专利名称：利用四倍体罗汉果雌株直接培育无籽罗汉果的技术的制作方法
技术领域：
本发明结合植物组织培养、多倍体诱导和遗传育种杂交技术，培育无籽罗汉果，属现代生物技术领域。
背景技术：
罗汉果[Siraitiagrosvenorii(Swingle)C.Jeffrey]属葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia),为多年生草质藤本植物,雌雄异株,是我国特有的经济、药用植物。罗汉果甜苷属葫 芦烷三萜类，罗汉果苷V是世界最强甜味物质之一，甜度是甜菊苷的2倍，甘草甜素的6倍，蔗糖甜度的300倍；不含热量，无任何毒副作用，适宜所有人群，特别是糖尿病、肥胖症和高血压等特殊人群，是国际公认综合性状最佳的天然功能型甜味剂。罗汉果甜苷存在于果实的果肉和果皮中，但是不含甜苷成分的种子占整果的50%，种子内的油脂增加了罗汉果甜苷提取、纯化的难度和成本。罗汉果种籽多的缺陷造成了甜苷得率低的问题，且很难通过改进提取工艺来解决，使得甜.苷价格昂贵，仅能在高端产品中使用。这一问题制约了罗汉果种植业及其加工业的发展。采用现代生物技术培育结籽减少或无籽、甜苷含量高的优良罗汉果品种对于推动罗汉果产业的发展具有里程碑意义。植物多倍体中含有较多的染色体组数，往往在体型上表现出巨大性和高抗逆境能力，而且多倍体植物在品质和生物量上，都较二倍体优越。特别是植物三倍体具有不育的特性，是解决罗汉果多籽缺陷的最有效途径。无籽罗汉果的培育，将大幅提高甜苷含量和整果利用率，有效解决甜苷价格昂贵的问题，使罗汉果更广泛的应用于饮料、食品、保健品、药品等行业。目前的无籽罗汉果技术都是用二倍体罗汉果雄株与三倍体罗汉果雌株进行杂交，获得无籽罗汉果，该技术获得的罗汉果果实严重变小、变短，目前市场上罗汉果的价格以其性状和大小来区分，因此该技术在生产中无法应用。培育果形大、甜苷含量高的无籽罗汉果是解决目前无籽罗汉果推广应用的根本方法。本发明用四倍体罗汉果雌株直接培育优质无籽的罗汉果，获得的无籽罗汉果具有果形大、甜苷含量高的特性。本发明直接将田间表型好的罗汉果雌株制成脱毒苗，省去了用其种籽萌发、鉴定雌雄才能获得罗汉果脱毒雌株的步骤，省去了一代的时间，缩短了育种周期；同时用果实较大的四倍体雌株为母本，花粉活力高的三倍体雄株为父本进行杂交，使其果实不仅表现为无籽，同时果实具有果形大且甜苷含量高的特性，解决了无籽罗汉果果形小、实际生产无法应用的问题。本发明技术获得的罗汉果果形大、甜苷含量高、整果利用率高，彻底改变了罗汉果种植业的现状，解决了罗汉果甜苷成本高难以广泛应用的难题，推动了罗汉果在食品、饮料、医药等行业的应用，加快了罗汉果产业的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种用四倍体罗汉果雌株直接培育果形大、甜苷含量高的无籽罗汉果技术。该技术利用四倍体雌株与二倍体雄株杂交，获得子代中占50%的三倍体雄株，从高度不育的三倍体雄株中筛选花粉活力高的株系，从500个株系中获得了 2个花粉活力高的三倍体雄株，与优良的四倍体雌株杂交，该技术充分结合了三倍体不育、四倍体果实增大的特性，获得的无籽罗汉果果形大且甜苷含量高。本发明提供了一种无籽罗汉果的培育方法，其特征是所述培育方法通过三倍体雄株与四倍体雌株进行杂交获得无籽罗汉果。具体地，其中所述的三倍体雄株由四倍体雌株与二倍体雄株杂交获得。更具体地，本发明 中所述的四倍体雌株通过以下步骤获得:a)选取田间表型好的罗汉果雌株茎尖，制成脱毒苗；b)将消毒完毕的罗汉果茎尖放置于MS培养基中光照培养，诱导出芽；c)用秋水仙素进行诱导培养；d)分析诱导培养后的苗，选取鉴定为四倍体的株系继续培养，即获得所述的四倍体雌株。其中，上述的罗汉果茎尖是在诱导出芽后15天左右，再切取嫩芽茎尖，用0.2%的秋水仙素诱导36-48小时，诱导后于MS培养基上继续培养。本发明还提出了一种无籽罗汉果的田间培育方法，其步骤依次如下:a)田间按罗汉果常规种植方法种植四倍体罗汉果雌株，每亩种植90-150株；b)田间种植三倍体罗汉果结实诱导雄株系，按每100棵雌株种植1-5株雄株进行配种。c)在田间三倍体雄株和四倍体雌株开花时，取三倍体雄株花粉与四倍体雌株杂交，挂果后即得到无籽罗汉果。其中，上述培育方法的特征在于:田间种植三倍体雄株与四倍体雌株种植比例为1-5:100 ;用三倍体雄株花粉与四倍体雌株杂交诱导结实；所结果实为无籽罗汉果。其中所述的三倍体罗汉果结实诱导雄株系是指从三倍体的雄株里筛选花粉诱导结实性好的雄株并扩繁产生。本发明还包含一种无籽罗汉果，由上述方法培育而成。本发明还包含一种无籽罗汉果的细胞、组织和器官，所述无籽罗汉果由上述方法培育而成。更具体的，本发明的技术方案如下:选取田间表型好的罗汉果雌株茎尖，制成脱毒苗，待脱毒苗出芽15天左右，切取嫩芽茎尖，用0.2%秋水仙素诱导染色体加倍，诱导后于MS培养基上继续培养。切取诱导25天左右的嫩芽叶片1-2片，进行细胞流式分析，重复3次以上均鉴定为四倍体的株系继续培养。将获得的表型粗壮的四倍体罗汉果雌株与品质优良的二倍体雄株杂交，秋季收获果实并将果实内种籽播种于营养钵内，45天左右，采集幼叶用流式细胞仪分析染色体倍性，并用PCR技术鉴定雌雄。将获得的三倍体雄株脱毒苗于次年春天种植，用TTC染色法选取花粉活力高的三倍体罗汉果雄株，与品质优良的四倍体雌株杂交，挂果后即得到无籽罗汉果。果实与对照相比表现为高度不育，果实内结几颗种籽至无籽，果形大、甜苷含量高。本发明与现有的无籽罗汉果技术相比具有以下优势:本发明直接用田间表型好的罗汉果雌株茎尖获得脱毒罗汉果雌株，而不是用其种籽繁殖、鉴定雌雄后获得二倍体罗汉果脱毒苗，省去了一代的时间，缩短了育种周期；用果实大的四倍体罗汉果雌株为母本，三倍体雄株为父本进行杂交，获得的无籽罗汉果果形大且甜苷含量高，克服了目前无籽罗汉果果形严重变小的问题，解决了目前无籽罗汉果不能应用于生产的根本问题；本发明获得的无籽罗汉果中罗汉果皂苷V的含量可达到3%，比二倍体罗汉果中甜苷V含量提高52%以上，且整果利用率增加45%以上。下面通过具体实施方式
，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。
图1为罗汉果细胞流式图。图2为三倍体罗汉果细胞流式图。
图3为罗汉果PCR鉴定雌雄图。图4为三倍体罗汉果花粉TTC染色图。图5为四倍体母本来源的无籽罗汉果。图6为无籽罗汉果中皂苷V含量测定HPLC图。
具体实施例方式实施例1.四倍体母本来源的高甜度无籽罗汉果培育1、取田间表型好的罗汉果雌株茎尖，流动水冲洗2h，超净台中75%乙醇消毒30s，再用0.l%HgCl2消毒5min,最后用无菌水冲洗3次。2、将消毒完毕的罗汉果茎尖放置于MS培养基中光照培养，诱导出芽。3、待出芽15天，切取嫩芽茎尖，0.2%秋水仙素诱导48小时，诱导后于MS培养基上继续培养。4、分别切取二倍体罗汉果、秋水仙素诱导30天的嫩芽叶片I片，进行细胞流式分析并且重复3次，均鉴定为四倍体的株系继续培养，二倍体、四倍体罗汉果细胞流式结果见图1。流式细胞术检测方法如下:(I)配制缓冲液:A.缓冲液I (配制后室温保存):45mmol/L MgCl2 ;30mmol/L朽1檬酸三钠；20mmol/LMOPS ；0.1% (w/v) TritonX-100 ；pH7.0。100ml 缓冲液 1:
MgCI2:0.915g
二水柠檬酸三钠:0.882g
MOPS:0.419g
TritonX-100:94ulB.PI 染液:50ug/ml PI 和 50ug/ml Rnase (RNA 酶)的缓冲液 I。
(2)取I片嫩叶，加入Iml冰冷缓冲液于培养皿，用刀片快速切碎，过40 μ m细胞过滤器到1.5ml离心管，放置冰上，500rpm离心5min，弃上清至0.1ml刻度(B卩留少量液体)，加入500ulPI染液，放置冰上，避光。用流式细胞仪进行检测。5、将获得的四倍体雌株与商品性质优良的二倍体雄株杂交，秋季收获果实并将果实内种籽播种于营养钵内，45天时采集幼叶用流式细胞仪分析其染色体倍性，三倍体罗汉果细胞流式结果见图3。同时用PCR法鉴定罗汉果雌雄。
所述PCR引物序列如SEQ ID N0.1和2所示引物Fl:5，GAGTTCAAACAAGGTCGGGGTGGGA3，(SEQ ID NO:1)引物Rl:5，GCTAAATTCCACCGCTTGCTTGCTC3’ (SEQ ID NO:2)CTAB法提取罗汉果基因组DNA方法如下:A.1//2U/3片叶在液氮中研成粉末(或用打样机)；B.将样品放入液氮冻过的EP管中，加65°C预热2XCTABlml ；C.65 O 水浴 Ih ；D.加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，离心lOOOOrpm，lOmin，取上清；E.加入等体积异丙醇，_20°C沉淀20-30min ；F.1OOOOrpm 离心 IOmin,倒掉上清，70% 乙醇，lOOOOrpm, IOmin,倒掉上清，晾干；G.加 30_50ul dd H2O 水溶解，_20°C保存;PCR扩增反应体系(20ul)如下:
权利要求
1.一种无籽罗汉果的培育方法，其特征是所述培育方法通过三倍体雄株与四倍体雌株进行杂交获得无籽罗汉果。
2.权利要求1所述的培育方法，其中所述的三倍体雄株由四倍体雌株与二倍体雄株杂交获得。
3.权利要求1或2所述的培育方法，其中所述的四倍体雌株通过以下步骤获得: a)选取田间表型好的罗汉果雌株茎尖，制成脱毒苗； b)对罗汉果脱毒苗进行多倍体诱导，并筛选出所述的四倍体雌株。
4.权利要求3所述的培育方法，其中所述的多倍体诱导是用0.2%的秋水仙素诱导36-48小时。
5.一种无籽罗汉果的培育方法，其步骤依次如下: a)田间按罗汉果常规种植方法种植四倍体罗汉果雌株，每亩种植90-150株； b)田间种植三倍体罗汉果结实诱导雄株系，按每100棵雌株种植1-5株雄株进行配种；以及 c)在田间三倍体雄株和四倍体雌株开花时，取三倍体雄株花粉与四倍体雌株杂交，挂果后即得到无籽罗汉果。
6.权利要求5所述的培育方法，其特征在于:田间种植三倍体雄株与四倍体雌株种植比例为1-5:100 ;用三倍体雄株花粉与四倍体雌株杂交诱导结实；所结果实为无籽罗汉果。
7.权利要求5所述的培育方法，其特征在于:所述的三倍体罗汉果结实诱导雄株系是指从三倍体的雄株里筛选花粉诱导结实性好的雄株并扩繁产生。
8.一种无籽罗汉果，由权利要求1-7之任一所述的方法培育而成。
9.一种无籽罗汉果的组织器官，由权利要求1-7之任一所述的方法培育而成。
10.一种无籽罗汉果的细胞， 由权利要求1-7之任一所述的方法培育而成。
全文摘要
本发明结合植物组织培养、多倍体诱导和遗传育种杂交技术，培育无籽罗汉果，属现代生物技术领域。本发明技术获得的罗汉果果形大、甜苷含量高、整果利用率高，彻底改变了罗汉果种植业的现状，解决了罗汉果甜苷成本高难以广泛应用的难题，推动了罗汉果在食品、饮料、医药等行业的应用，加快了罗汉果产业的发展。
文档编号A01H4/00GK103210835SQ201310106200
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月29日 优先权日2013年3月29日
发明者张会新, 张继贤, 王小英 申请人:怀化博雅惠农科技有限公司