一种硝酸盐转运体基因AtNRT1.1及其编码蛋白与应用的制作方法

文档序号:271773阅读:510来源:国知局
一种硝酸盐转运体基因AtNRT1.1及其编码蛋白与应用的制作方法
【专利摘要】本发明一种硝酸盐转运体基因AtNRT1.1及其编码蛋白与应用,属于植物分子生物学与转基因相关【技术领域】。以拟南芥AtNRT1.1基因T-DNA插入突变体salk_138710的纯合株系研究AtNRT1.1基因在植物耐低氮和氮素高效利用方面的功能。实验结果表明,AtNRT1.1基因敲除突变体在不添加任何外源氮素的条件下,叶色比野生型绿,根长也稍长,呈耐低氮表型;在外加0.1mM和5mM硝酸铵处理条件下,突变体根系含氮量高于野生型而地上部含氮量却显著低于野生型(P=0.0001)。说明AtNRT1.1基因对不同浓度下的氮素吸收、转运都具有重要的调控作用,预计该基因的沉默可提高植物的耐低氮能力并在植物氮素营养高效分子育种中具有较大的经济价值。
【专利说明】—种硝酸盐转运体基因AtNRTl.1及其编码蛋白与应用
所属【技术领域】
[0001]本发明属于植物分子生物学与转基因相关【技术领域】。具体为拟南芥硝酸盐转运体(Nitrate transporters, NRTs)家族关键基因AtNRTl.1在低氮胁迫下的反应和作用机理,以及该基因在营养高效植物新品种培育中的应用。
【背景技术】
[0002]氮是植物必需的营养元素之一,是植物体内蛋白质、核酸、叶绿素、酶等的组成成分。氮素供应不足会影响植物的生长发育,限制农作物的产量;而氮肥施用过量则使氮素利用率下降,不仅造成资源浪费,而且引起环境污染。通过挖掘植物自身遗传潜能,克隆耐低氮和氮素营养高效的基因,并利用转基因技术培育氮素利用效率提高的新品种是解决这一问题的重要途径之一。 [0003]拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科、芸薹属植物,它不仅是第一个完成基因组序列测定的模式植物(Athanasios Theologis.et al., Nature, 2000,408:791-826),而且具有植株小,生长周期短,种子数量多,基因组小且易于进行遗传转化,自花授粉而又易于杂交等优点。因此在植物分子生物学及转基因相关【技术领域】中,拟南芥被作为模式植物广泛加以研究和应用。
[0004]硝酸盐转运体是一类专司硝态氮吸收、运输的转运蛋白。研究发现拟南芥中存在一个由53个成员组成的NRT1基因家族。已有研究表明AtNRTl.1为双亲和性硝酸盐转运体基因(Guo Fang-qing et al.,Plant Cell,2001,13:1761-1777),参与对营养生长和生殖生长时期初生器官发育的调控。但至今还没有该基因在不同氮素浓度条件下对地上部分生长发育和氮素转运的报道。

【发明内容】

[0005]本发明提供一个拟南芥双亲和性硝酸盐转运体基因,以及该基因对不同氮素浓度的反应和生理机制。
[0006]所提供的硝酸盐转运体基因为ATNRT1.1 (AT1G12110)。
[0007]上述基因具有SEQ ID N0.1的碱基序列。
[0008]上述基因编码的蛋白质具有SEQ ID N0.2的氣基酸序列。
[0009]ATNRTl.1 基因的 T-DNA 插入突变体 salk_138710 是从 ABRC (ArabidopsisBiological Resource Center)定购获得。通过PCR鉴定获得纯合插入突变体,通过RT-PCR在mRNA水平上鉴定基因的敲除情况。
[0010]通过上述鉴定,获得ATNRTl.1基因T-DNA插入突变体salk_138710的纯合株系,并以之为材料进行不同氮素浓度处理,观察表型并拍照。然后对处理后的拟南芥幼苗进行根部及地上部含氮量的测量。
【专利附图】

【附图说明】[0011]图1显示野生型和突变体PCR和RT-PCR检测的电泳结果,结果表明所获ATNRTl.1基因T-DNA插入突变体株系salk_138710为纯合插入株系,其转录本被敲除。
[0012]图2显示野生型和突变体在无外源氮培养基上处理7天后的表型图片,结果表明突变体叶色比野生型绿且根长比野生型长,表现为耐低氮表型。
[0013]图3显示在0.1mM或5mM硝酸铵培养条件下处理3天后野生型和突变体根部和地上部含氮量差异,结果表明在0.1mM和5mM硝酸铵处理条件下,突变体根系含氮量高于野生型而地上部含氮量显著低于野生型(P = 0.0001)。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实验方法和数据进一步阐述本发明。
[0015]1.拟南芥幼苗培养:
[0016]野生型和突变体种子分别用0.5%次氯酸钠溶液浸泡消毒lOmin,消毒后的种子放入4°C冰箱春化2天后点布于含1%琼脂的MS(Murashige and Skoog)固体培养基上,置于22°C光照培养箱中萌发生长。
[0017]2.纯合突变体的鉴定:
[0018]DNA提取:所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。取约0.5g拟南芥新鲜叶片,研磨成糊状,加 400 μ 1 SDS 提取液(0.5% SDS (ff/V) ;200mM Tris-Hcl,PH = 8.0 ; 250mM NaCl ;25mM EDTA) ; 12,OOOr/min,离心3min ;取上清,加等体积异丙醇轻轻摇晃,静置30min ;13, OOOr/min,离心5min ;弃上清,用lml95%乙醇冲洗1-2次后,自然风干,加去离子水30 μ 1,4°C保存备用。
[0019]RNA提取:所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研钵、枪头、离心管等一应物品事先用1% DEPC水浸泡过夜后高温高压灭菌备用。取新鲜幼苗约lg左右,于液氮中研磨成粉状,加1ml TRIZOL提取液混匀,静置lOmin ;4°C下12,OOOr/min离心lOmin ;取上清加300 μ 1氯仿混匀,静置lOmin后4°C下12, 000r/min离心15min,样品分为3层,RNA位于上层水相中;取500 μ 1水相转移到新离心管中,加等体积异丙醇沉淀 10-20min ; 12,OOOr/min 离心 lOmin,弃上清;用 75% 酒精洗漆 1-2 次,7,OOOr/min 离心2min,晾干lmin左右,加60 μ 1无RNase水,轻轻震荡使RNA溶解,_70°C冰箱保存备用。
[0020]RT-PCR:所用反转录试剂盒(#kl621)购自 Fermentas。First strand cDNAsynthesis:管中加入 RNA1 μ 1, oligo (dT) 18primerl μ 1, RNase-free waterl μ 1,65 °C处理 5min 后迅速冰浴冷却;然后再加 5 X Reaction buffer4u 1, RibolockTM RNaseinhibitor(20u/μ 1)1 μ 1,lOmM dNTP Mix2μ 1, RevertAidTM H Minus M-MuLV ReverseTranscriptase (200u/μ 1) 1 μ 1,42°C反应 60min ;70°C终止反应 5min,产物于 _20°C冰箱保存备用。
[0021]PCR检测:所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司,引物由上海生工生物工程有限公司合成。我们设计了 2对引物,1对用于T-DNA插入检测(LP1:5 ' -TTTTGTGATATGGCTGTGCTG-3 ',RP1:5 ' -TCCGATACCTAAC GTCGTCAG-3 ')并结合T-DNA左边界通用引物LBb 1.3:5 ' -ATTTTGCCGAT TTCGGAAC-3 ',通过PCR鉴定获得纯合插入突变体。另外 1 对用于 RT-PCR 检测(LP2:5/ -ATCATACCGGGACTTCGACC-3' ;RP2:5 ' -CGGTCGGTCC ATTATTTGTC-3 ' )。PCR 反应体系如下:10Xbuffer2 μ 1,dNTP0.8 μ 1,Primer LP/RP 各 1μ 1,DNA1 μ 1,dH2014y 1,Taq 酶 0.2 μ 1。PCR 程序如下:94°C,3min ;(94°C,45sec ;58°C,45sec ;72°C,60sec) X30cycles ;72°C,5min0 产物采用 1% (ff/V)琼脂糖凝胶电泳分离,恒压100V电泳20min,用BIO-RAD凝胶成像扫描仪拍照记录检测结果。
[0022]PCR和RT-PCR检测的结果表明我们鉴定到AtNRT 1.1基因T-DNA插入突变体salk_138710的纯合插入株系,其转录本被敲除。
[0023]3.不同浓度氮素处理:
[0024]在含1%琼脂的固体MS培养基上生长5天的幼苗,转移到含有0mM、0.1mM或5mM硝酸铵的培养基上,野生型和突变体各转5-6株;22°C下光照培养7天后观察表型并拍照。除不同氮素含量外,培养基中还包括ImM KH2P04, ImM MgS04,0.25mM CaCl2,0.1mMNa-Fe-ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA),ImM KC1,30mM H3B03,5mM MnS04, ImMZnS04, ImM CuS04,0.7mMNa2Mo04 和 3 % 蔗糖,培养基用 NaOH 调 PH 值至 5.7-5.75。幼苗在22°C光照培养7天后拍照,统计含氮量等指标。
[0025]结果表明,在无外源氮素培养条件下,突变体叶色比野生型绿且根长比野生型长,表现为耐低氮表型。这说明AtNRTl.1基因被敲出后解除了其对At-NRT2.1和AtNRT3.1的抑制,低氮胁迫加强了高亲和性氮吸收的能力,增强了突变体的耐低氮能力。而含氮量测定结果表明,在0.1mM和5mM硝酸铵处理条件下,突变体根系含氮量高于野生型而地上部含氮量却显著低于野生型(P = 0.0001),说明AtNRTl.1基因被敲出后,铵态氮的存在依然能够抑制AtNRT2.1等氮转运体的吸氮能力,使得突变体的总体氮素含量低于野生型。AtNRTl.1作为双亲和性转运体不仅能够调控氮素的吸收和转运,也能够调控植株的生长发育。
【权利要求】
1.拟南芥硝酸盐转运体基因AtNRTl.1,其碱基序列如SEQ ID N0.1。
2.权利要求1所述的硝酸盐转运体基因AtNRTl.1编码的蛋白质,其氨基酸序列如SEQID N0.2。
3.权利要求1所述的硝酸盐转运体基因AtNRTl.1敲除突变体的低氮处理方法及条件。
4.权利要求1所述的硝酸盐转运体基因AtNRTl.1敲除突变体在低氮处理下所获得的表型及其相关试验数据。
5.权利要求1所述的硝酸盐转运体基因AtNRTl.1及其同源序列在制备耐低氮及氮素营养高效转基因植物中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK103642820SQ201310113427
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年4月3日 优先权日:2013年4月3日
【发明者】徐江, 徐小栋, 张少斌, 东方阳, 鲁黎明, 王西瑶, 洪雪, 麻艳超, 迟志海, 丁在松, 付金东, 赵明 申请人:中国农业科学院作物科学研究所
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