大豆转基因株系混合生根方法
【专利摘要】本发明公开了一种大豆转基因株系混合生根方法，采用含转入外源目的基因和抗性筛选基因的大豆胚尖进行筛选培养获得抗性芽及胚轴，离体培养获得生根的大豆植株。本发明的方法，以大豆遗传转化所得的带胚轴抗性芽进行离体不定根诱导，生根频率为100%，显著提高了大豆遗传转化频率，此外，本发明的方法缩短了获得转基因植株的时间跨度，所得转化植株比不带胚轴的单个抗性芽生长势更为旺盛，结荚更多，转基因子代产量更大，为进一步创造大豆新种质提供了很好的技术支持。
【专利说明】大豆转基因株系混合生根方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大豆种植，具体涉及一种大豆转基因株系混合生根方法。
【背景技术】
[0002] 大豆（Glycine Diax(MMerrill)起源于中国，是我国重要粮食作物之一，己有 五千年栽培历史，现知有1000个栽培品种。大豆含脂肪约20%，蛋白质约40%，还含有丰富的 维生素，富含营养，除供直接食用外，可作酱、酱油和各种豆制食品；茎、叶、豆柏及粗豆粉作 肥料和优良的牲畜饲料。豆粕经加工制成的组织蛋白、浓缩蛋白、分离蛋白和纤维蛋白等是 多种产品，如人造肉、干酪素、味精及造纸、塑胶工业、人造纤维、火药等的原料。豆油除主要 供食用外，并为润滑剂、油漆、肥皂、瓷釉、人造橡胶、防腐剂等重要原料。此外药用有滋补养 心、祛风明目、清热利水、活血解毒等功效（韦直等，中国植物志，北京：科学出版社，1995， 234-236)，因此大豆具有重要的研究价值。
[0003] 1952年，中国大豆总产为952 X 104t，人均占有量约25kg，2003年大豆总产量超过 1.539X107t，但因人口增加，人均占有量下降到11.8kg。随着国民经济的发展和人民生活 水平的提高，加工业、食品业和畜牧业的发展，对大豆的需求急剧增加，大豆供求矛盾日益 突出。目前扩大大豆种植的潜力是有限的，而提高单产还有很大的空间和潜力（赵团结等， 中国农业科学，2006,39(1) :29-37)。
[0004] 大多数基因型的大豆都来源于同一祖先，因此常规育种方法对扩大大豆产量的帮 助是很有限的（Hiromoto 等，Brazil Journal of Geneticsl986, 2:295_3〇6)，但是通过先 进的离体培养技术和基因技术可以为优化大豆种质资源，为提高抗病虫害能力提供了关键 性的技术帮助。
[0005] 目前，尽管大豆的胚尖和子叶节两个受体系统的再生频率很高，但大豆的转基因 频率偏低，一般低于 2%(Cao 等，Plant Cell Tissue and Organ Culture2009, 96:45-52)。 主要原因是转基因大豆抗性芽经过长时间筛选压后长势弱化，离体生根能力下降，不定根 的长势相对弱化。
[0006] 因此，本领域尚需提供一种新型的生根方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种全新的高效离体生根方法一带胚轴生根法。
[0008] 本发明的第一方面，提供一种大豆生根方法，包括以下步骤：
[0009] (a)提供一转入外源目的基因和抗性筛选基因的大豆胚尖；
[0010] (b)对步骤a)所述胚尖，在针对所述抗性筛选基因的第一筛选压力条件下，进行 筛选培养，获得抗性芽及胚轴；
[0011] (C)将步骤b)获得的所述抗性芽及胚轴，在针对所述抗性筛选基因的第二筛选压 力条件下，在进行筛选培养6-20天；
[0012] (d)将经步骤c)筛选培养后的所述抗性芽及胚轴，进行生根培养直至所述胚轴下 端长出根系。
[0013] 在另一优选例中，所述的第二筛选压力<第一筛选压力。
[0014]在另一优选例中，在步骤（d)中，所述的生根培养在第三筛选压力下进行。
[0015]在另一优选例中，所述的第三筛选压力 <第二筛选压力;^第一筛选压力。
[0016]在另一优选例中，所述的第三筛选压力;^第二筛选压力 <第一筛选压力。
[0017]在另一优选例中，所述的第三筛选压力<第一筛选压力；且第二筛选压力< 第一 筛选压力。
[0018]在另一优选例中，所述的第三筛选压力< 1/2的第一筛选压力；且第二筛选压力 彡1/2的第一筛选压力。 '
[0019] 在另一优选例中，所述的外源目的基因和抗性筛选基因位于同一质粒上。
[0020] 在另一优选例中，所述的外源目的基因和抗性筛选基因位于农杆菌质粒上。
[0021] 在另一优选例中，所述的农杆菌质粒为PCAMBIA2301。
[0022] 在另一优选例中，所述的抗性芽及胚轴是一体的。
[0023] 在另一优选例中，所述抗性筛选基因是卡那霉素抗性基因。
[0024]在另一优选例中，所述抗性筛选基因是卡那霉素抗性基因，所述第一筛选压力为 50-150mg_ 171的卡那霉素浓度。
[0025]在另一优选例中，所述抗性筛选基因是卡那霉素抗性基因，所述第二筛选压力为 3〇-80mg. L-1的卡那霉素浓度。
[0026]在另一优选例中，所述抗性筛选基因是卡那霉素抗性基因，所述第三筛选压力为 3O-SOmg. L-1的卡那霉素浓度。
[0027]在另一优选例中，采用根癌农杆工程菌浸染大豆胚尖获得所述转入外源目的基因 和抗性筛选基因的大豆胚尖，其中，所述根癌农杆工程菌经以下步骤获得：
[0028] 从含卡那霉素的YEP培养平板上挑取含有质粒pCAMBIA2301的根癌农杆菌单菌落 接种于含有45-55mg. L-1利福平和45-50mg. I/1卡那霉素的YEP液体培养基培养，经活化后 离心分离，收集菌体，重悬于液体MS基本培养基中，其中，
[0029] 所述质粒pCAMBIA2301带有CaMV35S启动的￠-葡萄糖苷酸酶（gus)基因和 CaMV35S启动的新霉素转移酶（npt II )基因。
[00(30] 在另一优选例中，所述步骤b)将所述胚尖置于含〇? 25_35mg. L-1GAUSO-SSOmg. L-1 替卡西林及50-150mg. L-1卡那霉素的MS基本培养基或MSB5培养基中筛选培养6-25天， 15-18h/d光照，温度为24_26°C。在另一优选例中，在MSB5培养基中筛选培养。
[0031] 在另一优选例中，所述步骤c)中，将所述抗性芽及胚轴含置于50-150mg. I71替卡 西林，3〇-8〇mg. L_1卡那霉素的1/8MS基本培养基或1/8MSB5培养基中，于14-18h/d光照， 25±1°C条件下进行筛选培养。在另一优选例中，在1/8MSB5培养基中筛选培养。
[0032] 在另一优选例中，所述步骤d)包括二个子步骤：
[0033] (dl)将经步骤c)筛选培养后的所述抗性芽及胚轴进行生根培养至所述胚轴下端 发根；
[0034] (d2)将经步骤dl)生根培养后的所述抗性芽及胚轴进行培养至所述胚轴长出 10-15cm 根系。
[0035] 在另一优选例中，所述步骤dl)中，将所述抗性芽及胚轴置于含0.5-1.5mg. L_1IBA (吲哚丁酸），5〇-l5〇mg. I/1替卡西林，30-8〇mg. L_1卡那霉素的1/4MS基本培养基或 1/4MSB5培养基中于14_18h/d光照，25土 1°C条件下生根培养；和/或
[0036] 所述步骤d2)中，将所述生根培养后的所述抗性芽及胚轴转接到含〇. 5-1. 5mg. L-1IBAjO-I5Omg. L-1替卡西林，3〇-8〇mg_厂1卡那霉素的IAMS基本培养基或1/2MSB5培养 基中于14-18h/d光照，25土1°C条件下培养。
[0037] 在另一优选例中，所述步骤dl)中在1/4MSB5培养基中进行生根培养。
[0038] 在另一优选例中，所述步骤dl)中在1/2MSB5培养基中进行培养。
[0039] 本发明的第二方面，提供一种转基因大豆种子的制备方法，包括以下步骤：
[0040] ⑴种植多个大豆转基因株系至结荚，其间，进行叶片⑶S染色、PCR检测及 Southern blot 检测；
[0041] (ii)取GUS染色、PCR检测及Southern blot检测为阳性的转基因株系，收获并保 存种子，为TO代转基因大豆种子；以及任选地，
[0042] (iii)种植所述TO代种子，苗期进行GUS染色、PCR检测，收获并保存结果均为阳 性的株系的种子，为n代转基因大豆种子；以及任选地，
[0043] (iv)种植所述Tl代种子，苗期进行GUS染色、PCR检测，收获并保存结果均为阳性 的株系的种子,为T2代转基因大豆种子。
[0044]其中，所述大豆转基因株系来源于同一个由第一方面所述的方法获得的生根胚 轴。
[0045] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图 1 示出质粒 pCAMBIA2301 的 T-DNA 区。
[0047] 图2不出大显胚尖长出的抗性芽，bar=lcm。
[0048] 图3不出大伸长的抗性芽，bar=lcm。
[0049] 图4示出大豆生根的转基因植株，bar=2cm。
[0050]图5示出大豆结荚的转基因植株，两个抗性芽形成两个株系：系1和系2， bar=5cm〇
【具体实施方式】
[0051]本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次使用根癌农杆菌转化方法获得大量 抗性芽，并改进传统的大豆转基因抗性芽的离体生根方法，创造出一种全新的高效离体生 根方法一带胚轴生根法，获得了大量的大豆转基因植株苗并开花结荚。在此基础上，完成了 本发明。
[0052] 培养基
[0053] MS ?养基或称为MS基本培养基（Murashige and Skoog，简称MS培养基），是指 Murashige的经典培养基（Murashige et al. 1962)。采用本领域已知的配方配制MS培养 基即可。
[0054] MSB5培养基包含MS基本培养基的大量和微量元素 （Murashige et al. 1962)，有 机部分为B5培养基的有机成分，即溶液（肌醇100mg/L，烟酸lmg/L，盐酸吡哆醇lmg/L，盐 酸硫铵10mg/L。具体地，MSB 5培养基包含0? 5%B5培养基的有机成分（肌醇l〇〇mg/L，烟酸 lmg/L，盐酸批卩多醇lmg/L，盐酸硫铵10mg/L)、3%的蔗糖、0? lmg. L-1肌醇、0? 7%琼脂,调节pH 至5. 8,121 °C灭菌15-25分钟后使用。
[0055] 将MS基本培养基或MSB5培养基中大量元素的含量减少至原含量的1/8,得到 1/8MS基本培养基或1/8MSB5培养基。将MS基本培养基或MSB5培养基中大量元素的含量 减少至原含量的1/4,得到1/4MS基本培养基或1/4MSB5培养基。将MS基本培养基或MSB5 培养基中大量元素的含量减少至原含量的1/2,得到1/2MS基本培养基或1/2MSB5培养基。 其中，大量元素是指硝酸钾KN0 3、硝酸铵NH4N03、磷酸二氢钾KH2P04、硫酸镁MgSO 4. 7H20和氯 化钙CaCl2. 2H20等五种化合物中的金属元素。1/2MS基本培养基或1/2MSB5培养基即是 指将培养基中硝酸钾KN0 3、硝酸铵NH4N03、磷酸二氢钾KH2P04、硫酸镁MgSO 4. 7H20和氯化钙 CaCl2. 2H20等五种化合物质量减半。
[0056] YEP培养基也是一种常用的培养基，其中，所述YEP配体培养基的配方：蛋白胨 (tryptone)10g/L,酵母提取物（yeast extract) 10g/L，NaC110g/L，溶剂为水。若配成 YEP 培养平板（YEP固体培养基），在高压灭菌前加适量琼脂（如20g/L)。
[0057] 本发明所用的感染液培养基没有特别的限制，有助于农杆菌感染外植体的感染液 均可用于本发明，如包含诱导培养基NB、乙酰丁香酮（80-120mol/L)、葡萄糖（30-40g/L)的 感染液培养基。
[0058] 根癌农杆菌及其工程菌
[0059] 根癌农杆菌（农杆菌，Agrobacterium tumefaciens)是一种能诱发植物产生肿瘤 的细菌。农杆菌普遍存在于土壤中，为革兰氏阴性细菌，能在自然条件下趋化性地感染大多 数双子叶植物的受伤部位，并诱导长生冠瘿瘤或法状根。
[0060] 本发明的一优选例中，对农杆菌进行改造，将带有CaMV35S启动的0 -葡萄糖苷酸 酶（gus)基因和CaMV35S启动的新霉素转移酶（npt II )基因的质粒PCAMBIA2301导入到 农杆菌中，经筛选得到根癌农杆菌工程菌，用以浸染胚尖。其中，质粒pCAMBIA-2301是常用 于植物表达的载体（如参见CN102337291A)，可在在农杆菌里复制，该载体特性有大肠杆菌 卡那霉素抗性；植物卡那霉素选择标记；含有报告基因 GUS。
[0061] 生根方法
[0062] 本发明的生根方法，包括以下步骤：
[0063] (a)提供一转入外源目的基因和抗性筛选基因的大豆胚尖；
[0064] (b)对步骤a)所述胚尖，在针对所述抗性筛选基因的第一筛选压力条件下，进行 筛选培养，获得抗性芽及胚轴；
[0065] (C)将步骤b)获得的所述抗性芽及胚轴，在针对所述抗性筛选基因的第二筛选压 力条件下，在进行筛选培养6-20天；
[0066] (d)将经步骤c)筛选培养后的所述抗性芽及胚轴，进行生根培养直至所述胚轴下 端长出根系。
[0067] 本发明的一优选例中，所述步骤a)中采用以下步骤获得所述胚尖：
[0068] (al)提供无菌的大豆种子，米用无菌水浸泡吸胀后，剥出胚尖进行培养；
[0069] (b 1)将经步骤al)培养后的胚尖在含根癌农杆工程菌的培养液中浸染，获得转入 外源目的基因和抗性筛选基因的大豆胚尖。
[0070] 在另一优选例中，所述步骤a)还包括（Cl)将经步骤bl)浸染的胚尖进行培养的 步骤D
[0071] 在另一优选例中，所述步骤Cl)中将胚尖置于铺有滤纸的MS基本培养基或MSB5 培养基(较佳地，为MSB5培养基）中于24-26°C避光培养4-5天。在另一优选例中，所述胚 尖经浸染后，置于无菌滤纸上吸干菌液，然后放置于滤纸上培养。在另一优选例中，所述MS 基本培养基中含3mg. L_16-BA，200uM AS。
[0072] 在另一优选例中，所述步骤（al)中将大豆种子用70-80(w/v)%酒精做表面消毒， 然后用0? 1-0. 2 (w/v) %氯化汞摇洗所述大豆种子，无菌水冲洗，再用10-15 (w/v) %次氯酸钠 摇洗，无菌水冲洗后用无菌水浸泡。
[0073] 在另一优选例中，所述步骤（al)中选取粒大、饱满的成熟大豆种子，将大豆种子 用70-80%酒精做表面消毒，然后用〇? 1-〇_ 2%氯化汞摇洗所述大豆种子6-8分钟，无菌水冲 洗5-8次,再用10-15%次氯酸钠摇洗5-6分钟，无菌水冲洗5-8次后用无菌水浸泡，于4°C 冰箱保存。
[0074] 在另一优选例中，所述步骤（al)中将所述胚尖放入MS基本培养基或MSB5培养基 (较佳地，为MSB5培养基）于16±4h/d光照，温度为25± 1°C条件下培养3-5天。在另一优 选例中，所述MS基本培养基或MSB5培养基中含3 ± lmg. Ll-BA (6-苄氨基腺嘌呤）。
[0075] 在另一优选例中，所述根癌农杆工程菌经以下步骤获得：
[0076] 从含卡那霉素的YEP培养平板上挑取含有质粒pCAiffiIA2301的根癌农杆菌单菌 落接种于含有45-55mg. I71利福平和妨-50mg. L-1卡那霉素的YEP液体培养基培养，经活化 后离心分离，收集菌体，重悬于液体MS基本培养基或MSB5培养基(较佳地，为MSB5培养基） 中，其中，
[0077] 所述质粒pCAMBIA2301带有CaMV35S启动的葡萄糖苷酸酶（gus)基因和 CaMV35S启动的新霉素转移酶（即t II )基因。
[0078] 在另一优选例中，所述YEP培养平板含卡那霉素（Kanamycin)，含量为40-60mg/L， 较佳地为50mg/L。
[0079] 在另一优选例中，所述活化包括两次活化，第一次活化是指挑取含有质粒 PCAMBIA2301的根癌农杆菌单菌落接种于含有45-55mg. L_1利福平和45-50mg. L-1卡那霉素 的YEP液体培养基培养，28°C摇床，250rpm震荡6-8小时；所述第二次活化是指取l-5ml经 第一次活化得到的菌液在5〇ml YEP液体培养基中继续培养，条件为28°C摇床，250rpm震荡 6-8小时。
[0080] 在另一优选例中，所述离心是在4000-5000rpm，0-4°C离心5-10分钟。
[0081] 在另一优选例中，所述液体MS基本培养基或MSB5培养基内含3mg. L W-BA，200uM 乙酰丁香酮（AS)。
[0082] 在另一优选例中，所述浸染的条件为在27-30°C于200-300rpm浸染2〇_ 3〇min。
[0083] 在另一优选例中，所述步骤b)将所述胚尖置于含〇? 25_35mg. L-1GAU5OISOmg. L_1 替卡西林及50-150mg. L_1卡那霉素的MS基本培养基或MSB5培养基(较佳地，为MSB5培养 基)中筛选培养6-25天，15-18h/d光照，温度为24-26°C。较佳地，所述步骤b)将所述胚尖 置于含0. 3mg. L-1GAdOOmg. L-1替卡西林及l〇〇mg_ L4卡那霉素的MS基本培养基中筛选培养 6- 25天，16h/d光照，温度为料-26°C。
[0084] 在另一优选例中，将所述胚尖用400mg_ I/1替卡西林（ticarcilin)无菌溶液进行 抑菌处理，用无菌滤纸吸千水分再进行所述筛选培养。在另一优选例中，进行所述筛选培养 7- 10天后，携带了外源基因的抗性胚尖长出2-3个抗性芽，又约12-18以后，抗性芽继续伸 长长出主莖。
[0085] 在另一优选例中，所述步骤c)中，将所述抗性芽及胚轴含置于SO-I5Omg.!/1替卡 西林，30-80mg. L 1卡那霉素的1/8MS基本培养基或1/8MSB5培养基(较佳地，为1/8MSB5 培养基）中，于14-18h/d光照，25土 1°C条件下进行筛选培养。较佳地，所述步骤c)中，将 所述抗性芽及胚轴含置于IOOmg. I/1替卡西林，50mg. L_1卡那霉素的1/SMS基本培养基或 1/8MSB5培养基(较佳地,为1/8MSB5培养基）中，于l 6h/d光照，25±1°C条件下进行筛选培 养。
[0086] 在另一优选例中，所述步骤c)中所述筛选培养的时间为7-10天。
[0087] 在另一优选例中，所述步骤b)中筛选压为50_150mg. L/1卡那霉素，所述步骤c)中 筛选压减半。
[0088] 在另一优选例中,所述步骤d)包括二个子步骤：
[0089] (dl)将经步骤c)筛选培养后的所述抗性芽及胚轴进行生根培养至所述胚轴下端 发根；
[0090] (d2)将经步骤dl)生根培养后的所述抗性芽及胚轴进行培养至所述胚轴长出 10-15cm 根系。
[0091] 在另一优选例中，所述步骤dl)中，将所述抗性芽及胚轴置于含〇. 5-1. 5mg. IZ1IBA (吲哚丁酸），50-150mg. L1替卡西林，30-80mg. L_1卡那霉素的1/4MS基本培养基或 1/4MSB5培养基(较佳地，为1/4MSB5培养基)中于14-18h/d光照，25 土 1°C条件下生根培养。 较佳地，所述步骤dl)中，将所述抗性芽及胚轴置于含lmg. L1IBA (吲哚丁酸），IOOmg. L1替 卡西林，50mg. L/1卡那霉素的1/4MS基本培养基或1/4MSB5培养基(较佳地，为1/4MSB5培 养基）中于16h/d光照，25 土 1°C条件下生根培养5-6天。
[0092] 在另一优选例中，所述步骤d2)中，将所述生根培养后的所述抗性芽及胚轴转接 到含〇? 5-1_ 5mg_ L_1IBA，50-150mg_ L-1替卡西林，30-80mg. L-1卡那霉素的1/2MS基本培养基 或1々MSB5培养基(较佳地，为1/2MSB5培养基）中于14-18h/d光照，25±1°C条件下培养。 较佳地，将所述生根培养后的所述抗性芽及胚轴转接到含lmg. L_1IBA, IOOmg. L_1替卡西林， 50mg. 171卡那霉素的1/2MS基本培养基或1/2MSB5培养基(较佳地，为1/2MSB5培养基）中 于16h/d光照，25土 rc条件下培养。
[0093]在另一优选例中，所述步骤d2)中，培养8-15天，抗性芽随同胚轴生根，平均每个 胚轴10-15cm长的根系。
[0094] 在本发明的一优选实施方式中，大豆生根方法包括以下步骤：
[0095] (a'）提供无菌的大豆种子，采用无菌水浸泡吸胀后，剥出胚尖进行培养；
[0096] (b'）将经步骤a'）培养后的胚尖在含根癌农杆工程菌的培养液中浸染；
[0097] (c'）将经步骤b'）浸染的胚尖进行培养；
[0098] (d'）将经步骤C'）培养后的胚尖进行筛选培养，获得抗性芽及胚轴；
[0099] (e'）将步骤d'）获得的所述抗性芽及胚轴进行筛选培养；
[0100] (f'）将经步骤e'）筛选培养后的所述抗性芽及胚轴进行生根培养至所述胚轴下 端发根；
[0101] (g'）将经步骤f'）生根培养后的所述抗性芽及胚轴进行培养，所述胚轴长出 10-15cm 根系。
[0102] 转基因大豆种子的制备方法
[0103] 本发明还提供一种转基因大豆种子的制备方法，包括以下步骤：
[0104] (i)种植多个大豆转基因株系至结荚，其间，进行叶片GUS染色、PCR检测及 Southern blot 检测；
[0105] (ii)取GUS染色、PCR检测及Southern blot检测为阳性的转基因株系，收获并保 存种子，为TO代转基因大豆种子；以及任选地，
[0106] (iii)种植所述TO代种子，苗期进行GUS染色、PCR检测，收获并保存结果均为阳 性的株系的种子，为Tl代转基因大豆种子；以及任选地，
[0107] (iv)种植所述Tl代种子，苗期进行GUS染色、PCR检测，收获并保存结果均为阳性 的株系的种子，为T2代转基因大豆种子。
[0108] 其中，所述大豆转基因株系来源于同一个由本方法获得的生根胚轴。
[0109] 在另一优选例中，所述步骤i)将已生根的在一个胚轴上的多个大豆转基因株系 移栽到土壤，所述土壤的基质为拟南芥种植基质，其中泥炭6重量份、珍珠岩3重量份、蛭石 1重量份,事先12 rc灭菌60-120分钟。
[0110] 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示 的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特 征的一般性例子。
[0111] 本发明的有益之处在于：
[0112] ⑴所有的抗性芽得以离体生根，生根频率为100% ;
[0113] (2)将一个胚轴上的所有抗性芽进行移栽，存活后检测，显著提高了大豆遗传转化 频率；
[0114] ⑶缩短了获得转基因植株的时间跨度，缩短了 1-2个月；
[0115] (4)所得转化植株比不带胚轴的单个抗性芽生长势更为旺盛，结荚更多，转基因子 代产量更大，转基因植株结实率提高150%。
[0116] (5)使得大豆遗传转化的受体品种依赖性减小。Ko6-82,北豆21、北豆8731等受 体品种的平均转化效率提高15%。
[0117] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，I989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0119] 通用方法
[0120] (1)转化植株的⑶S基因的组织化学检测（⑶S检测）
[0121] 按照Jefferson等（1987)的方法，取共培养l-5d的下胚轴切段、在筛选培养基上 生长的抗性愈伤组织和抗性植株的针叶，分别浸入到X-Gluc溶液（含Na2EDTA10mmol/l，磷 酸缓冲液lOOmmol/1，pH7. 0,亚铁氰化钾0. 5mmol/l，高铁氰化钾0. 5mmol/l，20%甲醇（V/ V)和0_1%X-Gluc(W/V))中，37°C保温过夜。洗涤后组织转入95%乙醇中脱色，观察染色情 况。
[0122] (2) PCR 检测
[0123] PCR 扩增 npt II 基因的引物为：P1 (5, -TGC GCT GCG AAT CGG GAG CG-3'）和 P2 (5'-GAG GCT ATT CGG CTA TGA CT-3'），可扩增出 7IObp 的 PCR 产物。PCR 扩增 gus 基 因的引物为：P3 (5'-CGA CGG CCT GTG GGC ATT CA-3'）和 P4 (5,-TGGTCG TGC ACC ATC AGC AC-3'），可扩增出900bp的PCR产物。每个反应体积为50U 1，其中上下游引物各0. 4uM， 4 种 dNTP 各 200 u M，10 X buffer5 u I，Taq DNA 聚合酶 2U，最后加水至 50 u 1。PCR 反应条 件：94°C预变性5min ;然后94°C变性lmin，54°C复性lmin，72°C延伸lmin，共35个循环；最 后，72°C延伸7min。5-10 u I PCR产物经1. 2%琼脂糖凝胶电泳分离，观察拍照。
[0124] (3)转化植株的Southern blot分析
[0125] DNA片段向杂交膜的转移（碱法转移）和固定
[0126] 对PCR阳性的转化植株和未转化植株每个样品各取40 Hg DNA经HindIII完全消化 后，在含EB的0? 8%琼脂糖凝胶上，小于lV/cm电泳过夜。在紫外下观察酶切及电泳效果， 拍照记录。凝胶切去无用部分，切去一角作为标记。在数倍体积碱性转移液（0.4M NaOH, 1 M NaCl)中浸泡lh，不断温和振，其间更换碱性转移液一次。通过毛细管作用把DNA片段转 移到Hybond-N+上，转移缓冲液为上述碱性转移液。
[0127] DNA转移完全后，在数倍体积中和缓冲液（0? 5M Tris-HCl (pH7. 2)，IM NaCl)中轻 摇中和30min，其间更换一次中和液。将尼龙膜在80°C烤箱中烘烤2h，固定DNA。尼龙膜冷 至室温，用保鲜膜包裹，4°C保存备用。
[0128] 探针DNA的标记
[0129] 以常规的pCAMBIA2301为模经PCR扩增的叩t II基因片段（710bp)和gus基 因片段（9IObp)。采用随机引物法（Takara试剂盒）用[a -32P] dCTP进行探针标记。
[0130] Southern blot
[0131] 用2XSSC溶液（上海宝曼生物科技）湿润尼龙膜。将尼龙膜装入盛有适量 (200u 1/cm2)预杂交液（6XSSC，5XDenhardt，s，0. 5%SDS, IOOii g/ml 变性鲑鱼精子 DNA， 50%甲酰胺）的杂交管中，使尼龙膜展开紧贴于管壁，盖紧杂交管，42°C预杂交4h。
[0132] 将探针置于加热平台95°C加热5min，迅速置冰浴中5min。
[0133] 取下杂交管，更换预杂交液，将变性后的探针加入预杂交液中,杂交炉内65 °C旋转 杂交24h。
[0134] 倒出放射性杂交液，取出尼龙膜，迅速置洗膜液I (2XSSC，0.5%SDS)中，室温下 漂洗5min。
[0135] 将膜转入洗膜液II (2XSSC，0. 1%SDS)中，室温下漂洗15min。
[0136] 将膜转入洗膜液III (〇. I XSSC，0. 5%SDS)中，杂交炉中37°C旋转洗膜3〇min。 t〇137] 将膜转入新鲜洗膜液HI中，杂交炉中68°C旋转洗膜30min。
[0138]从杂交管中取出尼龙膜，用〇. IXSSC室温短暂漂洗尼龙膜，滴尽多余液体后用保 鲜膜包好。
[0139] 压X-光片，-70°C放射自显影3d。
[0140] 实施例1
[0141] 根癌农杆菌工程菌的构建
[0142] I. 1菌株和质粒
[0143] 供试菌株：EHA105(农杆碱型）、LB4404(章鱼碱型）和GV3301 (胭脂碱型）。
[0144] 质粒：pCAMBIA2301。该质粒带有CaMV35S启动的P -葡萄糖苷酸酶（gus)基因和 CaMV35S启动的新霉素转移酶（npt II )基因，如图1所示。
[0145] 1.2.质粒载体导入根癌农杆菌及其鉴定
[0146] 参考Hofgen和Willmitzel (1988)的冻融法直接将质粒pCAMBIA2301导入上述三 个农杆菌菌株中。小量制备质粒DNA进行鉴定，具体步骤如下：
[0147] (1)根癌农杆菌生长于含有50mg/l利福平的YEP固体平板上，任挑一单菌落接入 5ml YEP液体培养基中于28°C，200rpm振摇培养过夜。
[0148] (2)按1%接种量将上述菌液接种入50ml新鲜的YEP液体培养基中，28°C， 2OOrpm 振摇培养至对数生长期。
[0149] (3)4000rpm，4°C离心IOmin收集农杆菌菌体，菌体用5ml预冷的TE(pH7_ 5)洗涤 一次，加入5ml新鲜的YEP液体培养基重新悬浮。
[0150] (4)取2OOil 1分装于I. 5ml的Eppendorf管中，液氮速冻后于-70°C保存备用。
[0151] (5)直接取步骤3中菌液200w 1 (或取一管冻存细胞，冰上化冻后）加入Iug质 粒DNA混匀，然后依次于冰浴上、液氮和37°C水浴中各放置5min。
[0152] (6)用新鲜的YEP液体培养基稀释至1ml，于28°C振摇培养4小时。
[0153] ⑵取200 y 1涂布于含卡那霉素 lOOmg/1的YEP固体培养基，28°C培养2-3天。
[0154] (8)生长的菌落在相应的YEP固体平板上划分单菌落，重复3次。
[0155] (9)随机挑选2个单菌落，用试剂盒小量制备质粒DNA。
[0156] (1〇)用氯化钙法将质粒DNA转化入常规的大肠杆菌E. coli DH5 a中。
[0157] (11)再随机挑取2个DH5 a转化菌落，用试剂盒小量制备质粒DNA后进行酶切鉴 定，结果为所需。
[0158] 1.3工程菌菌液制备
[0159] 经活化的农杆菌以每管200 分装后于-7(TC备用。感染前1-2d取出农杆菌，在 冰上接种于100mg/l卡那霉素的YEP固体培养基中，28。(：暗培养l-2d后挑取单菌落，重新 接种于含100mg/l卡那霉素的5ml YEP液体培养基，28°C摇床培养过夜，然后菌液转至50ml 新鲜的上述YEP液体培养基中摇至对数生长期，4°C、4000rpm离心5min后收集菌体，再用洗 涤并收集菌体，最后将农杆菌悬浮于加乙酰丁香酮（AS)的感染液培养基中备用。
[0160] 实施例2
[0161] 抗性芽带胚轴离体生根
[0162]选取粒大、饱满的成熟大豆种子,将所得的种子用70%酒精做表面消毒，然后将种 子倒入无菌三角瓶中用〇? 1%升萊摇洗6-8分钟，无菌水冲洗5_8次，再用10%次氯酸钠 (NaClO)摇洗5-6分钟，无菌水冲洗5-8次后用无菌水浸泡于4°C冰箱。
[0163] 待到种子充分吸胀后，在无菌条件下将种子从三角瓶中取出，剥出胚尖，放入MSB5 培养基（内含3mg.L 6-BA)中了页培养3-5天。培养条件：l6h/d光照,25±1°C。
[0164] 将预培养后的大豆胚尖在实施例1制备的根癌农杆菌工程菌中浸染30分钟；浸染 条件：28°C 摇床，250rpm。
[0165] 无菌条件下将浸染后的胚尖取出，置于无菌滤纸上吸干菌液，然后放置于铺有滤 纸的MSB5培养基（含 3mg. Ll-BA，2OOuM AS)中（胚尖置于滤纸上）共培养4-5天；培养 条件：暗中，25±1°C。
[0166] 随后，将胚尖用400mg. I71替卡西林（ticarcilin)无菌溶液抑菌，用无菌滤纸吸干 水分后置于MSB5培养基（含0. 3mg_ L 1GA, 200mg. L-1替卡西林，IOOmg. L-1卡那霉素）中筛 选培养；培养条件：16h/d光照，25 土 1°C。
[0167] 7-10天后，携带了外源基因的抗性胚尖长出2-3个抗性芽，如图1所示，又约丨5天 以后，抗性芽继续伸长长出主茎，如图2所示。
[0168] 将抗性芽和胚轴先置于1/8MSB5培养基（含lOOmg. L/1替卡西林，50mg. L-1卡那霉 素）中，筛选压减半；培养条件：16h/d光照,25±1°C。培养7-10天。
[0169] 然后抗性芽和胚轴置于1/4MSB5培养基（含lmg. L_1IBA，IOOmg. L-1替卡西林， 50mg. I71卡那霉素）中生根培养5_6天，筛选压减半，胚轴下端出现发根迹象；培养条件： 16h/d 光照，25±1°C。
[0170] 将发根的植株转接到V2MSB5培养基（含lmg. L-1IBA, IOOmg. L-1替卡西林，50mg. r1卡那霉素）中培养10天左右，培养条件：16h/d光照，25±1°C。结果表明，采用实施例 1制备的各种根癌农杆菌工程菌处理胚尖后，得到的所有的抗性芽随同胚轴生根，生根频率 为100%，平均每个胚轴10-15on长的根系，如图3所示。
[0171] 实施例3
[0172] 转基因大豆种子 t〇173] 将实施例2获得的已生根的在一个胚轴上的多个大豆转基因株系移栽到土壤，基 质为拟南芥种植基质（其中泥炭6重量份，珍珠岩3重量份，蛭石1重量份，事先121°C灭菌 60-120分钟）。其中，将一个胚轴上的单个芽命名为一个转基因株系（即若一个胚轴上有 三个抗性芽，则分别命名为Iinel (系l)、line2(系2)、line3(系3))。
[0174] 在人工气候室中，约20-25天后多个转基因植株苗开花结荚,如图4所示。
[0175]期间，取不同株系的幼嫩叶片做⑶S染色，再取⑶S染色阳性的株系进行PCR检 狈!|。然后GUS、PCR阳性植株进行Southern blot检测，保留上述三种检测结果为阳性的转 基因植株，收获并保存转基因大豆种子（T0代种子）。
[0176] 播种TO代种子，苗期进行GUS和PCR检测，收获其中阳性株系,并收获Tl代种子。 [0177] 播种Tl代种子，苗期进行GUS和PCR检测，保留其中阳性株系,收获T2代转基因 株系中的纯系，并保种。
[0178] 重复三次试验，累计从150个胚轴获得大豆植株系72个,PCR和Southern blot检 测阳性株系40个,转化效率为12-27%。
[0179] 对比例1
[0180] 抗性芽离体生根
[0181]单士抗性芽从胚轴上切离后生根，重复三次试验，生根频率为50%。累计从150个 胚轴获得大豆植株系30个，PCR和Southern blot检测阳性株系15个，转化效率为5-10%。
[0182]本发明的方法，所有的抗性芽随同胚轴生根，与单个抗性芽生根相比，生根频率提 高到100%，且比单个抗性芽生根体系的转化效率提高50%以上。所得转化植株比不带胚 轴的单个抗性芽生长势更为旺盛，结荚更多，转基因子代产量更大，转基因植株结实率提高 150%。与单个抗性芽生根相比，获得转基因植株的时间跨度缩短了丨-2个月。并且，采用 本发明的生根方法，大豆遗传转化的受体品种依赖性减小，经测试，K 〇6-82,北豆21、北豆 8731等受体品种的平均转化效率提高15%。
[0183] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【权利要求】
1. 一种大豆生根方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (a) 提供一转入外源目的基因和抗性筛选基因的大豆胚尖； (b) 对步骤a)所述胚尖，在针对所述抗性筛选基因的第一筛选压力条件下，进行筛选 培养，获得抗性芽及胚轴； (c) 将步骤b)获得的所述抗性芽及胚轴，在针对所述抗性筛选基因的第二筛选压力条 件下，在进行筛选培养6-20天； ' (d) 将经步骤c)筛选培养后的所述抗性芽及胚轴，进行生根培养直至所述胚轴下端长 出根系。 2?如权利要求1所述的方法,其特征在于，所述的第二筛选压力 < 第一筛选压力。 3?如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（d)中，所述的生根培养在第三筛选 压力下进行。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第三筛选压力<第二筛选压力<第 一筛选压力。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用根癌农杆工程菌浸染大豆胚尖获得所 述转入外源目的基因和抗性筛选基因的大豆胚尖，其中，所述根癌农杆工程菌经以下步骤 获得： 从含卡那霉素的YEP培养平板上挑取含有质粒pCAMBIA2301的根癌农杆菌单菌落接种 于含有45-55mg_ L-1利福平和45-50mg_ L 1卡那霉素的YEP液体培养基培养，经活化后离心 分离，收集菌体,重悬于液体MS基本培养基中，其中， 所述质粒pCAMBIAMOl带有CaMV35S启动的P -葡萄糖苷酸酶（gus)基因和CaMV35S 启动的新霉素转移酶（npt II )基因。 6?如权利要求1所述的方法，其他特征在于，所述步骤b)将所述胚尖置于含 0? 25_35mg. IZ1GAU5O-25Omg. I/1替卡西林及5O-I5Omg. L-1卡那霉素的MS基本培养基或 MSB5培养基中筛选培养6_25天，15-18h/d光照，温度为24-26°C。 7?如权利要求1所述的方法,其特征在于，所述步骤c)中,将所述抗性芽及胚轴含置于 50_150mg. L_1替卡西林，30-8〇mg. I/1卡那霉素的1/8MS基本培养基或1/8MSB5培养基中，于 14_18h/d光照，25± 1°C条件下进行筛选培养。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d)包括二个子步骤： (dl)将经步骤c)筛选培养后的所述抗性芽及胚轴进行生根培养至所述胚轴下端发 根； (d2)将经步骤dl)生根培养后的所述抗性芽及胚轴进行培养至所述胚轴长出10-15cni 根系。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤dl)中，将所述抗性芽及胚轴置于 含 0? 5-1. 5mg. L_1IBA(吲哚丁酸），50-150mg. L_1 替卡西林，30-80mg. L-1 卡那霉素的 1/4MS 基本培养基或1/4MSB5培养基中于14-18h/d光照，25 土 1°C条件下生根培养；和/或 所述步骤d2)中，将所述生根培养后的所述抗性芽及胚轴转接到含0? 5-1. 5mg. L4IBA, 50_150mg. T1替卡西林,3〇-8〇mg. L_1卡那霉素的1/2MS基本培养基或1/2MSB5培养基中于 14_18h/d光照,25 ± I °C条件下培养。
10. -种转基因大豆种子的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (i) 种植多个大豆转基因株系至结荚，其间，进行叶片GUS染色、PCR检测及Southern blot检测； (ii) 取GUS染色、PCR检测及Southern blot检测为阳性的转基因株系，收获并保存种 子，为TO代转基因大豆种子；以及任选地， (iii) 种植所述TO代种子，苗期进行GUS染色、PCR检测，收获并保存结果均为阳性的 株系的种子，为Tl代转基因大豆种子；以及任选地， (iv) 种植所述Tl代种子，苗期进行GUS染色、PCR检测，收获并保存结果均为阳性的株 系的种子，为T2代转基因大豆种子， 其中，所述大豆转基因株系来源于同一个由权利要求1所述的方法获得的长出根系的 胚轴。
【文档编号】A01H4/00GK104206269SQ201310222316
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年6月5日 优先权日:2013年6月5日
【发明者】朱木兰, 谢璐遥, 卫志明 申请人:中国科学院上海生命科学研究院