提高小麦幼胚植株再生率的组织培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高小麦幼胚再生率的组织培养方法。本发明所提供的提高小麦幼胚再生率的组织培养方法，包括如下步骤：1）将待培养的小麦幼胚置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得到胚性愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基中含有体积分数为0.0015-0.003‰的过氧化氢；2）将所述胚性愈伤组织转移到分化培养基上进行培养，得到再生小麦植株。本发明通过在SD2愈伤组织诱导培养基中添加H2O2，发现小麦幼胚再生率明显提高，对再生容易的小麦品种如扬麦18、京冬18、CB031和再生较难的小麦品种如济麦22、宁春4号、扬麦20均有效果，这对于利用基因工程途径和细胞工程途径改良优良小麦品种具有重要意义。
【专利说明】提高小麦幼胚植株再生率的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组织培养领域，涉及一种提高小麦幼胚再生率的组织培养方法。【背景技术】
[0002]组织培养高频率植株再生是开展小麦细胞工程育种和转基因育种的基础。目前，小麦细胞工程育种和转基因育种中利用的外植体基本为分化程度比较低的组织和器官，如小麦幼胚、成熟胚、幼穗、花药、小孢子、顶端分生组织等，以根、叶片、胚芽鞘等分化程度较高的器官为外植体的组织培养研究也有报道。目前积累的研究资料表明，小麦幼胚与其他外植体相比，离体培养愈伤组织诱导率和植株再生率均比较高。为了进一步改进小麦幼胚离体培养再生植株的效率，国内外学者详细研究了影响小麦幼胚培养的多个因素，包括基因型、植物激素、幼胚大小、培养基组成、碳源、有机添加物、氧气浓度、干燥处理和培养程序等。同时，发现温度、光照、营养、湿度等小麦供体植株生长的环境条件，通过影响小麦幼胚的生理状态影响其再生效果。
[0003]过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)是植物细胞发生氧化反应的产物,也是植物遭受外界胁迫情况下产生活性氧的一种形式，影响细胞正常的新陈代谢及生长发育，这种影响对植物细胞具有双重作用:一方面，发生氧化胁迫时过氧化氢作为一种信号分子，引起植物体内相关的抗氧化酶类的合成，降低逆境条件导致的伤害；另一方面，发生氧化胁迫的细胞其细胞膜通透性改变，进而引发细胞功能的紊乱，甚至导致细胞死亡。Tian等发现，在草莓愈伤组织形成再生芽过程中伴随H2O2产生，在愈伤组织分化的早期超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, S0D)活性增强，随着组织的分化变异而逐渐降低,培养的前5天过氧化氢酶(Catalase，CAT)的活性持续下降，随后逐渐增强，在低再生能力的愈伤组织中检测到较高的O2-含量和较低H2O2含量，几乎没有检测到SOD活性，表明H2O2参与了草莓愈伤组织形态建成过程，可能在芽原基形成过程中起到信号分子的作用。在枸杞叶片组织培养中发现，在愈伤组织形成初期细胞内的H2O2含量增加，当在培养基中添加200 μ M H2O2培养15天后体细胞胚胎发生率得到最`大值，高浓度的H2O2 (300 μ Μ)反而抑制胚胎的发生，认为H2O2影响愈伤组织的分化，当细胞`内有适量H2O2存在时有利于植株再生，H2O2可能是作为信号分子参与了枸杞胚性愈伤组织发上相关基因的表达，刺激胚性细胞的形成。在冰叶日中花子叶下胚轴的培养过程中发现，低CAT活性和高浓度的H2O2有利于再生芽的分化，H2O2浓度的增加破坏了原有的氧化平衡，认为H2O2可能促进了与形态发生相关基因的表达。以上结果说明，H2O2在植物胚性愈伤组织形成和植株再生过程中具有重要作用。但是，关于H2O2在小麦幼培养中的效果及其适宜浓度的研究还没有报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种提高小麦幼胚再生率的组织培养方法。
[0005]本发明所提供的提高小麦幼胚再生率的组织培养方法，具体可包括如下步骤:
[0006](I)将待培养的小麦幼胚置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得到胚性愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基中含有终体积分数为0.0015-0.003%。的过氧化氢(H2O2)；
[0007](2)将所述胚性愈伤组织转移到分化培养基上进行培养，得到再生小麦植株。
[0008]在所述方法中，所述小麦幼胚可为心形期幼胚，具体为开花授粉后13-14天，直径为1.0-1.2mm的小麦幼胚。
[0009]在本发明中，所述愈伤组织诱导培养基具体为在SD2培养基中加入终体积分数为0.0015-0.003%。的过氧化氢后得到的培养基。
[0010]在所述方法中，所述愈伤组织诱导培养基中的所述过氧化氢是在所述SD2培养基冷却至65 °C左右时加入的。
[0011]其中，所述SD2培养基组成为:MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、VBJ.0mg/L、谷氨酰胺 150mg/L、2, 4-D2.0mg/L、鹿糖 30g/L、植物凝胶(Phytagel)2.4g/L,pH 值 6.0。以上各浓度均为相应物质在所述SD2培养基中的终浓度。
[0012]具体而言，所述SD2培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2P041700mg/L、KI0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuSO4 *5H200.025mg/L,CoCl2 *6H200.025mg/L, FeSO4 *7H2027.8mg/L、Na2-EDTA *2H2037.3mg/L、鹿糖 30g/L、维生素 B1Img/L谷氨酰胺 150mg/L、2, 4-D2.0mg/L、植物凝胶(Phytagel)2.4g/L，pH 值为 6.0ο
[0013]在所述方法中，所述分化培养基可为FHCK培养基。
[0014]其中，所述FHCK培养基的组成为:MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、MS维生素、蔗糖20g/L、植物凝胶(Phytagel)2.4g/L，pH值6.0。以上各浓度均为相应物质在所述FHCK培养基中的终浓度。
[0015]具体而言，所述FHCK培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2P041700mg/L、KI0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuSO4 *5H200.025mg/L,CoCl2 *6H200.025mg/L, FeSO4 *7H2027.8mg/L、Na2-EDTA *2H2037.3mg/L、维生素 Bilmg/UVujj0.5mg/L、烟酸 0.5mg/L、甘氨酸 2mg/L、肌醇 100mg/L、鹿糖 20g/L、植物凝胶(Phytagel) 2.4g/L, pH 值为 6.0。
[0016]在所述方法的步骤(I)中，将所述待培养的小麦幼胚置于所述愈伤组织诱导培养基上(盾片朝上)进行培养，其培养条件具体可为:黑暗、温度24-26°C (如25°C)、时间20-25天(如21天)。
[0017]在所述方法的步骤(2)中，将所述胚性愈伤组织转移到所述分化培养基上进行培养，其培养条件具体可为:光照10小时/天、光强3500LX、温度24-26°C (如25°C)、时间15-25 天(如 21 天)。
[0018]在所述方法中，所述小麦的品种具体可为如下中的至少一种:扬麦18、中国春、济麦22、京冬18、川农16、宁春4号、扬麦20和CB031。
[0019]更加具体的，当所述小麦为扬麦18、川农16、宁春4号或CB031时，所述愈伤组织诱导培养基中所述过氧化氢的终体积分数以0.0015-0.003%。为好；当所述小麦为中国春、济麦22或扬麦20时,所述愈伤组织诱导培养基中所述过氧化氢的终体积分数以0.0015%。为好。[0020]本发明的再一个目的是提供一种培养基。
[0021]本发明所提供的培养基为在SD2培养基中加入终体积分数为0.0015-0.003%。的
过氧化氢后得到的培养基。
[0022]所述培养基可用于提高所述小麦幼胚组织培养植株再生率。
[0023]在本发明中，所采用的所述过氧化氢(H2O2)原液为西陇化工股份有限公司产品(AR级，CAS编号:7722-84-1 )，为体积分数30%的过氧化氢水溶液。
[0024]以上所有的所述“在所述SD2培养基中加入终体积分数为0.0015-0.003%。的过氧化氢”，均为:向所述SD2培养基中加入体积分数为0.3%的过氧化氢水溶液(用水对体积分数30%的过氧化氢水溶液进行100倍稀释所得)(H202储藏液)，使所述过氧化氢的终体积分数为 0.0015-0.003%ο
[0025]现有的小麦幼胚培 养方法中没有在愈伤组织诱导培养基中添加H2O2的步骤，本发明在小麦幼胚培养愈伤组织诱导培养基中添加不同体积百分数的H2O2,在适宜H2O2用量下显著提高了多个小麦基因型幼胚培养植株再生率，具有很好的实际应用价值。
[0026]实验证明，利用本发明方法对小麦品种扬麦18幼胚在添加不同体积百分数的H2O2(0,0.0015%。、0.003%。和0.0045%。)的SD2愈伤组织诱导培养基上进行培养，研究H2O2对小麦幼胚再生的影响。结果发现，当H2O2体积分数为0.0015%。、0.003%。时再生率分别为365.56%、419.05%，与不添加H2O2的对照(再生率为141.18%)相比有显著提高，H2O2体积分数为0.0045%。时植株再生率低于对照,表明小麦幼胚愈伤组织诱导培养基中H2O2的适宜用量为0.0015-0.003%。。本发明的发明人进一步利用该方法对小麦品种中国春、济麦22、京冬18、川农16、宁春4号、扬麦20和CB031幼胚在添加适宜用量H2O2 (体积分数0.0015%。和0.003%。)的改良SD2培养基上进行培养，以不添加H2O2的SD2培养基为对照，结果发现，添加体积分数0.0015%。的H2O2显著提高了小麦品种中国春、济麦22、川农16、宁春4号、扬麦20和CB031幼胚培养植株再生率，添加体积分数0.003%。的H2O2显著提高了小麦品种川农16、宁春4号、CB031幼胚培养植株再生率。表明小麦幼胚愈伤组织诱导培养基中添加适宜浓度适宜用量H2O2 (体积分数0.0015%。和0.003%。)能够提高多数小麦品种幼胚培养植株再生率，具有普遍效果，不同小麦品种适宜添加的H2O2浓度略有不同。
[0027]本发明通过在SD2愈伤组织诱导培养基中添加H2O2，发现小麦幼胚再生率明显提高，对再生容易的小麦品种如扬麦18、京冬18、CB031和再生较难的小麦品种如济麦22、宁春4号、扬麦20均有效果，这对于利用基因工程途径和细胞工程途径改良优良小麦品种具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为不同用量H2O2对小麦品种扬麦18幼胚再生效果的影响。其中,A表不在含体积分数0%。H2O2的培养基上的再生效果；B表示在含体积分数0.0015%。H2O2的培养基上的再生效果；c表不在含体积分数0.003%。H2O2的培养基上的再生效果；D表不在含体积分数0.0045%。H2O2的培养基上的再生效果。
[0029]图2为不同小麦品种在适宜浓度H2O2下的再生效果比较。其中，A表示中国春在对照培养基(体积分数0%。H2O2)上的再生效果；B表示中国春在含体积分数0.0015%。H2O2的培养基上的再生效果；C表示济麦22在对照培养基(体积分数0%。H2O2)上的再生效果；D表示济麦22在含体积分数0.0015%。H2O2的培养基上的再生效果；E表示川农16在对照培养基(体积分数0%。H2O2)上的再生效果；F表示川农16在含体积分数0.0015%。H2O2的培养基上的再生效果；G表示宁春4号在对照培养基(体积分数0%。H2O2)上的再生效果；H表示宁春4号在含体积分数0.0015%。H2O2的培养基上的再生效果；1表不扬麦20在对照培养基(体积分数0%。H2O2)上的再生效果J表示扬麦20在含体积分数0.0015%。H2O2的培养基上的再生效果。Q表示CB031在对照培养基(体积分数0%。H2O2)上的再生效果；L表示CB031在含体积分数0.0015%。H2O2的培养基上的再生效果。
【具体实施方式】
[0030]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]小麦幼胚的定义:小麦子房授粉后发育13-14天的小麦幼嫩籽粒上剥取的小麦未成熟胚。
[0033]小麦品种扬 麦18、中国春、济麦22、京冬18、川农16、宁春4号、扬麦20和CB031:中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心无偿向社会提供。
[0034]小麦品种中国春、宁春4号:记载于“石珍源等.小麦大龄幼胚再生性能改进与农杆菌转化.中国农业科学，2011，44 (2):225-232” 一文中；
[0035]小麦品种扬麦18:记载于“李欣等.十二个小麦新品种成熟胚再生性能与农杆菌侵染敏感性评价.中国农业科技导报,2012，14(2):40-46”一文中；
[0036]小麦品种济麦22:记载于 “Tao et al.1mprovement of Plant Regenerationfrom Immature Embryos of Wheat Infected Agrobacterium tumefaciens.AgriculturalSciences in China, 2011，10 (3): 317-326” 一文中；
[0037]小麦品种京冬18:记载于“单福华等.国审冬小麦新品种京冬18的选育.北京农业，2012,6:20-21” 一文中；
[0038]小麦品种川农16:记载于“李伟等.小麦新品种川农16的分子鉴定.麦类作物学报，2004，24(1):6-10” 一文中；
[0039]小麦品种扬麦20:记载于“丁锦峰等.后期追氮时期对扬麦20花后光合物质生产力和产量的影响.扬州大学学报(农业与生命科学版),2012,33(3):56_62” 一文中；
[0040]小麦品种CB031:记载于“曾祥艳等.小麦多基因聚合体YW243的改良与利用.作物学报，2006年第05期” 一文中；
[0041]其中，小麦品种中国春、济麦22和宁春4号属于幼胚再生力较低的小麦基因型，详见参考文献“She et al.Efficient Regeneration Porential is Closely Related toAuxin Exposure Time and Catalase Metabolism During the Somatic Embryogenesisof Immature Embryos in Triticum aestivum L.Molecular Biotechnology,2013,54:451-460”。
[0042]SD2培养基:溶剂为水，溶质及其浓度如下:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2PO41700mg/L、KI0.83mg/L、H3B036.2mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H200.025mg/L、CoCl2.6H200.025mg/L, FeSO4.7H2027.8mg/L、Na2-EDTA.2H2037.3mg/L、蔗糖 30g/L、维生素 B1Img/L谷氨酰胺 150mg/L、2, 4-D2.0mg/L、植物凝胶(Phytagel )2.4g/L,pH 值为 6.0。采用121°C高压湿热灭菌15分钟。
[0043]FHCK培养基:溶剂为水，溶质及其浓度如下:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2PO41700mg/L、KI0.83mg/L、H3B036.2mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H200.025mg/UCoCl2.6H200.025mg/L, FeSO4.7H2027.8mg/L、Na2-EDTA.2H2037.3mg/L、维生素 BJmg/L、VB60.5mg/L、烟酸 0.5mg/L、甘氨酸 2mg/L、肌醇 100mg/L、鹿糖 20g/L、植物凝胶(Phytagel)2.4g/L，pH值为6.0。采用121°C高压湿热灭菌15分钟。
[0044]过氧化氢原液:为西陇化工股份有限公司产品(AR级，CAS编号:7722_84_1 )，为体积分数30%的过氧化氢水溶液。用微量移液器准确吸取200 μ I H2O2原液，加入到20ml蒸馏水中，配制得到过氧化氢体积百分数为0.3%的储藏液，用0.25μπι规格的微孔滤膜过滤灭菌，4°C冷柜中避光保存。使用时，在SD2培养基高压湿热灭菌后在室温下冷却至65°C左右，根据处理加入不同用量经过滤灭菌的H2O2储藏液。
[0045]实施例1、SD2培养基中添加不同用量H2O2对小麦扬麦18幼胚再生效果的影响
[0046]本实施例中，以小麦品种扬麦18为试验对象，其小麦幼胚的组织培养步骤如下:
[0047]一、小麦幼穗的获得
[0048]将小麦扬麦18种植在中国农业科学院作物科学研究所温室(2011年9月)，开花授粉后13-14天(2012年I月)，收集小麦扬麦18未成熟麦穗，此时幼胚为心形期幼胚，其直径为 1.0-1.2mmο
[0049]二、小麦未成熟籽粒灭菌
[0050]从小麦扬麦18未成熟麦穗上取其未成熟籽粒,70% (体积分数)酒精表面消毒I分钟，15% (体积分数)次氯酸钠灭菌15-20分钟，无菌水冲洗4-5次。
[0051]三、组织培养
[0052]1、诱导培养产生胚性愈伤组织
[0053]用灭过菌的手术刀片在未成熟籽粒上切去胚尖，然后将小麦幼胚取出，盾片朝上接种至添加不同终体积分数H2O2 (0,0.0015%。、0.003%。和0.0045%。)的SD2培养基上，每个培养皿接种30-35枚小麦幼胚，以不添加H2O2的SD2培养基为对照，25°C、黑暗条件下培养21天诱导胚性愈伤组织。
[0054]2、分化培养得到小麦再生植株
[0055]将步骤I获得的胚性愈伤组织转移到FHCK培养基上培养21天(光照时间为每天10小时，光照强度为3500LX，温度为25°C)，分化得到小麦再生绿芽。
[0056]其间，记录接种幼胚数，统计愈伤组织数、胚性愈伤组织数、分化愈伤数、再生芽数、胚性愈伤组织诱导率、分化愈伤率、再生率。实验设3次重复，结果取平均值。
[0057]胚性愈伤组织诱导率(%)=(胚性愈伤组织数+接种幼胚数)X 100
[0058]分化愈伤率(%)=(分化愈伤数+接种幼胚数)XlOO
[0059]再生率(%)=(再生芽数+接种幼胚数)X 100
[0060]四、不同浓度H2O2对小麦幼胚再生效果的比较
[0061]小麦扬麦18幼胚经在含不同浓度H2O2培养基上培养后的再生结果如表I和图1所示。从表中可以看出，当培养基中H2O2体积分数为0.0015%。、0.003%。时再生率分别为365.56%、419.05%,不添加H2O2的对照再生率为141.18%，2个处理相比对照有显著提高，差异达显著水平(P〈0.05)。但当培养基中H2O2体积分数为0.0045‰时植株再生率为121.9%，略低于对照，没有显著差异。表明小麦幼胚愈伤组织诱导培养基中H2O2的适宜用量为 0.0015-0.003‰。[0062]表I不同用量H2O2对小麦品种扬麦18幼胚培养再生效果的影响
[0063]
【权利要求】
1.一种提高小麦幼胚再生率的组织培养方法，包括如下步骤: (1)将待培养的小麦幼胚置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得到胚性愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基中含有终体积分数为0.0015-0.003%。的过氧化氢； (2)将所述胚性愈伤组织转移到分化培养基上进行培养，得到再生小麦植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述小麦幼胚为心形期幼胚。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述愈伤组织诱导培养基为在SD2培养基中加入终体积分数为0.0015-0.003%。的过氧化氢后得到的培养基。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述分化培养基为FHCK培养基。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，将所述待培养的小麦幼胚置于所述愈伤组织诱导培养基上进行培养，培养条件为:黑暗、温度24-26°C、时间20-25 天。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，将所述胚性愈伤组织转移到所述分化 培养基上进行培养，培养条件为:光照10小时/天、光强3500Lx、温度24-26°C、时间 15-25 天。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:所述小麦的品种为如下中的至少一种:扬麦18、中国春、济麦22、京冬18、川农16、宁春4号、扬麦20和CB031。
8.培养基，其特征在于:所述培养基为在SD2培养基中加入终体积分数为0.0015-0.003%。的过氧化氢后得到的培养基。
9.权利要求8所述培养基在提高小麦幼胚组织培养植株再生率中的应用。
【文档编号】A01H4/00GK103444533SQ201310397587
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】叶兴国, 王新敏, 王轲, 杜丽璞, 赵佩, 张伟, 徐惠君 申请人:中国农业科学院作物科学研究所