专利名称：一种洋桔梗小孢子诱导获得单倍体植株的方法
技术领域：
本发明涉及一种洋桔梗游离小孢子诱导获得单倍体植株的方法，属于花卉育种技术领域。
背景技术：
洋桔梗又名草原龙胆,为龙胆科草原龙胆属植物,花姿雅丽，花形别致，花色丰富，娇而不艳，瓶插期长、耐长途运输，茎杆光滑挺直，叶片油绿，具有较高的观赏价值和经济价值，是世界上十分流行的高档切花之一，现已跻身世界十大切花之列。
洋桔梗是异花授粉植物，容易授粉，种子量多，自交存在衰退现象，但自交系之间杂交种(F1)表现出强杂种优势，因此，国外引进洋桔梗品种F1代杂交种子后代分离严重，不能留种种植。在我国，每年都需从国外大量进口洋桔梗种苗，从而导致洋桔梗生产成本高， 为此，培育我国具有自主知识产权的洋桔梗新品种具有重大意义。
在杂种优势利用中，亲本必须是纯合的自交系，经组配后才能得到性状整齐一致具有强杂种优势的杂交种。洋桔梗采用常规的育种方法选育自交系，获得一个纯系大约需要6 8年，时间长，选择效率低，耗费大量的人力和物力，再加之洋桔梗为异花授粉，存在自交衰退现象，从而导致洋桔梗自交系的获得较困难。植物的花粉只带有一套染色体，是单倍性细胞，通过未成熟花粉(小孢子)培养可以获得单倍体植株，进而通过染色体加倍成为双单倍体材料(二倍体纯系)，一方面有利于隐性突变或基因重组性状的表达，另一方面可以直接获得纯合自交系材料，应用于组配杂交种。
通常由小孢子培养来获得纯合材料仅需要I 2年时间，大大缩短自交系选育年限，加速育种进程，提高育种效率，是现代植物育种中快速、高效的育种途径之一。国内外已有利用小孢子培养获得植物自交系的报导，但未见洋桔梗小孢子培养获得单倍体自交系的报导。
尽管洋桔梗的花药培养获得再生植株的方法已经有报导(专利号201010133937， 王丽花等，洋桔梗花药离体培养与完整植株的诱导，西南农业学报，2009，22 (5): 1424-1427)，他们实验结果表明通过花药培养获得的再生株群体的倍性组成比较复杂，以二倍体为主，单倍体所占比例较小，如何提高花药植株的单倍体再生比率须待进一步研究。 我们通过文献检索，发现通过花药培养获得的再生植株绝大部分是来自于花药壁的二倍体细胞，也有可能少量来自单倍性的花粉粒，因此，单倍体出现的频率很低，甚至没有，因而， 不能形成足够的选择群体，同时也导致再生植株混杂(混倍)，要从这样的混杂植株中再挑选出单倍体植株费工费时。由此可见，采用花药培养对洋桔梗F1代种子生产价值不大。
进一步开展洋桔梗小孢子培养技术研究，对解决我国洋桔梗杂交种子生产问题， 具有巨大的潜在商业价值，同时，单倍体植株也是进行分子标记、遗传图谱构建 、重要性状相关基因定位和分子克隆、遗传工程中遗传转化等的理想受体材料。发明内容
本发明的目的在于针对洋桔梗杂交种子后代分离严重，难于得到自交系亲本植株的技术难题，提供一种高效、实用的洋桔梗单倍体培育方法，为洋桔梗品种改良和新品种选育提供优良的亲本自交系材料，解决洋桔梗杂交种子(F1)依赖进口，鲜切花生产成本高等问题，该方法能快速稳定获得大量单倍体植株。
本发明进一步研究认为由于游离小孢子的单细胞性、单倍性及大群体等特性，使其在单倍体育种上，较花药培养具有更多的优点数量多、速度快、世代间基因型稳定，可完全避免花药壁二倍体细胞的干扰，获得完全真实的单倍体植株(可获得100%单倍体植株)， 加倍后可获得稳定的、高度纯合的二倍体纯系，为杂种优势利用提供亲本，应用于杂交制种能快速获得性状整齐具有杂种优势的F1代杂交种。
为了实现上述目标，本发明采取如下的技术方案(1)确定材料选取具有综合优良性状的杂交一代洋桔梗品种作为试验材料；(2)花蕾选取，预处理，消毒在开花初期，通过荧光染色法在显微镜下选取处于单核靠边期的花蕾，放入塑料袋中置于4°C冰箱I 3天，用洗洁精清洗花蕾表面，并用清水冲洗干净；用75%酒精消毒60sec,再用O. 1%的升萊消毒10 15 min,最后用无菌水冲洗3次后，晚干；(3)游离小孢子分离将消毒后花蕾放入含有B5培养基的研钵中研磨，混合液经400目双层漏斗过滤，收集滤液于IOmL离心管中，IOOOrpm, 5min离心,弃去上清,再加入5 8 mL B5培养基，IOOOrpm, 5min离心，清洗沉淀，重复2次，离心完毕后，加入MS液体培养基于离心管中，用血球计数器统计细胞密度，并调整密度为1. OX IO4 1. OX IO5个/mL，获得游离小孢子；所述培养基B5培养基经过装有两层微孔滤膜的塑料器过滤灭菌；MS的液体培养基MS+3%蔗糖，经121°C高压灭菌20分钟；(4)小孢子愈伤组织诱导用移液器移取ImL含有上述小孢子的液体培养基于诱导愈伤组织的MS固液双层培养基中，温度为25°C进行黑暗培养；30 40天后，形成愈伤组织， 其中，所述固液双层培养基为固体层MS +0.8%琼脂粉+3%蔗糖，液体层MS +0.1 4 mg/L KT +0.1 4 mg/L 2，4_D+3%蔗糖，固体层和液体层分别经121°C高压灭菌20分钟；(5)不定芽诱导取上述愈伤组织接种于不定芽诱导培养基MS+0.1 4 mg/L KT +0.1 O. 5 mg/L IBA，光照强度为2000Lx，光照时间为8 13小时/天，温度为22 27°C 进行培养；30 40天后可见愈伤组织上绿色球型小突起，50 60天后可见萌动的不定芽或丛生小苗。
(6)单倍性植株获得取上述不定芽或小苗转入培养基MS+1 mg/L 6-BA+O.1 mg/ L NAA,光照强度为2000Lx，光照时间为8 13小时/天，温度为22 27°C进行培养；20 30天形成完整单倍体植株；(7)再生植株倍性鉴定将根尖放入8-羟基喹啉(浓度为O. 002mol/L)中I天；用移液器取出8-羟基喹啉，用蒸馏水冲洗根尖；将冲洗好的根尖放入到卡诺`氏(无水乙醇冰醋酸 =3:1) 20 24小时，用移液器取出卡诺氏，用蒸馏水冲洗根尖，将根尖放入lmol/L的HCl 中5 20min (嫩的根尖5 IOmin,老的根尖10 20min),用蒸懼水冲洗干净,用卡宝品红染色压片；显微镜观察，确定获得染色体数目2 η =36的为单倍体植株。国外进口杂交一代洋桔梗对照植株染色体数目2 η =72 ;经鉴定的小孢子植株全为单倍体。形态学鉴定表明小孢子培养获得的单倍体植株相对于国外进口杂交一代洋桔梗对照植株株型矮小，花蕾不结实，叶片气孔小等特点。
通过本发明的方法可避免花药培养带来的二倍体再生植株的干扰，可获得大量完全真实的单倍体植株，且比率达到100%，形成足够大的选择群体，经秋水仙碱处理后可成为纯合自交系。洋桔梗纯合自交系的获得为洋桔梗品种改良和新品种选育提供有力手段，用于杂交种组配可快速筛选出优良的杂交一代(F1),为解决我国洋桔梗种子生产问题，具有巨大的潜在商业价值。
图1单核靠边期小孢子显微镜图；图2小孢子培养形成愈伤组织图；图3愈伤组织诱导萌动不定芽图；图4愈伤组织诱导丛生苗图；图5小孢子培养形成单倍体植株图；图6小孢子培养形成单倍体植株染色体显微镜图；图7国外进口杂交一代洋桔梗植株染色体显微镜图。
具体实施方式
实施例1 :雪莱(香槟色)游离小孢子诱导获得单倍体植株的方法如下(I)确定材料选取具有综合优良性状的杂交一代洋桔梗雪莱(香槟色)作为试验材料。
(2)花蕾选取，预处理，消毒在开花初期，通过荧光染色法在显微镜下选取处于单核靠边期的花蕾，放入塑料袋中置于4°C冰箱I 3天，用洗洁精清洗花蕾表面，并用清水冲洗干净；用75%酒精消毒60sec,再用O. 1%的升萊消毒10 15min,最后用无菌水冲洗3 次后，晾干。
(3)游离小孢子分离将消毒后花蕾放入含有B5培养基的研钵中研磨，混合液经 400目双层漏斗过滤，收集滤液于IOmL离心管中，IOOOrpm, 5min离心，弃去上清，再加入8 mL B5培养基，IOOOrpm, 5min离心，清洗沉淀，重复2次，离心完毕后，加入MS液体培养基于离心管中，用血球计数器统计细胞密度，并调整密度为1. OX IO4个/mL (或1. OX IO5个/ mL)，获得游离小孢子；所述培养基B5培养基经过装有两层微孔滤膜的塑料器过滤灭菌。
MS的液体培养基MS +3%蔗糖，经121°C高压灭菌20分钟。
(4)小孢子愈伤组织诱导用移液器移取ImL含有上述小孢子的液体培养基于诱导愈伤组织的MS固液双层培养基中，温度为25°C进行黑暗培养30 40天后，形成愈伤组织。其中，所述固液双层培养基的配方为固体层MS +0. 8%琼脂粉+3%蔗糖。
液体层MS+3 mg/L KT +3 mg/L 2，4-D+3% 鹿糖。
所述固体层和液体层分别经121°C高压灭菌20分钟。
(5)不定芽诱导取上述愈伤组织接种于不定芽诱导培养基MS+3mg/L KT +0.2mg/L IBA，光照强度为2000Lx，光照时间为8小时/天，温度为25°C进行培养；30 40天后可见愈伤组织上球型小突起，50 60天可见萌动的不定芽。
(6)单倍体植株获得取上述不定芽转入培养基:MS+1 mg/L 6-BA+O.1 mg/L NAA, 光照强度为2000Lx，光照时间为8小时/天，温度为25°C进行培养；20 30天形成完整单倍体植株；(7)再生植株倍性鉴定将上述完整植株的根尖放入8-羟基喹啉(O. 002mol/l)中I 天；用移液器移出8-羟基喹啉，再用蒸馏水冲洗根尖；将冲洗好的根尖放入到卡诺氏(无水乙醇冰醋酸=3:1)20 24小时，用枪取出卡诺氏，用蒸馏水冲洗根尖，将根尖放入lmol/L 的HCl中5 20min (嫩的根尖5_10min,老的根尖10_20min),用蒸懼水冲洗干净,用卡宝品红染色压片；显微镜观察，确定获得染色体数目2 η =36的单倍体植株，因国外进口杂交一代洋桔梗对照植株雪莱(香槟色)染色体数目2 η =72 ;经鉴定的小孢子获得的植株全为单倍体。形态学鉴定表明小孢子培养获得的单倍体植株相对于国外进口杂交一代洋桔梗对照植株株型矮小，花蕾不结实，叶片气孔小等特点。
实施例2 赛娜(紫色)游离小孢子诱导获得单倍体植株的方法如下(1)确定材料选取具有综合优良性状的杂交一代洋桔梗赛娜(紫色)作为试验材料；(2)花蕾选取，预处理，消毒与实施例1相同(3)游离小孢子分离与实施例1相同(4)小孢子愈伤组织诱导与实施例1相同，而固体层MS+0. 8%琼脂粉+3%蔗糖，液体层MS +2 mg/L KT +2 mg/L 2，4_D+3% 蔗糖；(5)不定芽诱导与实施例1相同，但不定芽诱导培养基MS+2mg/LKT +0. 5mg/L IBA ；(6)单倍体植株获得与实施例1相同(7)再生植株倍性鉴定与实施例1相同。但国外进口杂交一代洋桔梗对照植株为赛娜 (紫色)。
实施例3 神话(紫边)游离小孢子诱导获得单倍体植株的方法如下(1)确定材料选取具有综合优良性状的杂交一代洋桔梗神话(紫边)作为试验材料；(2)花蕾选取，预处理，消毒与实施例1相同(3)游离小孢子分离与实施例1相同。
(4)小孢子 愈伤组织诱导与实施例1相同，而固体层MS +0. 8%琼脂粉+3%蔗糖； 液体层MS +lmg/L KT +2 mg/L 2，4_D+3%蔗糖；(5)不定芽诱导与实施例1相同，但不定芽诱导培养基MS+lmg/LKT +0. 2mg/L IBA ；(6)单倍体植株获得与实施例1相同(7)再生植株倍性鉴定与实施例1相同。但国外进口杂交一代洋桔梗对照植株为神话 (紫边)。
权利要求
1.一种洋桔梗小孢子诱导获得单倍体植株的方法，其特征在于按以下步骤进行 (1)确定材料选取具有综合优良性状的杂交一代洋桔梗品种作为材料； (2)花蕾选取，预处理，消毒在开花初期，通过荧光染色法在显微镜下选取处于单核靠边期的花蕾，放入塑料袋中置于4°C冰箱I 3天，清洗花蕾表面，用酒精消毒，再用升汞消毒，最后用无菌水冲洗后，晾干； (3)游离小孢子分离将消毒后花蕾放入含有B5培养基的研钵中研磨，混合液经400目双层漏斗过滤，收集滤液于离心管中，1000rpm离心，弃去上清，再加入5 8 mL B5培养基，1000rpm离心，清洗沉淀，重复2次，离心完毕后，加入MS液体培养基于离心管中，统计细胞密度，并调整密度为1. 0X 104 1. 0 X 105个/mL，获得游离小孢子； (4)小孢子愈伤组织诱导移取ImL含有上述小孢子的液体培养基于诱导愈伤组织的MS固液双层培养基中，温度为22 27°C进行黑暗培养；30 40天后，形成愈伤组织；所述MS固液双层培养基为固体层MS +0. 8%琼脂粉+3%蔗糖，液体层MS +0.1 4 mg/L KT+0.1 4 mg/L 2，4-D+3%鹿糖，灭菌； (5)不定芽诱导取上述愈伤组织接种于不定芽诱导培养基MS+0.1 4 mg/L KT+0.1 0. 5 mg/L IBA，光照强度为2000Lx，光照时间为8 13小时/天，温度为22 27°C进行培养；30 40天后可见愈伤组织上绿色球型小突起，50 60天后可见萌动的不定芽或丛生小苗； (6)单倍体植株获得取上述不定芽或小苗转入培养基:MS+1 mg/L 6-BA+O.1 mg/LNAA，光照强度为2000Lx，光照时间为8 13小时/天，温度为22 27°C进行培养；20 30天形成完整单倍体植株； (7)再生植株倍性鉴定将上述完整植株的根尖放入浓度为0. 002mol/L的8-羟基喹啉中1天；用移液器移出8-羟基喹啉，再用蒸馏水冲洗根尖；将冲洗好的根尖放入到卡诺氏20 24小时，取出卡诺氏，用蒸馏水冲洗根尖，将根尖放入浓度为lmol/L的HCl中5 20min，用蒸馏水冲洗干净，用卡宝品红染色压片；显微镜观察，确定获得染色体数目2η =36的单倍体植株。
2.根据权利要求1所述的洋桔梗小孢子诱导获得单倍体植株的方法，其特征在于步骤(3)所述Β5培养基经过装有两层微孔滤膜的塑料器过滤灭菌。
3.根据权利要求1所述的洋桔梗小孢子诱导获得单倍体植株的方法，其特征在于步骤(3)所述MS的液体培养基为MS +3%蔗糖，并经121°C高压灭菌20分钟。
4.根据权利要求1所述的洋桔梗小孢子诱导获得单倍体植株的方法，其特征在于(4)步骤所述的固体层和液体层分别经121°C高压灭菌20分钟。
全文摘要
本发明是一种洋桔梗小孢子诱导获得单倍体植株的方法。包括以下步骤(1)确定材料；(2)花蕾选取预处理；(3)游离小孢子分离；(4)小孢子愈伤组织诱导；(5)不定芽诱导；(6)单倍体植株获得；(7)再生植株倍性鉴定确定获得单倍体植株。通过本发明的方法可避免花药培养带来的二倍体再生植株的干扰，可获得大量单性胚状体，单倍体植株比率可达到100%，形成足够大的选择群体，经秋水仙碱处理后可成为纯合自交系。洋桔梗纯合自交系的获得为洋桔梗品种改良和新品种选育提供有力手段，用于杂交种组配可快速筛选出优良的杂交一代(F1)，为解决我国洋桔梗种子生产问题，具有巨大的潜在商业价值。
文档编号A01H4/00GK103026969SQ20131001066
公开日2013年4月10日 申请日期2013年1月12日 优先权日2013年1月12日
发明者和凤美, 朱永平, 王小巧, 赵兴富 申请人:云南农业大学