum Isolated From Poultry Farms at Jabalpur，India，"Cryptogamic Botany4:30_33(1993)，所述文献在此通过引用 整体并入）。
[0102] 实施例3-生产可用制剂的方法
[0103] 羽毛粉是粗糙的棕色粉末。在许多应用中使用的干肥料需要以颗粒形式通过落下 或旋转分散系统来施用。因此，开发了用于制备可用颗粒的方法。需要固化并且制作直径 尺寸为2-5毫米的颗粒的方法。初始颗粒通过以下制备：将足量的水添加至羽毛粉末以制 成浆料，然后将明胶溶解于该浆料直至相对于羽毛粉末为约7%的最终浓度。将此材料以 薄片形式分散并干燥，结果获得硬棕色薄片。随后将此研磨并过筛以得到所需尺寸的颗粒。 应理解的是，类似的组合物可被挤出并干燥以得到适当大小的颗粒。类似地，这些混合物也 可以在造粒设备中使用，随后适当地设定大小。
[0104] 因此产生的颗粒不含任何添加的的微生物。制造颗粒或丸粒的某些系统涉及加 热和施加压力，因此开发了用于丸粒的涂布程序。将已知能提供益处（包括增强的氮利 用效率）的木霉属菌株的分生孢子添加至〇· 1% Crystal Tex(木薯右旋糖酐，National Starch)以得到约105个菌落形成单位/ml的悬浮液。将该混合物施加到干燥丸粒的表面 以得到光滑且连续的涂层，所述涂层不明显地增加颗粒的尺寸。因此，活的真菌被施用为干 涂层。从这个位置，当丸粒湿润时，这些真菌立即生长（图1)。
[0105] 在以后的实验中，将菌株直接添加至混合物同时润湿并且然后将其挤出以形成丸 粒进行检查。此方法效果非常好并且只要干燥温度保持在38°C或以下生物体保持稳定。选 择适当的微生物体（即微生物）有助于获得最佳效果。这些微生物有两个功能：（1)某些 微生物具有使羽毛粉或其它抗性蛋白质降解的能力，并且（2)某些微生物作为内生植物共 生体。在本发明的实验中，在不存在微生物的情况下，如通过草坪植物返青判断的N只在施 用后4-6周出现。而此时，在存在降解微生物的情况下，大部分N已经被释放。内生植物微 生物有很多功能，其中之一是提高植物氮利用效率（"NUE"）。如果包含此微生物组分，则 肥料的有效N值增大。因此，当包括NUE贡献时，14% N肥料中的N量实际上变成28%。如 果本发明与具有30% N的标准合成肥料竞争且并与其一样有效，那么上述情况是本发明的 有用的方面。植物仍然需要相同水平的N来茁壮成长，因此本发明中的肥料在相同的施用 率下变得同样有效（对经济竞争力有用）的唯一方法是通过使用NUE增强生物体。
[0106] 标准合成肥料含有高水平的盐，并且这些成分的渗透势和直接影响对于微生物是 致命的。然而，在本发明中，合成盐几乎完全消除，并且因此，含有微生物的颗粒对于微生物 是安全的。大多数颗粒是蛋白质，它对于微生物是无毒的。因此，微生物剂的涂布或直接混 合是本发明的一个构成。
[0107] 可以将微生物组分和非生物组分配制成单一颗粒或其它混合物。在文献中存在很 多以下情况：其中，例如，添加至土壤或生活在土壤中的微生物增加植物生长，包括NUE。然 而，用户不愿意施用多个不同的生物体和其它产品来实现有价值的结果。把所有的生物和 非生物组分纳入单一产品或颗粒是本发明的一个构成。
[0108] 本发明的这一实施方案提供了几乎完全由蛋白质组成的颗粒。蛋白质是12-14% N，因此因为明胶和羽毛粉都是动物蛋白，所以获得了必需值。
[0109] 对于一些应用，颗粒产品对于一些应用是没有必要的。常常将粉末用作例如植物 生长介质的组分，以及作为直接添加到田间或花园的材料，诸如这样的颗粒的典型氮值是 12-14 %。可直接使用本文中所描述的羽毛粉和微生物的混合物。
[0110] 此外，可以将任何数目的添加物制成这种基本颗粒或粉末。一个实例是如上文实 施例2中从生长介质中提取的液体氨和氨基酸混合物。这可以干燥粉末或颗粒形式直接使 用，或浓缩以得到更高水平的N。由于羽毛粉或明胶提供很少的立即可用的N，因此这样的 添加可用于提供立即返绿。其它合适的氮源是鱼粉或提取物、堆肥提取物、海藻提取物、海 洋动物如虾或贝类提取物。无机源包括硝酸盐、无机氨源等。此外，可以加入有机上所列的 产品，如来自绿砂的K或有机上所列的硫酸钾，以及未列出的其它K源。类似地，P可以以 骨粉（有机）形式提供或来自各种无机盐。对于草坪施用，P是被禁止的，并且羽毛粉或明 胶组分的使用是因为P是不存在的。
[0111] 实施例4-用于草的肥料
[0112] 肥料的非常苛刻的用途是施用到草坪、运动场、公园、高尔夫球场及其它类似用途 中的草上。肥料必须提供极具吸引力的表面并且持续相当长一段时间。制备颗粒以含有 73. 8 %的羽毛粉、13%的智利硝酸盐、7. 3%的明胶和5. 7%的新泽西州绿砂（K源）。智利 硝酸盐是目前有机认证的，并含有16 %的N，所以其氮含量只比蛋白成分的含量高一点。作 为对比，所生产的制剂相对于分析为30:2:8N :P:K(以N、已05和1(20形式）的广泛使用的 家用肥料ScottsK Turf Builder?来进行测试。通过比较可以预料，所制备的肥料的分析是 15-16:0:0. 3,所以它不是完整的肥料。P不包括在内，因为存在导致富营养化的磷污染水 体的危险，所以这在许多司法管辖区是不被允许的。N水平比Scotts'肥料的N水平低高达 50 %，并且K水平是次优的。因此，如果本发明的肥料制剂的性能接近于Sc〇ttsU的性能，它 说明了（a)显著量的N从肥料中释放，（b)草坪植物中由所添加的真菌诱导了 N吸收功效 提高，并且（c)有较少可用的N渗入地下水。毕竟，植物还需要相同量的N来生长，如果只 添加一半的氮，那么必须有更大的N吸收，并且只能有渗入地下水的少量的氮。
[0113] 在几乎不含有游离氮的1:1沙壤土：泥炭混合物中种植的一年生黑麦草中进行测 试。将一年生黑麦草种植在浅苗床中并在种植后约两周幼苗已形成后，施用各种肥料。颗 粒以1χ施用率来施用，这是以ScottsK Turf BuildeP的推荐施用率来施用的肥料水平。此 夕卜，每次处理以此施用率两次施用。第一个实验中包含如下的一些处理：
[0114] ?无处理对照
[0115] ?施用无任何微生物的颗粒
[0116] ?施加有B-50520的颗粒
[0117] ?涂覆有B-50521的颗粒
[0118] ?涂覆有B-50522的颗粒
[0119] ?涂覆有B-50520+木霉属菌株K1-K4的颗粒（在下一个实施例中描述）
[0120] ?涂覆有B-50521+木霉属菌株K1-K4的颗粒
[0121] ?涂覆有B-50522+木霉属菌株K1-K4的颗粒。
[0122] · Scotts* Turf Builder1、肥料
[0123] 全部以lx和2x施用率来施用。在本实施例中，K1-K4由以下菌株组成：哈茨木 霉菌株RR17Bc (ATCC登记PTA9708);哈茨木霉FllBab (ATCC登记PTA9709)、深绿木霉菌株 WW10TC4 (ATCC PTA 登记 9707)和绿木霉菌株 41 (ATCC 登记 20476)。
[0124] 这些试验的结果是成功的，并总结于图2A-2B和图3A-3D。
[0125] 在图2A中，所使用的处理为PT(有机肥料，NRRL B-50521，和K1-K4,其包括 哈茨木霉菌株RR17Bc (ATCC登记PTA9708)、哈茨木霉FllBab (ATCC登记PTA9709)、 深绿木霉菌株WW10TC4 (ATCC PTA登记9707)，和绿木霉菌株41 (ATCC登记20476)); STB =Sc〇ttsuTurf Builder"; P =具有NRRL B-50521的有机肥料；和C =未处理的对照。 在图2B中，所用的处理为PT (有机肥料和NRRL B-50521) ;0FC =无任何真菌的有机肥料颗 粒；P (具有NRRL B-50521的有机肥料）。图2A-2B显示通过将颗粒分散于草生长的土壤的 表面上来施肥之后约10天的生长。生长增加主要是可用的可溶氮引起的。正如所见，与没 有这种生物体的任何处理相比，在存在NRRL B-50521的情况下，使用有机肥料的草的生长 基本上更大。使用NRRL B-50520或NRRL B-50522可见类似的结果。在这个时间段，与商 业草坪肥料相比，草的生长也更大。与没有颗粒的对照相比，有机肥料对照也生长更好；这 部分地可以归因于作为起始肥料添加至颗粒中的少量有机智利硝酸盐（主要是NaN0 3)。这 说明了包括微生物介导的缓慢释放氮的本文公开的本发明的效用。
[0126] 图3A-3D含有显示随时间的生长的图。为了获得这些数据，将草从浅苗床上剪断、 干燥并称重以模拟割草事件（在图2A-2B中，准备草用于切割），并且这在整个实验过程中 持续进行。所有切割均在同一天进行，所以图代表在上一次切割与下一次切割之间收获的 草量，并且收获后的天数代表进行切割时施肥后的天数。
[0127] 在播种后第7天，未处理过的草，在其最高切割水平下，是800毫克/浅苗床，此后 的切割重量下降到非常低的水平（图3A)。lx施用率下的有机肥料类似于未处理的对照， 但在2x施用率下，重量显著较大。第一次切割时的有机肥料较高，这无疑代表了在颗粒中 提供的智利硝酸盐提供的氮。一个星期后，草重量下降，然后再次增加（图3A)。这第二次 增加无疑是由于羽毛粉被天然土壤微生物区系水解。
[0128] 标准ScottsK Turf Builder"最初在?χ水平下支持适度生长，但在第二次切割 时此生长增加。在第三次切割时生长再次下降，并且最终在最后一次切割时再次增加（图 3B)。这可能反映了不同氮源的可用性的变化。然而，在双倍施用率下，草产量在第二次和 第三次切割时极低（图3B)。这是由在这个施用水平下草的烧伤造成的，这从未发生于任何 基于羽毛粉的系统中。
[0129] 在lx施用率下，菌株NRRL B-50520产生显著优于对照有机肥料的草切割产量结 果（图3A和3C)。菌株NRRL B-50521产生了氮的迅速释放，如由第一次切割时非常高的草 产量所证明，但然后在大多数情况下，草产量在第二次切割时大幅度下降。这是由于非常高 的可溶性氮释放然后将底物耗尽引起的。
[0130] 在这些实验中，应当指出的是，ScottsK:J把料相对是完全肥料，同时，如前所述，所 采用的试验材料不含有磷并且钾的水平不足。
[0131] 实施例5_用不同材料施肥的土壤和草中的可溶性氮化合物的库大小
[0132] 在上述实施例中表明通过其它方法制备的肥料将具有低水平的硝酸盐渗入地下 水。如果这是真的，那么硝酸盐的水平应比用标准的化学肥料施肥的土壤中更低。同时，由 于羽毛粉的降解导致氨基酸和氨释放，其它形式的可溶性氮应增加。这些化合物将仅通过 土壤微生物区系的活性随着时间的推移而被转化成硝酸盐。然而，氨基酸和氨有可能被植 物（或微生物区系）迅速吸收，因此库大小将不会积累到大的水平。因此，与具有标准的化 学肥料的土壤相比，在具有本发明的样品的土壤中，任何形式的游离氮的量可能更小。来自 施肥九天后采样的土壤的数据列于以下表1中。每3. 6ml提取缓冲液提取lg 土壤，并且上 文描述的比色测试用于测量提取物中的可溶性氮。关于氨基酸的水平，数据基于用赖氨酸 作为标准的稀释曲线。所有这些测定都在lx施肥率下进行。
[0133] 蓋丄.土壤中的不同形式的可溶性氮的量
【权利要求】
1. 一种肥料，其包含： 至少一种选自由以下各项组成的组的微生物：绿色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉 (NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其组合，以及 由所述至少一种微生物施加作用以释放氮的底物。
2. 如权利要求1所述的肥料，其中所述底物是选自由以下各项组成的组的蛋白质：羽 毛、羽毛粉和尿素衍生物。
3. 如权利要求1所述的肥料，其进一步包含： 呈木霉属物种形式的补充微生物。
4. 如权利要求3所述的肥料，其中所述补充微生物选自由以下各项组成的组：绿木霉、 哈茨木霉、深绿木霉及其组合。
5. 如权利要求1所述的肥料，其进一步包含： 选自由以下各项组成的组的补充微生物：印度梨形孢、植物根际促生菌、菌根真菌及其 组合。
6. 如权利要求1所述的肥料，其中所述肥料呈颗粒、丸粒、粉尘、粉末、浆液、薄膜和/或 液体悬浮液形式。
7. 如权利要求6所述的肥料，其中所述肥料呈颗粒或丸粒形式，所述颗粒或丸粒含有 明胶作为固化剂。
8. 如权利要求1所述的肥料，其中所述肥料在所述底物中包含至少ΚΓ4个菌落形成单 位/g的所述至少一种微生物。
9. 如权利要求1所述的肥料，其中所述肥料具有介于10-20重量％之间的氮含量。
10. 如权利要求1所述的肥料，其中所述肥料进一步包含： 非蛋白质结合剂，其选自由葡聚糖、淀粉、聚氯乙烯及其组合组成的组。
11. 如权利要求1所述的肥料，其中所述肥料进一步包含： 可溶性氮源，其选自由硝酸盐、氨、铵盐、氨基酸、尿素、鱼粉或提取物、堆肥提取物、海 藻提取物、虾提取物、贝类提取物及其组合组成的组。
12. 如权利要求1所述的肥料，其中所述肥料进一步包含： 磷源，其选自由磷酸岩、磷酸钠、磷酸钾、骨粉及其组合组成的组。
13. 如权利要求1所述的肥料，其中所述肥料进一步包含： 钾源，其选自由氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、新泽西州绿砂、钾的有机来源及其组合组成的 组。
14. 如权利要求1所述的肥料，其中所述肥料进一步包含： 微量营养物，其选自由盐，含有铁、钴、锰、镁、铜、钙、硼、锌的物质及其组合组成的组。
15. 如权利要求1所述的肥料，其中所述肥料进一步包含： 生长介质。
16. 如权利要求15所述的肥料，其中所述生长介质选自由以下各项组成的组：土壤、砂 堆肥、泥炭、稻壳、椰纤维、椰糠、含有有机和/或无机成分的无土生长介质、人造植物生长 基质、基于聚合物的生长基质、水栽营养物和生长溶液、有机土壤改良剂、水及其混合物。
17. 如权利要求1所述的肥料，其中所述肥料进一步包含： 选自由水、水溶液、浆液和粉末组成的组的载体。
18. 如权利要求1所述的肥料，其中所述肥料进一步包含： 添加剂，其选自由以下各项组成的组：杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、额外有机肥料、生 物杀虫剂、生物杀真菌剂、生物杀线虫剂、农业或园艺佐剂、粘着剂、撒施剂、表面活性剂、分 散剂、湿润剂、UV防护剂及其混合物。
19. 如权利要求1所述的肥料，其中所述肥料进一步包含： 选自由堆肥和生物炭组成的组的有机碳源。
20. -种肥料，其包含： 至少一种选自角蛋白降解微生物的微生物，以及 角蛋白底物，其由所述至少一种微生物施加作用以释放氮。
21. 如权利要求20所述的肥料，其中所述至少一种微生物选自由绿色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其组合组成的组。
22. 如权利要求20所述的肥料，其进一步包含： 至少一种选自由除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、紫红链霉菌及其组合组成的组的微生物。
23. 如权利要求20所述的肥料，其进一步包含： 呈木霉属物种形式的补充微生物。
24. 如权利要求23所述的肥料，其中所述补充微生物选自由以下各项组成的组：绿木 霉、哈次木霉、和深绿木霉及其组合。
25. 如权利要求20所述的肥料，其进一步包含： 选自由以下各项组成的组的补充微生物：印度梨形孢、植物根际促生菌、菌根真菌及其 组合。
26. 如权利要求20所述的肥料，其中所述肥料呈颗粒、丸粒、粉尘、粉末、浆液、薄膜和/ 或液体悬浮液形式。
27. 如权利要求20所述的肥料，其中所述肥料呈含有氨基酸和氨的液体悬浮液形式。
28. -种增强植物生长的方法，所述方法包括： 提供肥料，其包含： 至少一种选自由以下各项组成的组的微生物：绿色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉 (NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其组合，以及 由所述至少一种微生物施加作用以释放氮的底物；并且 在与不施用所述肥料的植物或植物种子相比可有效地增强所述植物或植物种子的生 长的条件下使所述肥料与所述植物或植物种子接触。
29. 如权利要求28所述的方法，其中所述底物是选自由以下各项组成的组的蛋白质： 羽毛、羽毛粉和尿素衍生物。
30. 如权利要求28所述的方法，其进一步包含： 呈木霉属物种形式的补充微生物。
31. 如权利要求30所述的肥料，其中所述补充微生物选自由以下各项组成的组：绿木 霉、哈次木霉和深绿木霉及其组合。
32. 如权利要求28所述的方法，其进一步包含： 选自由以下各项组成的组的补充微生物：印度梨形孢、植物根际促生菌、菌根真菌及其 组合。
33. 如权利要求28所述的方法，其中所述肥料呈颗粒、丸粒、粉尘、粉末、浆液、薄膜和/ 或液体悬浮液形式。
34. 如权利要求33所述的方法，其中所述肥料呈颗粒或丸粒形式，所述颗粒或丸粒含 有明胶作为固化剂。
35. 如权利要求34所述的方法，其中所述明胶占颗粒或丸粒的5-20重量％。
36. 如权利要求33所述的肥料，其中所述肥料呈含有氨基酸和氨的液体悬浮液形式。
37. 如权利要求28所述的方法，其中所述肥料具有介于10-20重量％之间的氮含量。
38. 如权利要求28所述的方法，其中所述肥料进一步包含： 非蛋白质结合剂，其选自由葡聚糖、淀粉、聚氯乙烯及其组合组成的组。
39. 如权利要求28所述的方法，其中所述肥料进一步包含： 可溶性氮源，其选自由硝酸盐、无机氨源、氨、铵盐、氨基酸、尿素、鱼粉或提取物、堆肥 提取物、海藻提取物、虾提取物、贝类提取物及其组合组成的组。
40. 如权利要求28所述的方法，其中所述肥料进一步包含： 磷源，其选自由磷酸岩、磷酸钠、磷酸钾、骨粉及其组合组成的组。
41. 如权利要求28所述的方法，其中所述肥料进一步包含： 钾源，其选自由氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、新泽西州绿砂、钾的有机来源及其组合组成的 组。
42. 如权利要求28所述的方法，其中所述肥料进一步包含： 微量营养物，其选自由盐，含有铁、钴、锰、镁、铜、钙、硼、锌的其它物质及其组合组成的 组。
43. 如权利要求28所述的方法，其中肥料进一步包含： 生长介质。
44. 如权利要求43所述的方法，其中在所述植物或所述植物种子处于所述生长介质中 之前进行所述接触。
45. 如权利要求43所述的方法，其中在所述植物或所述植物种子处于所述生长介质中 之后进行所述接触。
46. 如权利要求43所述的方法，其中所述生长介质选自由以下各项组成的组：土壤、砂 堆肥、泥炭、稻壳、椰纤维、椰糠、含有有机和/或无机成分的无土生长介质、人造植物生长 基质、基于聚合物的生长基质、水栽营养物和生长溶液、有机土壤改良剂、水及其混合物。
47. 如权利要求28所述的方法，其中所述肥料进一步包含： 选自由水、水溶液、浆液和粉末组成的组的载体。
48. 如权利要求28所述的方法，其中所述肥料进一步包含： 添加剂，其选自由以下各项组成的组：杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、额外有机肥料、生 物杀虫剂、生物杀真菌剂、生物杀线虫剂、农业或园艺佐剂、粘着剂、撒施剂、表面活性剂、分 散剂、湿润剂和UV防护剂及其混合物。
49. 如权利要求28所述的方法，其中所述肥料进一步包含： 选自由堆肥和生物炭组成的组的有机碳源。
50. 如权利要求28所述的方法，其中所述植物或植物种子选自由以下各项组成的组： 荞麦、豆类、玉米、棉花、油菜、豌豆、花生、红花、向日葵、苜蓿、三叶草、野豌豆、车轴草、黑 莓、蓝莓、醋栗果、接骨木果、醋栗、越橘、罗甘莓、树莓、草莓、葡萄、大蒜、韭菜、洋葱、青葱、 观赏球茎植物、柑橘杂种、葡萄柚、金橘、酸橙、橙子、柚子、黄瓜、甜瓜、葫芦、南瓜、南瓜、鲜 花、花坛植物和观赏植物、茄子、甜辣椒、粘果酸浆、番茄、药草、香料、薄荷、芝麻菜、芹菜、山 萝卜、菊苣、茴香、莴苣、欧芹、菊苣、大黄、菠菜、唐莴苣、花椰菜、球芽甘蓝、甘蓝、花椰菜、羽 衣甘蓝、无头甘蓝、大头菜、芥菜、芦笋、扁豆、梨、榲梓、甜菜根、甜菜、红甜菜、胡萝卜、块根 芹、菊苣、山葵、欧洲防风草、萝卜大头菜、婆罗门参、芜菁、落叶树、观赏植物、柑橘、松树、黑 麦、小麦、高粱、小米、杏、樱桃、油桃、桃子、李子、李子干、杏仁、山毛榉坚果、巴西坚果、灰胡 桃、腰果、栗子、榛子、山核桃、澳洲坚果、美洲山核桃、开心、果、核桃、马铃薯、红薯、山药、菊 芋、木薯、姜和草坪草。
51. 如权利要求28所述的方法，其中所述接触通过以下方式进行：撒播施用、落下施 用、旋转施用、液体或干式犁沟内施用、直接掺入到土壤或温室种植混合物中、喷雾施用、灌 溉、注射、喷粉、挤出、粒化、或用所述肥料涂覆所述植物或所述植物种子。
52. 如权利要求28所述的方法，其中所述植物生长增强呈更大的根群、更大的生根深 度、更大的芽群、更大的芽叶长度、增加的叶绿度、增加的产量和改善的群丛和活力的形式。
53. -种制造含有氨基酸和氨的肥料的方法，所述方法包括： 提供至少一种选自由以下各项组成的组的微生物：绿色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚 霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其组合； 提供由所述至少一种微生物施加作用以释放氮的底物；并且 在有效地使得所述至少一种微生物对所述底物施加作用并且产生含有氨基酸和氨的 液体悬浮液的条件下使所述至少一种微生物与所述底物接触。
54. -种肥料，其通过如权利要求53所述的方法来生产。
55. -种分离的绿色木霉菌株，其在编号NRRL B-50520下保藏于农业研究服务培养物 保减中心。
56. 如权利要求55所述的分离的绿色木霉菌株，其为生物学上纯的。
57. -种分离的短尾帚霉菌株，其在编号NRRL B-50521下保藏于农业研究服务培养物 保减中心。
58. 如权利要求57所述的分离的短尾帚霉菌株，其为生物学上纯的。
59. -种分离的短尾帚霉菌株，其在编号NRRL B-50522下保藏于农业研究服务培养物 保减中心。
60. 如权利要求59所述的分离的短尾帚霉菌株，其为生物学上纯的。
【文档编号】C05F11/08GK104203871SQ201280062108
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2012年11月21日 优先权日:2011年11月23日
【发明者】G·E·哈曼, X·雷 申请人:康奈尔大学