一种优质太平洋牡蛎精子的采集及超低温冷冻保存的方法

文档序号:292841阅读:338来源:国知局
一种优质太平洋牡蛎精子的采集及超低温冷冻保存的方法
【专利摘要】本发明属海洋生物【技术领域】,具体地讲是一种优质太平洋牡蛎精子采集及超低温冷冻保存方法。将性腺发育饱满的雄性太平洋牡蛎经过光照刺激,解剖性腺,筛绢网过滤获得大量优质太平洋牡蛎的精子。精液与抗冻液以适宜的比例混合分装至2ml或5ml冻存管;经过平衡孵育、程序降温然后投入液氮中长期保存;水浴解冻,自然海水激活,获得冻精活力高于70%,受精率高于95%的受精率。本发明的优质太平洋牡蛎精子采集及超低温冷冻保存方法对于太平洋牡蛎人工繁育、种质保存、遗传多样性及可持续养殖等方面有着重要意义。
【专利说明】一种优质太平洋牡蛎精子的采集及超低温冷冻保存的方法

【技术领域】
[0001]本发明属海洋生物【技术领域】,具体地说是一种优质太平洋牡蛎精子的采集及冷冻保存的方法。

【背景技术】
[0002]太平洋牡贩(Crassostrea gigas)隶属于牡贩科,巨贩属,俗称真牡贩,是牡贩类中个体较大的一种贝类。其肉质细嫩,味道鲜美,营养丰富,含蛋白质45%?57%、脂肪7%?11%、肝糖19%?38%,碘的含量高于牛奶和鸡蛋,此外,还含有多种维生素及微量元素,有海洋牛奶之美称。20世纪80年代从日本、澳大利亚和台湾地区引入中国。贝类精液的超低温保存在水产养殖、遗传育种以及种质资源保存中具有重要的意义。太平洋牡蛎多采用解剖法人工授精,对优质雄性牡蛎要求较高,雄性亲贝精子的质量严重制约了太平洋牡蛎的养殖繁育。除此之外,太平洋牡蛎精子的超低温冷冻保存是太平洋牡蛎在家系的构建过程雄性亲本留种的一个最为重要和可靠的方法。采用超低温冷冻保存的方法可以在雄性太平洋牡蛎性腺发育最佳时期,将优质的的亲贝的精子进行批量冷冻长期保存,在需要的时候随时解冻进行人工授精。同时超低温保存可以使精子的长距离运输得以实现,有利于贝类的杂交、选育、优良形状的获得以及基因多样性的保护。因此,建立太平洋牡蛎精子大容量超低温保存的可靠方法对海水养殖业的发展以及生物多样性的保护具有重要意义。


【发明内容】

[0003]本发明的目的在于提供一种优质太平洋牡蛎精子的采集及超低温冷冻保存的方法。
[0004]为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
[0005]一种优质太平洋牡蛎精子的采集:
[0006]a)将性腺发育成熟、饱满的太平洋牡蛎进行光照刺激,使雄性亲本开始排精,收集精子,待用;
[0007]b)将上述采集的精子经筛絹网过滤,收集活力高于80%的精子。
[0008]所述步骤a)选择壳长8-lOcm性腺发育成熟、饱满的太平洋牡蛎进行暂养,而后捞出置于阳光下暴晒1-1.5小时,照射后翻转到另一面再暴晒1-1.5小时后放入18-20°c自然海水中,待雄性牡蛎开始排精后立即从水中将其取出。
[0009]所述步骤b)将采集的精子用100-120目筛絹网过滤,收集活力高于80%的精子。
[0010]一种优质太平洋牡蛎精子超低温冷冻保存的方法,
[0011]a)将经筛絹过滤的活力高于80%的精子中加入抗冻液,于0_4°C孵育;其中精液与抗冻液按1:4-1:6 (V/V)的比例混合;
[0012]b)精子于抗冻液中孵育后,分装置2ml_5ml冻存管中,在程序降温仪中经孵育、两步降温、平衡,然后从程序降温仪中取出,直接投入到_196°C的液氮,长期保存。
[0013]所述抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂三部分组成;稀释液的配方为:NaCl:8g/L,KCl:0.8g/L, Na2HPO4.2Η20:0.lg/L, KH2PO4:0.lg/L, NaHCO3:0.35g/L ;抗冻剂:10-12% (V/V) DMSO (二甲基亚砜)和3-4%PG (丙二醇)(以稀释液作为基准的体积比);添加剂:葡萄糖:10g/L,海藻糖 170g/L。
[0014]所述冷冻保存步骤a)将经筛絹过滤收集的活力高于80%的精子中加入抗冻液,用力颠倒震荡离心管5-10次,静置2-3min,将静置后的上层精子与抗冻液的混合液体倒出,通过100-120目筛絹网过滤,滤液待用;滤出的较大的组织块轻轻挤压,使组织块中残留精子释放出来,然后用抗冻液冲洗筛絹网及残余组织2-3次,将其与上述滤液合并,最后补充抗冻液使精子与抗冻液的比列维持在1:4-1:6,而后于0-4°C孵育20-30min。
[0015]所述冷冻保存步骤b)精子与抗冻液混合后置于程序降温仪中在0-4°C下孵育20-30min,而后以-10—15°C /min 的速率降温至-60—80°C,然后再以-20—25 °C /min的速率降温至-150--180°C,平衡2-5分钟,从程序降温仪腔体中取出,直接投入到液氮(_196°C),分装保存。
[0016]所述冷冻保存的精子解冻是将冻存管直接放入30-40°C水浴,置于室温,震荡20-30s,然后置于0-4°C冰箱中保存,待用。
[0017]所述冷冻保存的优质太平洋牡蛎冻精解冻时,直接放入30_40°C水浴100-120S,期间不断摇动冻存管,然后放置于振荡器室温震荡30s至完全融化,自然海水激活。
[0018]本发明具有如下优点:
[0019]1.本发明采集精子是采用暴晒刺激,等待牡蛎排精的时刻,解剖性腺,可获得大量的闻活力的优质精子;
[0020]2.本发明采集精子后用100目筛絹网进行过滤,并将大块的性腺组织通过筛絹网的挤压可最大程度的获得性腺内的精子;
[0021]3.本发明在精子收集的过程中加入抗冻液,可减少精子在空气的暴露时间,减少精子在冷冻前遭受的损伤,同时减少精子的浪费,有利于精子的收集;并且抗冻液中采用DMSO和PG作为抗冻剂,保持较好渗透性,和较低的毒性;另外抗冻液中加入了 10g/L葡萄糖,170g/L海藻糖,其可对精子的质膜起到很好的保护作用;
[0022]4.本发明采用2_5ml冻存管容积较大,保存精液量大;
[0023]5.本发明在处理时冷冻前鲜精与抗冻液充分震荡混匀,0_4°C平衡10_20min,使抗冻液充分渗入精子内部,减小了降温时对精子细胞的损害;
[0024]6.本发明冷冻处理时以分段方式降温,采用以-10—15 V /min速度降温,使冷冻精子安全度过“危险温度区”,然后采用-20°C /min的降温速率快速进入稳定状态-150-18(TC,然后投入液氮,降温程序精密且快速;
[0025]7.本发明冷冻精子从液氮中取出后,采用二步解冻法,30°C-40°C和20°C两步解冻,可使精子快速度过重结晶区,同时又避免了局部温度过高导致的损伤;
[0026]8.采用本发明精密的降温程序,重复性稳定性好,冻精解冻后复苏率高,激活后运动率高于70%,受精率高于90%与鲜精活性基本相同。

【具体实施方式】
[0027]实施例1
[0028]1.6月中旬,在正值太平洋牡蛎生殖生殖期,于胶南养殖基地取得近海笼养牡蛎5只,于贝类养殖室暂养,冷冻保存前将雄性太平洋牡蛎从暂养池中捞出,于阳光下暴晒I小时,而后翻转到另一面再暴晒I小时后放入室温海水中,观察到雄牡蛎排精后立即取出,通过解剖法取出精液,筛絹过滤去除组织杂块,收集活力高于80%的精子。
[0029]2.将上述收集的收集活力高于80%的精子中加入事先配制好的抗冻液充分混匀,用力在碎冰中((TC)轻轻颠倒震荡离心管5-10次,静置2min,将静置后的上层精子与抗冻液的混合液体倒出,通过100筛絹网过滤,滤液待用;滤出的较大的组织块轻轻挤压,使组织块中残留精子释放出来,然后用抗冻液冲洗筛絹网及残余组织2-3次,将其与上述滤液合并,最后补充抗冻液使精子与抗冻液的比列维持在1:5,而后混装于2!111冻存管中,分装12个冻存管,0-4°C平衡20min。其中,抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂三部分组成;稀释液的配方为:NaCl:8g/L, KCl: 0.8g/L, Na2HPO4.2Η20:0.lg/L, KH2PO4:0.lg/L, NaHCO3:0.35g/L ;抗冻剂为10% (以稀释液作为基准的体积比v/v) DMSO (二甲基亚砜)和3%PG (丙二醇);添加剂:葡萄糖:10g/L,海藻糖170g/L;
[0030]抗冻液的配置过程:首先用蒸馏水配置稀释液,称取NaCl 8g,KCl 0.8g,Na2HPO4.2Η20:0.lg/L,KH2P04:0.lg/L, NaHCO3:0.35g/L,然后定容至 IL 备用;采用已配置的稀释液作为基础液配置抗冻剂,其中含10%DMS0(V:V)和3%PG(V:V)(即10mL含1mLDMSO,3mL PG);然后将已配置好的抗冻剂作为基础液,加入葡萄糖Ig,海藻糖17g,定容至100mL。抗冻液预先配置并置于4°C冰箱预冷;
[0031]3.程序降温仪开启,预冷至0°C,而后将精子与抗冻液混合后置于程序降温仪中在(TC下孵育20min,而后以-10°C /min的速率降温至_60°C,然后再以_20°C /min的速率降温至_150°C,平衡2分钟,将所有的冻存管倒入盛有液氮的泡沫盒中,然后逐一顺序放入冻存盒然后放入液氮容器中长期贮存(_196°C);
[0032]4.冷冻保存2h后解冻,任意选取3个冻存管解冻,解冻前将冻存盒先置于盛有液氮的保温盒中,然后将冻存管快速从盒中取出放入37°C水浴锅中,轻轻摇动100s,然后置于室温20°C放置于振荡器震荡30s至完全融解;
[0033]5.自然海水激活,显微镜检测冻精活力高于70% ;进行人工授精,获得受精达95%以上。
[0034]实施例2
[0035]1.7月初,在正值太平洋牡蛎生殖生殖期,在胶南养殖基地采集雄性太平洋牡蛎I只,性腺发育非常饱满,于阳光暴晒I小时,而后翻转到另一面再暴晒I小时后放入室温海水中,观察到雄牡蛎排精后立即取出,通过解剖法取出精液;筛絹过滤去除组织杂块,收集活力闻于80%的精子。
[0036]2.将上述收集的收集活力高于80%的精子中加入事先配制好的抗冻液充分混匀,用力在碎冰中((TC)轻轻颠倒震荡离心管5-10次,静置2min,将静置后的上层精子与抗冻液的混合液体倒出,通过100筛絹网过滤,滤液待用;滤出的较大的组织块轻轻挤压,使组织块中残留精子释放出来,然后用抗冻液冲洗筛絹网及残余组织2-3次,将其与上述滤液合并,最后补充抗冻液使精子与抗冻液的比列维持在1:4,而后混装于2!111冻存管中,分装25个冻存管,0-4°C平衡20min;其中,抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂三部分组成;稀释液的配方为:NaCl:8g/L,KCl:0.8g/L, Na2HPO4.2Η20:0.lg/L, KH2PO4:0.lg/L, NaHCO3:0.35g/L ;抗冻剂为10%DMS0 (二甲基亚砜)和3%PG (丙二醇);添加剂:葡萄糖:10g/L,海藻糖170g/L;
[0037]抗冻液的配置过程:首先用蒸馏水配置稀释液,称取NaCl 8g,KCl 0.8g,Na2HPO4.2Η20:0.lg/L,KH2P04:0.lg/L, NaHCO3:0.35g/L,然后定容至 IL 备用;采用已配置的稀释液作为基础液配置抗冻剂,其中含10%DMS0(V:V)和3%PG(V:V)(即10mL含1mLDMSO,3mL PG);然后将已配置好的抗冻剂作为基础液,加入葡萄糖Ig,海藻糖17g,定容至100mL。抗冻液预先配置并置于4°C冰箱预冷;
[0038]3.程序降温仪开启,预冷至0°C,而后将精子与抗冻液混合后置于程序降温仪中在(TC下孵育20min,而后以-15°C /min的速率降温至_80°C,然后再以_20°C /min的速率降温至_150°C,平衡5分钟,将所有的冻存管倒入盛有液氮的泡沫盒中,然后逐一顺序放入冻存盒然后放入液氮容器中长期贮存(_196°C);
[0039]4.冷冻保存2h后解冻,任意选取3个冻存管解冻,解冻前将冻存盒先置于盛有液氮的保温盒中,然后将冻存管快速从盒中取出放入37°C水浴锅中,轻轻摇动100s,然后置于室温20°C放置于振荡器震荡30s至完全融解;
[0040]5.自然海水激活,显微镜检测冻精活力高于70% ;人工授精,获得受精达95%以上;
[0041]6.剩余的样品整到液氮容器中长期保存,并成功用于太平洋牡蛎家系的构建。
【权利要求】
1.一种优质太平洋牡蛎精子的采集,其特征在于: a)将性腺发育成熟、饱满的太平洋牡蛎进行光照刺激,使雄性亲本开始排精,收集精子,待用; b)将上述采集的精子经筛絹网过滤,收集活力高于80%的精子。
2.按权利要求1所述的优质太平洋牡蛎精子的采集,其特征在于:所述步骤a)选择壳长8-lOcm性腺发育成熟、饱满的太平洋牡蛎进行暂养,而后捞出置于阳光下暴晒1-1.5小时,照射后翻转到另一面再暴晒1-1.5小时后放入18-20°C自然海水中,待雄性牡蛎开始排精后立即从水中将其取出。
3.按权利要求1所述的优质太平洋牡蛎精子的采集,其特征在于:所述步骤b)将采集的精子用100-120目筛絹网过滤,收集活力高于80%的精子。
4.一种优质太平洋牡蛎精子超低温冷冻保存的方法,其特征在于: a)将经筛絹过滤的活力高于80%的精子中加入抗冻液,于0-4°C孵育;其中精液与抗冻液按1:4-1:6 (V/V)的比例混合; b)精子于抗冻液中孵育后,分装置2ml-5ml冻存管中,在程序降温仪中经孵育、两步降温、平衡,然后从程序降温仪中取出,直接投入到_196°C的液氮,长期保存。
5.按权利要求4所述的优质太平洋牡蛎精子超低温冷冻保存的方法,其特征在于:所述抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂三部分组成;稀释液的配方为=NaCl:8g/L, KCl:0.8g/L, Na2HPO4.2Η20:0.lg/L, KH2PO4:0.lg/L, NaHCO3:0.35g/L ;抗冻剂:10-12% (V/V) DMSO (二甲基亚砜)和3-4%PG (丙二醇);添加剂:葡萄糖:10g/L,海藻糖170g/L。
6.按权利要求4所述的优质太平洋牡蛎精子超低温冷冻保存的方法,其特征在于: 所述步骤a)将经筛絹过滤收集的活力高于80%的精子中加入抗冻液,用力颠倒震荡离心管5-10次,静置2-3min,将静置后的上层精子与抗冻液的混合液体倒出,通过100-120目筛絹网过滤,滤液待用;滤出的较大的组织块轻轻挤压,使组织块中残留精子释放出来,然后用抗冻液冲洗筛絹网及残余组织2-3次,将其与上述滤液合并,最后补充抗冻液使精子与抗冻液的比列维持在1:4-1:6,而后于0-4°C孵育20-30min。
7.按权利要求4所述的优质太平洋牡蛎精子超低温冷冻保存的方法,其特征在于: 所述步骤b)精子与抗冻液混合后置于程序降温仪中在0-4°C下孵育20-30min,而后以-10—15°C /min的速率降温至-60—80°C,然后再以-20—25 °C /min的速率降温至-150--180°C,平衡2-5分钟,从程序降温仪腔体中取出,直接投入到液氮(_196°C ),分装保存。
8.按权利要求4所述的优质太平洋牡蛎精子超低温冷冻保存的方法,其特征在于: 所述冷冻保存的精子解冻是将冻存管直接放入30-40°C水浴,置于室温,震荡20-30S,然后置于0-4°C冰箱中保存,待用。
9.按权利要求8所述的优质太平洋牡蛎精子超低温冷冻保存的方法,其特征在于: 所述冷冻保存的优质太平洋牡蛎冻精解冻时,直接放入30-40°C水浴100-120S,期间不断摇动冻存管,然后放置于振荡器室温震荡30s至完全融化,自然海水激活。
【文档编号】A01N1/02GK104336004SQ201310314722
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月24日 优先权日:2013年7月24日
【发明者】刘建国, 李军, 许飞, 张国范, 李莉, 韩龙江 申请人:中国科学院海洋研究所
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