一种大花萱草的繁殖方法
【专利摘要】本发明公开了一种大花萱草的繁殖方法，包括如下步骤：（1）选择外植体并消毒处理；（2）将消毒后的外植体接种到芽诱导培养基上，送入培养室进行芽诱导培养；（3）将分化后的外植体转移到继代培养基上进行继代培养，得到分化苗；（4）将分化苗接种到生根培养基上进行生根培养；（5）炼苗、移出培养室进行移栽；其中，所述大花萱草为二倍体或多倍体。本发明在消毒时间和效果、操作方法和再生效率、生产成本等方面都明显优于其他植物组培快繁，所以建立的规模化商品生产体系稳定、能够满足规模化快繁生产。本发明主要应用于大花萱草新品种的快速扩繁，使其快速走向市场的一种有效途径，改变国内新品种推出较慢的现状。
【专利说明】一种大花萱草的繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种大花萱草的繁殖方法，特别是涉及一种使用组织培养技术繁殖大花萱草的方法。
【背景技术】
[0002]大花萱草(Hemerocallis hybridus)种质资源丰富,功用广泛,“观为花、食为菜、用为药”，市场对其需求不断增加，尤其是作为观赏植物。其品种繁多，花型秀美，叶色翠绿，花色丰富，花期较长，是融观叶与观花于一体的优良园林绿地花卉，受到世界各国人民普遍喜爱。因具有繁殖容易，管理粗放，适应性和抗性强等特点，符合我国建设节约型园林的要求，在园林种植中，萱草可在花坛、花境、路边、草坪中丛植、行植或片植，也可作切花，是园林绿化的好材料，具有广阔的应用前景。
[0003]大花萱草的繁殖方式主要是分株繁殖，花苔上产生侧芽的品种也可扦插繁殖，由于目前市场的大花萱草品种都是杂交种播种繁殖后代会分离，因此播种繁殖主要应用于大花萱草杂交育种中的新品种选育。以上方式可以满足生产需求，但是对于大花萱草杂交育种中选育出的优良新品种，如果要进行大面积推广，分株繁殖的年繁殖系数为5-10，如仅依靠传统的繁殖使已选育出的新品种面市至少需要6-8年才可有一定规模。因此研究大花萱草快速繁殖的技术和方法，加速大花萱草新品种的推广，具有重要的理论和现实意义。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种可以快速大量繁殖大花萱草的方法。
[0005]一种大花萱草的繁殖方法，包括如下步骤:
[0006]( I)选择外植体并消毒处理；
[0007](2)将消毒后的外植体接种到芽诱导培养基上，送入培养室进行芽诱导培养；
[0008](3)将分化后的外植体转移到继代培养基上进行继代培养，得到分化苗；
[0009](4)将分化苗接种到生根培养基上进行生根培养；
[0010](5)炼苗、移出培养室进行移栽；
[0011]其中，所述大花萱草为二倍体或多倍体。
[0012]本发明所述的大花萱草的繁殖方法，其中所述外植体为幼嫩茎尖或幼嫩花苔。
[0013]本发明所述的大花萱草的繁殖方法，其中所述消毒过程具体为:切取大花萱草幼嫩茎尖或幼嫩花苔，与洗洁精混合在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75%的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗3-5遍,最后用0.1%升汞消毒幼嫩茎尖12-14min或消毒幼嫩花苔8_10mino
[0014]本发明所述的大花萱草的繁殖方法，其中所述芽诱导培养基为MS+6-BA2.0mg.L_1+NAA0.2mg.L'
[0015]本发明所述的大花萱草的繁殖方法，其中所述芽诱导过程具体为:
[0016]当外植体为幼嫩茎尖时，将消毒后的幼嫩茎尖切去顶端的叶子和基部的根，保留基盘，切成I厘米大小茎段后接入所述芽诱导培养基中；
[0017]当外植体为花苔时，将花苔两端切去，切成I厘米茎段并保留有侧芽的部位，接入所述芽诱导培养基中；
[0018]接入所述芽诱导培养基中的外植体形成愈伤组织并分化成再生苗，在接入的所述外植体分生出2-3个新芽时进行继代。
[0019]本发明所述的大花萱草的繁殖方法，其中所述二倍体大花萱草的继代培养基为MS+6-BA2.0mg.L_1+NAA0.1mg.1 ;所述多倍体大花萱草的继代培养基为MS+6-BA3.0-4.0mg.'+ΝΑΑΟ.1mg.L—1 ;增值系数均在3.0以上，有些二倍体萱草增殖系数高达5.0。
[0020]本发明所述的大花萱草的繁殖方法，其中在继代过程中，所述二倍体品种25-30天转接一次，所述多倍体品种30-40天转接一次。
[0021]本发明所述的大花萱草的繁殖方法，其中所述生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg.L—1。
[0022]本发明所述的大花萱草的繁殖方法，其中步骤(5)具体为:把生根后的组培苗在炼苗室中开盖锻炼3-5d，然后移栽到泥炭:珍珠岩3:1的基质中培养，得到成品。
[0023]本发明所述的大花萱草的繁殖方法，其中所述培养室的温度为25°C，光照时间为12h.cf1，光照强度约 25-30 μ mo I.π2.s'
[0024]本发明所述的大花萱草的繁殖方法，其中所述芽诱导培养基、继代培养基和生根培养基中均添加3%质量百分比的蔗糖和0.8%质量百分比的琼脂，PH为5.8。
[0025]本发明大花萱草的繁殖方法与现有技术不同之处在于:
[0026]本发明采用组织培养的方法，通过消毒外植体，得到无菌系，继而利用不同种类和不同浓度的外源激素的配比，对组培苗进行继代增殖、生长及生根进行筛选、调控、最后确定最佳外植体与培养基的配比，使其能应用于工厂化生产。创新点在于本发明的组培配方是将两种不同类型大花萱草品种进行大量扩繁的最佳组合，可以快速大量的繁殖组培苗，以适应花卉种苗市场的需要，尚属国内首例。
[0027]本发明对两种不同类型的大花萱草的幼嫩茎尖、幼嫩花苔等外植体进行了系列组培快繁研究，取得了较好的结果，两种外植体各有优缺点，幼嫩茎尖取材不受季节限制但影响植株生长，幼嫩花苔取材受季节限制但是不影响植株正常生长。可以根据材料的多少季节情况选择适合的外植体材料。本发明在消毒时间和效果、操作方法和再生效率、生产成本等方面都明显优于其他植物组培快繁，所以建立的规模化商品生产体系稳定、能够满足规模化快繁生产。本发明主要应用于大花萱草新品种的快速扩繁，使其快速走向市场的一种有效途径，改变国内新品种推出较慢的现状。
[0028]本发明建立了两种不同类型大花萱草利用两种不同外殖体的组培方法，幼嫩花苔和茎尖依次通过洗洁精、75%酒精和0.l%HgCl2溶液浸泡获得无菌外殖体，灭菌效果较好，后续培养污染较少，死亡率较低，再用芽诱导培养基诱导培养形成愈伤组织，愈伤组织分化形成芽点进而分化成小苗，得到 大花萱草组培苗，将小苗转接到增殖培养基中，小苗基部分生出幼嫩芽点，一个月可增殖一次。且增殖系数始终保持在4.5-5.5之间，因此培育周期短，为实现通过杂交育种手段选育的大花萱草新品种的快速扩繁，早日上市奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】[0029]图1A为本发明接入芽诱导培养基的花苔产生了愈伤组织；
[0030]图1B为本发明接入芽诱导培养基的茎段产生了愈伤组织并形成了新芽；
[0031]图1C为本发明接入芽诱导培养基的花苔产生的愈伤组织形成了新芽；
[0032]图1D为本发明诱导出的二倍体品种增殖过程中中的组培苗；
[0033]图1E为本发明继代增殖过程中的组培苗；
[0034]图1F为本发明诱导出的多倍体品种增殖过程中的组培苗；
[0035]图1G为本发明生根培养后需移栽的小苗；
[0036]图1H为本发明移栽后的再生苗。
【具体实施方式】
[0037]实施例1
[0038]如图1所示，一种大花萱草的繁殖方法，采用组织培养技术，具体包括如下步骤:
[0039](I)切取大花萱草幼嫩茎尖或花苔作为组织培养外植体，所述大花萱草为二倍体或多倍体，将采集到的外植体先混合洗洁精在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75%的酒精消毒30s，在用无菌水冲洗3-5遍，之后用0.1%升汞消毒幼嫩茎尖12-14min，幼嫩花苔8_10mino
[0040](2)将消毒后的外植体接种到芽诱导培养基上(见图1A)，送入培养室进行无菌培养，培养室的培养温度为25°C ,光照时间为12h.d \光照强度约25-30 μ mo I.m 2.s S在这一过程中，根据不同培养基上各外植体分化的情况的不同筛选出芽诱导得较好的外植体种类和培养基类型。效果最好的外植体为幼嫩茎尖和幼嫩花苔，培养基为MS+6-BA2.0mg.L_1+NAA0.2mg.L—1。
[0041]其中，所述芽诱导过程具体为:
[0042]当外植体为幼嫩茎尖时，将消毒后的幼嫩茎尖切去顶端的叶子和基部的根，保留基盘，切成I厘米大小茎段后接入所述芽诱导培养基中；
[0043]当外植体为花苔时，将花苔两端切去，切成I厘米茎段并保留有侧芽的部位，接入所述芽诱导培养基中(见图1A)；
[0044]接入所述芽诱导培养基中的外植体形成愈伤组织并分化成再生苗，在接入的所述外植体分生出2-3个新芽时进行继代(见图1B和图1C)。
[0045](3)将分化后的外植体继代到继代增殖培养基上进行继代培养(有3个以上分化较好的芽)，；二倍体大花萱草效果最好的继代培养基为MS+6-BA2.0mg.'+ΝΑΑΟ.1mg.1 ；多倍体大花萱草效果最好的继代培养基为MS+6-BA3.0-4.0mg.'+ΝΑΑΟ.1mg.L'在继代过程中，所述二倍体品种25-30天转接一次，所述多倍体品种30-40天转接一次(见图1D，图1E和图1F)。
[0046](4)将生长健壮的分化苗接种到生根培养基上进行生根培养基上，进行生根培养，生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg.L'
[0047](5)做完生根培养的分化苗下一步要经过炼苗，然后移栽，从而真正的成为大花萱草商品种苗。所述炼苗过程为:把生根较好的组培苗在炼苗室中打开盖锻炼3-5d，然后移栽到泥炭:珍珠岩=3:1的基质中，移栽成活率在95%左右(见图1G和图1H)。
[0048]所述芽诱导培养基、继代培养基和生根培养基中均添加3% (质量百分比)的蔗糖和0.8% (质量百分比)的琼脂，PH为5.8。
[0049]所述培养室的培养温度为25 °C，光照时间为12h.cf1，光照强度约25-30 μ mo I.m2.s-1,移栽:泥炭:珍珠岩=3:1。
[0050]其中:
[0051]1、MS培养基配方单:工作液浓度单位mg/L
[0052]大量元素:NH4N031650、KNO31900,CaCl2.2H20440、MgSO4.7H20370、KH2PO4170 ；
[0053]微量元素:ΚΙ0.83、Η3Β036.2、MnSO4.4Η2022.3、ZnS047H208.6、Na2MnO4.2Η200.25、CuSO4.5Η200.025、CoCl2.6Η200.025。
[0054]铁盐:FeS047H2027.8、Na2_EDTA2H2037.3。
[0055]有机物质:肌醇100、烟酸0.5、盐酸毗多醇0.5、烟酸硫胺素0.1、甘氨酸2.0。
[0056]2、NAA为萘乙酸
[0057]3、6_BA为6_苄基嘌呤
[0058]试验中，二倍体萱草和多倍体萱草分别作了 4个品种，二倍体萱草继代培养基为MS+6-BA2.0mg'+ΝΑΑΟ.1mg.1很容易实现增殖(见图1D)，多倍体萱草继代培养基为MS+6-ΒΑ3.0-4.0mg ?L^+NAA0.1mg.?Λ不同的多倍体萱草品种所需6-BA浓度有所不同，可根据情况在3.0,3.5,4.0间进行调节，一般植株越粗壮个体越大的品种需要的6-ΒΑ浓度越高；而且多倍体萱草和二倍体萱草相比其增值系数要低(见图1F)，继代周期也相对长一些。
[0059]试验结果显示，二倍体萱草4个品种中，品种I增殖系数为5.0,品种2增值系数为
4.5，品种3 (Stella De Oro)增值系数为4.6，品种4 (James marsh)增殖系数为4.8 ;多倍体品种 I (Canadian Border Patrol)增值系数为 3.6,品种 II (Daring Dilemma)增殖系数为 3.3,品种 III (Straw Berry Candy)增殖系数为 3.0,品种 IV (Gentle Shepherd)增殖系数为3.6。
[0060]以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内 。
【权利要求】
1.一种大花萱草的繁殖方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)选择外植体并消毒处理； (2)将消毒后的外植体接种到芽诱导培养基上，送入培养室进行芽诱导培养； (3)将分化后的外植体转移到继代培养基上进行继代培养，得到分化苗； (4)将分化苗接种到生根培养基上进行生根培养； (5)炼苗、移出培养室进行移栽； 其中，所述大花萱草为二倍体或多倍体。
2.根据权利要求1所述的大花萱草的繁殖方法，其特征在于:所述外植体为幼嫩茎尖或幼嫩花苔。
3.根据权利 要求2所述的大花萱草的繁殖方法，其特征在于:所述消毒过程具体为:切取大花萱草幼嫩茎尖或幼嫩花苔，与洗洁精混合在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75%的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗3-5遍，最后用0.1%升汞消毒幼嫩茎尖12_14min或消毒幼嫩花苔8-10min。
4.根据权利要求3所述的大花萱草的繁殖方法，其特征在于:所述芽诱导培养基为MS+6-BA2.0mg.L_1+NAA0.2mg.L'
5.根据权利要求4所述的大花萱草的繁殖方法，其特征在于: 所述芽诱导过程 具体为: 当外植体为幼嫩茎尖时，将消毒后的幼嫩茎尖切去顶端的叶子和基部的根，保留基盘，切成I厘米大小茎段后接入所述芽诱导培养基中； 当外植体为花苔时，将花苔两端切去，切成I厘米茎段并保留有侧芽的部位，接入所述芽诱导培养基中； 接入所述芽诱导培养基中的外植体形成愈伤组织并分化成再生苗，在接入的所述外植体分生出2-3个新芽时进行继代。
6.根据权利要求5所述的大花萱草的繁殖方法，其特征在于:所述二倍体大花萱草的继代培养基为MS+6-BA2.0mg. '+ΝΑΑΟ.1mg. 1 ;所述多倍体大花萱草的继代培养基为MS+6-ΒΑ3.0-4.0mg.I^+NAA0.1mg.L—1。
7.根据权利要求6所述的大花萱草的繁殖方法，其特征在于:在继代过程中，所述二倍体品种25-30天转接一次，所述多倍体品种30-40天转接一次。
8.根据权利要求7所述的大花萱草的繁殖方法，其特征在于:所述生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg.L—1。
9.根据权利 要求 1所述的大花萱草的繁殖方法，其特征在于:步骤(5)具体为:把生根后的组培苗在炼苗室中开盖锻炼3-5d，然后移栽到泥炭:珍珠岩3:1的基质中培养，得到成品O
10.根据权利要求1所述的大花萱草的繁殖方法，其特征在于:所述培养室的温度为25°C，光照时间 为12h.cf1，光照强度约25-30 μ mol.π2.s—1 ;所述芽诱导培养基、继代培养基和生根培养基中均添加3%质量百分比的蔗糖和0.8%质量百分比的琼脂，PH为5.8。
【文档编号】A01H4/00GK103461135SQ201310432315
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】赵天荣, 蔡建岗 申请人:宁波市农业科学研究院