一种供应设施种植作物钙元素的生物制剂及其制备方法、应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种供应设施种植类作物钙元素的生物制剂以及通过一株产生高效吸水和吸附钙离子高聚物的功能微生物菌株制备该产品的方法，属于微生物【技术领域】。本发明的微生物菌株为解淀粉芽孢杆菌IAE（Bacillus?amyloliquefaciens?IAE），分离自江苏沿海滩涂盐碱土壤。该产品利用微生物合成的大分子高聚物在有水分存在的条件下可以粘附在作物或者果实表面，且其形成大孔径的空间网状结构吸附大量的钙离子和含钙化合物形成钙-有机物复合体，吸附在作物或者果实表面持续供应作物或者果实钙元素。该产品能够很好的防控设施农业中由于土壤钙元素供应能力较差引起作物缺钙的病害和果实存贮保质期短的问题。
【专利说明】一种供应设施种植作物钙元素的生物制剂及其制备方法、应用
[0001]一、【技术领域】
本发明具体涉及一种供应设施种植作物钙元素的生物制剂及其制备方法，属于微生物【技术领域】。
[0002]二、【背景技术】
钙是果实类作物必须的元素，钙的生物学功能主要为:保持细胞结构的完整性，减少乙烯的生成，降低果实呼吸强度，减少果实贮藏中生理病害的发生。设施农业由于高强度、单一化地对土壤进行掠夺性的利用，导致土壤理化性质极大地改变，活性离子钝化，土壤板结，有益微生物数量减少，能够活化土壤中植物需要元素的微生物数量减少导致土壤钙等部分元素供应不足；设施农业土壤容易偏酸，致使铝的可给态增多，从而也抑制了钙的吸收；设施种植土壤偏酸加剧土壤钙的淋失，导致土壤缺钙；设施农业中施用肥料以尿素和硫酸铵为主，形成碳酸钙和硫酸钙等难溶钙化合物；氮肥导致植物疯长，侵占了本该供应果实的钙；设施农业土壤由于长期缺乏降雨，土壤盐溃化严重，土壤含盐量高严重影响植物钙的吸收；土壤一旦供水不足也会导致土壤植物的根系根压降低，不利于钙的运输，以上诸多因素导致设施农业种植作物容易缺钙。
[0003]植物钙元素供应不足，会导致过果皮细胞壁薄而脆弱，容易裂果，严重的影响果实的卖相；作物缺钙会发生生理性病害和因果皮组织脆弱容易被病原微生物感染，导致果实畸形或者发病，诸如番茄脐腐病和蒂腐病、苹果斑点病、苦痘病、痘斑病和水心病、梨黑心病、脐腐果和石梨症、柑桔浮皮病、甜樱桃及荔枝裂果、芒果软鼻病、草莓腐烂、人参果脐腐病等等。果实缺钙严重影响果实存贮保质期。
[0004]喷施钙元素制剂是快速的补充植物的钙元素主要途径。果实类作物表层具有很厚的蜡质层，表层的无机元素需要较长时间的渗漏才能被果实吸收，但是常规的无机钙元素，喷施后在果实吸收前容易被雨水或者浇水淋洗掉，而且无机钙喷施在果实表面很快形成粉末状固体，果实无法吸收，因此，常`规的无机钙制剂对于缺钙导致障碍的防控效率很低。
[0005]微生物合成的大分子胞外多肽Y -多聚谷氨酸，吸水倍率高达3500倍，和无机钙复合之后，容易附着在果实的表面形成含有高浓度钙元素的膜，不易被水淋掉、不易形成固体粉末。该产品在作物结果早期施用，在果实的生长和存贮过程中持续供应钙，减少人工，减少果实裂果率，减少农药的施用，延长果实存贮期。提高食品安全和增加农业收益具有很大的市场前景。
[0006]三、
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种微生物菌株以及应用该菌株制备钙元素生物制剂供农业生产利用。
[0007]本发明一种供应设施种植作物钙元素的生物制剂，通过以下方案实现:
一种供应设施种植作物钙元素的生物制剂，其特征是该制剂中含有0.5X IO8 cfu mr1以上Y-多聚谷氨酸合成菌株，钙离子浓度8~15% (w/v);其中所述的Y-多聚谷氨酸合成菌株为解淀粉芽抱杆菌IAECfeci77w5.amyloli quefaci ens IAE),于2013年3月15日保减于中国典型培养物保减中心，保减地址为武汉市武昌洛咖山，囷种保减号为CCTCC NO:M2013086，简称解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086 ;其主要生物学特性为:菌体呈杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，芽孢呈椭圆形，革兰氏染色阳性，培养基上菌落呈白色不透明菌落，边缘不规则，有隆起，表面褶皱，电镜照片见图2 ；16s rDNA序列进化分析结果显示该菌株为解淀粉芽孢杆菌(汉amyloliquefaciens\
[0008]上述解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086，其特征是在于该菌株能够在pH值为
3.5-9和NaCl浓度5%_10%的环境中生长。
[0009]上述解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086，其特征在于:用接种环从培养皿中挑取生长24h的该菌接种于装有100ml解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086液体培养基的250ml三角瓶中，接种量104cfu mF1, 37°C、150rpm培养60h,菌液上清1000Orpm离心20min,测定上清液Y-多聚谷氨酸含量为21.8 g L—1。
[0010]上述解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086所用液体培养基:以配制IL培养液为例:葡萄糖 80g，谷氨酸钠 50g，(NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4.3H20 2g，MnSO4.7H20 0.25g,MnSO4H2O 0.03 g，蒸馏水 1000ml，pH 值自然，115°C灭菌 30min。
[0011]上述微生物菌株所生产的钙元素生物制剂，其特征在于:该制品中含有0.5 X IO8cfu g—1以上的解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086菌株，Y -多聚谷氨酸含量为13~18%(w/v),钙离子浓度8~15% (w/v)。
[0012]所述钙元素生物制剂生产方法，包括:
1)将解淀粉芽孢杆菌CCTCCNO:M 2013086菌株接种到液体菌种培养基，培养的条件为:摇床震荡170转/分钟，培养温度37°C，培养24小时，菌落形成单位> IXlO9Cfu ml-1 ；所用的液体的种子培养基的配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自来水 1000ml, pH 范围 7.0-7.5，121°C灭菌 20min ；
2)将种子按照5%比例接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:培养温度28-35°C，溶氧通气量范围为30~100%，150-220rpm,发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位> IXlO9Cfu ml-1 ;所用的液体的发酵培养基的配方为，按照IL培养基配制:葡萄糖 80g，谷氨酸钠 50g，(NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4.3H20 2g，MnSO4.7H20 0.25g,MnSO4H2O 0.03 g，蒸馏水 1000ml，pH 值自然，115°C灭菌 30min ;
3)将氯化钙或者氨基酸钙一种或者两种任意比例混合，按照20%(w/v)的量缓慢的加入微生物发酵液，加入的过程不断的快速搅拌避免无机钙化合物沉淀，化合物彻底加入后继续搅拌广2小时让微生物菌体稳定和进入休眠状态。复合物在常温静置24小时，灌装液体，即为钙元素的生物制剂。
[0013]所述钙元素的生物制剂可直接用于农作物整体喷施或者作物果实表面喷施，防控作物由于缺钙引起的病害和保质期缩短的问题。
[0014]有益效果
本发明提供一种能够持续供应植物钙元素的生物制剂生产菌株及其生产方法，通过从盐碱、贫瘠环境中分离获得一株高效合成Y -多聚谷氨酸菌株，利用该菌株高密度液体发酵生产Y -多聚谷氨酸及其菌体发酵液，将无机钙搅拌混匀进入菌体发酵液形成稳定的Y-多聚谷氨酸-微生物菌株-钙元素的复合物，该菌株在果实或者作物表面能够持续的合成Y -多聚谷氨酸，能够长期将钙元素固定于作物或者果实表层，能够长期的有效的供应果实钙元素。由于是生物制剂，没有环境污染，对人畜无害，有利于在现代集约化设施农业 中的应用。
[0015]四、【专利附图】
【附图说明】
图1为不同处理条件下西红柿脐腐病的发病率。
[0016]图2是解淀粉芽孢杆菌菌株电镜照片。
[0017]五、【具体实施方式】 实施例1
菌株的分离和鉴定
采集自江苏沿海滩涂裸露滩涂中零星生长的植株根际土壤低温保存，采用筛选培养 基分离多聚谷氨酸合成微生物菌株，其培养基配制按照1L量配制方法为：葡萄糖 10g，NaCl 10 g，酵母膏 5. 0g，谷氨酸钠 5. 0g, KH2P04 0. 5g，MgS04 0. lg，琼脂 20g,自来水 1000ml，pH自然，121°C灭菌20分钟。根据Y -多聚谷氨酸合成菌菌落大小筛选菌株。
[0018]进一步通过液体培养基：葡萄糖80g，谷氨酸钠50g，(NH4)2S04 8g, NaCl 5g， K2HP04 ? 3H20 2g，MnS04 ? 7H20 0. 25g, MnS04H20 0. 03 g，蒸馏水 1000ml，pH 值自然，115°C灭 菌30min，筛选高效合成Y -多聚谷氨酸菌株。培养条件：接种培养皿培养24h的菌落于装 有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，接种量104cfu ml—1，37°C、170rpm培养60h，菌液 上清lOOOOrpm离心20min，获得Y -多聚谷氨酸合成量最大菌株，测定其发酵液Y-多聚谷 氨酸浓度21. 8g L'
[0019]菌株属于解淀粉芽孢杆菌(汉主要生物学特性为：菌体呈 杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，芽孢呈椭圆形，革兰氏染色阳性，培养基上菌落呈白 色不透明菌落，边缘不规则，有隆起，表面褶皱，电镜照片见图2 ；16s rDNA序列进化分析结 果表明，该菌株为解淀粉芽孢杆菌(汉amyloliciuefaciens\
[0020]该菌株于2013年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武 汉市武昌珞珈山，菌种保藏号为CCTCC NO :M2013086，简称解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO ：M 2013086。
[0021]菌剂生产
将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO ：M 2013086接种到液体菌种培养基，培养的条件为：摇床 震荡170转/分钟，培养温度37°C，培养24小时，菌落形成单位≤1X109 cfu ml—1 ;所用的 液体的种子培养基的配方为，按照1L培养基配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g,自来水 1000ml, pH 范围 7. 0-7. 5，121°C灭菌 20min ；
将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO ：M 2013086种子按照5%比例接种到液体发酵培养基，进 行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28-35°C，溶氧通气量范围为30?100%， 150-220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位> lX109cfu mF1 ;所用的液体的发酵 培养基的配方为，按照1L培养基配制：葡萄糖80g,谷氨酸钠50g, (NH4)2S04 8g, NaCl 5g, K2HP04 ? 3H20 2g，MnS04 ? 7H20 0. 25g, MnS04H20 0. 03 g，蒸馏水 1000ml，pH 值自然，115°C灭 菌 30min ；
钙元素生物制剂的制备
将氯化钙或者氨基酸钙一种或者两种任意比例，按照20%(w/v)的量缓慢的加入微生 物发酵液，加入过程不断地快速搅拌避免无机钙化合物沉淀，化合物彻底加入后继续搅拌1-2小时让微生物菌体稳定和进入休眠状态。复合物在常温静置24小时，灌装液体，即为钙元素生物制剂。
[0022]钙元素生物制剂效果验证
供试设施农业生产环境:番茄连作5季蔬菜大棚；供试作物:番茄，品种苏红9号。
[0023]试验设置处理如下:1.对照，2.等浓度的氯化钙溶液，3.钙元素生物制剂
每处理采用5个重复，每重复30株番茄。处理I 土壤为对照，处理2番茄生长期内喷施三次氯化钙溶液，分别为移栽后10天、挂果后第5天和果实采摘前5天，处理3番茄生长期内喷施三次钙元素生物制剂溶液，分别为移栽后10天、挂果后第5天和果实采摘前5天。测定番茄果实脐腐病发病率和番茄采摘后的存贮保质期。
[0024]试验结束测定三个处理番茄脐腐病发病率如图1所示，对照处理平均发病率高达8.5%，氯化钙处理平均发病率为4.6%，钙元素生物制剂处理平均发病率为0.8%。钙元素生物制剂对番茄脐腐病的防控率为90.6%，其防控效果比氯化钙处理的51.8%防控率高38.8%。番茄采摘后在室温15°C仓库存贮20天，结果表明:对照处理第8天时候开始出现烂果，第20天时候果实整体偏软、失水较多、表面褶皱、烂果率累积达10.5%，氯化钙处理第10天开始出现烂果，第20天时候果实偏软、表面轻微褶皱、烂果率5.3%，钙元素生物制剂处理在第20天时候，果实较硬，表面光亮，失水较少，色素红，无烂果。
【权利要求】
1.一种供应设施种植作物钙元素的生物制剂，其特征是该制剂中含有0.5X IO8 Cfu ml-1以上Y-多聚谷氨酸合成菌株，钙离子浓度8~15% w/v ;其中所述的Y-多聚谷氨酸合成菌株为解淀粉芽抱杆菌IAE(ifec77w5.amyloliquefaciens IAE),于2013年3月15日保减于中国典型培养物保减中心，保减地址为武汉市武昌洛咖山，囷种保减号为CCTCC NO:M 2013086，简称解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086。
2.根据权利要求1所述的一种供应设施种植作物钙元素的生物制剂，其特征是所述的制剂含有Y-多聚谷氨酸含量为13~18% w/v，钙离子含量8~15% w/v，解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086 的浓度≥ 0.5X IO8 cfu ml'
3.根据权利要求1或2—种供应设施种植作物钙元素的生物制剂，其特征在于所述的解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2013086所用液体培养基配制方法为，以配制IL培养基为例:葡萄糖 80g，谷氨酸钠 50g, (NH4)2SO4 8g，NaCl 5g，K2HPO4.3H20 2g，MnSO4.7H20 0.25g，MnSO4-H2O 0.03 g，蒸馏水 1000ml，pH 值自然，115°C灭菌 30min。
4.权利要求1或2所述一种供应设施种植作物钙元素的生物制剂在集约化设施农业种植以及果实类作物保鲜中的应用。
5.根据权利要求1或2所述的一种供应设施种植作物钙元素的生物制剂的制备方法，其特征在于，按如下步骤实现: 1)将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌CCTCCNO:M 2013086接种到液体菌种培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:摇床震荡170转/分钟，培养温度37°C，培养24小时，菌落形成单位> IXlO9 cfu ml-1，获得菌株种子液；所用的液体的种子培养基的配方为，按照IL培养基配制:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl IOg,自来水1000ml，pH范围为.7.0-7.5，121。。灭菌 20min ； 2)将步骤(1)所述的菌株种子按照5%体积百分比接种到液体发酵培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为:培养温度28-35°C，溶氧通气量范围为30~100%，150-220rpm,发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位> I X IO9 cfu ml-1;所用的液体的发酵培养基的配方为，按照IL培养基配制:葡萄糖80g,谷氨酸钠50g, (NH4)2SO4 8g,NaCl 5g,K2HPO4.3Η20 2g，MnSO4.7Η20 0.25g, MnSO4-H2O 0.03 g，蒸馏水 1000ml，pH 值自然，115°C灭菌 30min ； 3)将氯化钙或者氨基酸钙一种或者两种任意比例混合，按照20%w/v的量缓慢的加入微生物发酵液，加入的过程不断的快速搅拌避免钙化合物沉淀，化合物彻底加入后继续搅拌f 2小时让微生物菌体稳定和进入休眠状态；复合物在常温静置24小时，灌装液体，即为一种供应设施种植作物钙元素的生物制剂。
【文档编号】C05G3/00GK103804067SQ201310307506
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年7月22日 优先权日:2013年7月22日
【发明者】陈立华, 邵孝侯, 朱福新, 谈俊益, 毛欣宇, 潘小宝, 常婷婷 申请人:河海大学