改变水稻磷酸盐转运体基因OsPT8磷酸化位点法及用途
【专利摘要】本发明公开了一种改变水稻磷酸盐转运体基因OsPT8磷酸化位点的方法：将OsPT8蛋白序列可能的磷酸化位点进行基因工程修饰；将第517处氨基酸残基丝氨酸（Ser）突变为丙氨酸（Ala）；得修饰过的Ospt8基因序列。本发明还同时公开了一种提高水稻磷吸收能力的方法，将修饰过的Ospt8基因序列转入水稻，所得转基因水稻对磷的吸收能力增强；具体为：将所述修饰过的Ospt8基因序列，利用自身启动子启动，通过转基因的方法转入水稻。
【专利说明】改变水稻磷酸盐转运体基因0sPT8磷酸化位点法及用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程以及作物遗传改良领域。具体地说，本发明涉及一种通过对水稻磷酸盐转运体OsPTS的蛋白序列第517位氨基酸残基丝氨酸(Ser)以及其他可能的磷酸化位点进行基因工程改变。通过自身启动子启动，将改造过的0spt8基因转基因后可改变水稻的磷吸收能力。
【背景技术】
[0002]磷酸盐(Pi)转运体PHTl为膜结合型的蛋白质。PHTl蛋白进入内质网(Reticulum, ER),以适当的方向插入到I旲内(在系统移动中始终保持着N端和C端朝向胞质定位)，进行正确的构象折叠和修饰后以膜泡(Vesicle)的形式经高尔基体(Golgi)到达质膜。由此可知Pi转运体在分泌到质膜前其活性将受内输途径的相关调控，根据前人研究结果，PHTl蛋白从ER向质膜转运受植物特有的伴侣蛋白PHFl调控(Gonzalez et al.，2005)，细胞磷浓度将影响这种调控。
[0003](I)内质网中的伴侣蛋白PHFl
[0004]通过对酿酒酵母和动物细胞的研究，人们发现蛋白从ER到质膜的转运途径中的关键步骤是合成后的蛋白从ER到Golgi的COPII (coat protein II)膜泡正向运输(Barlowe, 2003b, a)。COPII 的形成是由 SARlGTPase 启动的，SARlGTPase 经 SEC12鸟苷酸置换因子活化后，可推动COPII膜泡包被的形成以及选择输出底物(Barlowe etal., 1993 ；Barlowe and Schekman, 1993)。将被运输的蛋白(Cargo)在并入 COPII 膜泡之前必需建立并维持一种适于进入分泌途径的正确构象，而这过程则需要该蛋白所特有的伴侣蛋白来协助(Herrmann et al.，1999;Barlowe, 2003b)。此外，若某些cargo不被COPII的组份所识别，就需要特有的转运受体协助来进入COPII膜泡(Herrmann etal.，1999;Barlowe, 2003b)。酿酒酵母中PH086蛋白就是这样的一个伴侣，可协助酵母中高亲和磷酸盐转运PH084正确地从ER输出，同输出PH084 —样，PH086基因也受到酵母中磷饥饿(PHO)信号途径的调控(Lau et al.，2000)。尽管PH084与植物中的高亲和磷转运体序列高度同源，且SEC12，SARl及其他COPII膜组份蛋白在植物中也已有报道(Neumann etal.，2003; Jurgens, 2004; Bassham et al.，2008)，拟南芥基因组中却没有搜索到 PH086 类似的基因。2005年，Gonz等人通过遗传筛选的方法发现拟南芥中PHFl基因突变后会影响植物体对Pi的吸收转运(Gonzalez et al.，2005)。转基因研究表明PHTl; I无法正确定位于拟南芥Phfl突变植株的细胞质膜，而是滞留于ER中。这类蛋白靶向运输缺陷在生长素输入蛋白AUXl中也有报道，axr4突变体因为缺失了 ER里的一个伴侣蛋白，造成AUXl蛋白滞留于ER中，从而使植物对生长素不敏感(Dharmasiri et al.，2006)。
[0005]拟南芥中PHFl在各个组织中都见表达，并且受缺磷诱导和和PHRl调控，因此PHFl可能普遍调控全体PHTl蛋白(Gonzalez et al.，2005)。2011年Bayle等人进一步发现PHFl在蛋白水平也响应缺磷诱导，根部外皮层毛及其着生的细胞处表达尤为强烈(Bayleet al.，2011)。PHFl基因编码一个SEC12类似结构的蛋白，但却缺失其作为鸟苷酸置换因子所必需的保守残基，因此尽管PHFl在PHTl内膜运输途径的早期发挥作用，但只定位于ER，不参与COPII膜泡在ER输出位点上的复合物组成(Gonzalez et al., 2005; Bayle etal.，2011)。由此可推断PHFl对于PHTl的协助过程发生在其进入COPII膜泡之前。最近，邱子珍研究组已经通过分裂泛素酵母互作系统验证了 PHFl和PHTl家族成员的相互作用，从而为PHFl作为PHTl的伴侣蛋白提供了更为直接分子证据(Bayle et al.，2011)。
[0006]对PHFl进行结构分析发现其N端朝向胞质，包含与Tupl蛋白C末端结构域类似的七次WD40重复序列(Sprague et al.，2000)。WD40螺旋是真核生物中最多见的结构域之一,并经常作为蛋白与DNA之间互作的平台而参与到多种细胞生命过程中(Xu andMin, 2011)，已有报道降解复合体，SCF泛素连接酶可通过其WD40结构域增强对磷酸化目标底物的结合从而使其泛素化(Orlicky et al., 2003; Wu et al., Hao et al.，2007)。值得注意的是，尽管功能上已经有所区别。PHFl的这种二级结构与其他的SEC12蛋白非常同源蛋白非常同源(Letunic et al., 2004;Gonzalez et al.，2005)。除此以外，所有的PHFl 和SEC12蛋白的C末端都具有一段跨膜结构，拟南芥中phfl-1突变体因提前终止使蛋白失去了这一跨膜短肽而导致其功能完全丧失(Gonzalez et al.，2005)。
[0007](2)磷酸化修饰对PHTl内膜运输过程的影响
[0008]蛋白质的磷酸化是一种广为人知的翻译后修饰。除了能够调控活性以外，其最重要的功能之一就是影响蛋白革巴向运输。例如拟南芥NRT1.1 (Barz et al.，2003;Martin etal.，2008)及水通道蛋白PIP2; I (Prak et al.，2008)都需要被磷酸化才能最终运送到细胞质膜上。
[0009]2004年，Nuhse等人通过分析拟南芥膜蛋白磷酸化组学发现至少两个PHTl家族的转运体(PHT1;和PHT1;4)会受到磷酸化修饰，其中PHT1; I的磷酸化位点为蛋白上的第520位的丝氨酸。2011年,Bayle等人不但验证了前的数据，还发现PHTl; I蛋白(Ser_514,Ser-520)和PHTl; 4蛋白(Ser_524) C末端的多个氨基酸磷化现象会受到外界供磷水平的调控，这些数据表明植物很可能利用磷酸化来调控PHTl蛋白的靶向运输(Nuhse etal., 2004;Hem et al., 2007 ；Bayle etal.，2011)。通过突变PHTl; I 蛋白上可能的氨基酸位点使之成为持续磷化蛋白形式，研究人员发现只有PHTl; I的第514位丝氨酸突变成天冬氨酸(Asp)时可使PHT1;1突变蛋白滞留在内质网中，这表明PHTl; I蛋白从ER输出受磷酸化调节。通过比对PHTl家族的蛋白，人们预测在该类家族的C末端磷酸化位点的附近存在一个保守ER输出信号位点(D/E-X-D/E)。PHTl; I的第516位到519位的蛋白基序除PHTl; 8、PHTl; 9外在所有的PHTl蛋白中都是保守的(Bayle et al.，2011)。如若PHTl蛋白受到磷酸化修饰，相当于在ER输出识别基序附近增加了额外的负电荷，而这可能直接影响基序被识别阻碍PHTl蛋白从ER正常输出。当外界供磷水平较高时，PHTl; I蛋白受到的磷酸化修饰程度提高，从而可能影响其在质膜上的有效积累。
[0010]所涉及的参考文献具体如下:
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【发明内容】
[0030]本发明要解决的技术问题是提供一种提高水稻的磷吸收能力的方法。
[0031]为了解决上述技术问题，本发明提供一种改变水稻磷酸盐转运体基因OsPTS磷酸化位点的方法:将OsPTS蛋白序列可能的磷酸化位点进行基因工程修饰；将第517处氨基酸残基丝氨酸(Ser)突变为丙氨酸(Ala);得修饰过的OsptS基因序列。
[0032]本发明还通水提供了一种提高水稻磷吸收能力的方法:将0sPT8蛋白序列可能的磷酸化位点进行基因工程修饰；将第517处氨基酸残基丝氨酸(Ser)突变为丙氨酸(Ala)；得修饰过的OsptS基因序列；将修饰过的OsptS基因序列转入水稻，所得转基因水稻对磷的吸收能力增强。
[0033]作为本发明的提高水稻磷吸收能力的方法的改进:将所述修饰过的0spt8基因序列，利用自身启动子启动，通过转基因的方法转入水稻。
[0034]研究表明，植物磷酸盐转运体PHTl的磷酸化状态决定了其从ER向质膜转运效率。而Ser-514 (S514)被报道为拟南芥中PHTl; I的磷酸化调控关键位点。用0sPT8蛋白序列与拟南芥以及水稻PHTl家族基因同源性比对后发现，OsPTS蛋白序列第517位丝氨酸为S514的同源位点，是可能的磷酸化位点。将丝氨酸突变成丙氨酸(Ala)可以模拟非磷酸化形式的0sPT8蛋白，我们将0sPT8S517同源位点经过突变，突变成丙氨酸。
[0035]为了验证修饰后的蛋白功能，将修饰过的0sPT8S517A用0sPT8自身启动子启动，连入双元载体，转基因后发现，转基因水稻阳性苗磷吸收显著提高，叶片有效磷浓度可以提高2-5倍。因此，利用修饰过的OsPTSs5m可以提高水稻磷吸收能力。
[0036]综上所述，本发明包括对水稻磷酸盐转运体OsPTS的磷酸化位点的确定；对磷酸化位点进行基因工程修饰，通过自身启动子启动，转基因后改变水稻的磷吸收能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0038]图1是:水稻与拟南芥磷转运体PHTl家族成员羧基末端磷酸化位点联配分析:从NCBI上下载拟南芥9个PHT家族成员和13个水稻的同源蛋白做序列联配比对，发现OsPTS氨基酸第517为丝氨酸与拟南芥PHTl; I的第514位丝氨酸的最可能的同源位点。
[0039]图2 是 pCAMBIA1301-35S-EGFP 质粒图谱。
[0040]图3是0sPT8启动子驱动水稻0sPT8S517A在转基因水稻Ttl代植株阳性材料鉴定；图中WT(wild type，野生型)作为对照，数字1-9分别表示9个转基因株系，即株系1、株系2、……、株系9，结果显示在随机选取的9个Ttl转基因株系中，有7个潮霉素筛选为阳性，阳性率为TL 8%。取前3个株系，即PT8S517A-1，-2，_3，进行后续实验。
[0041]图4是转基因阳性苗 有效磷测定。结果显示从图3中选取的前3个阳性株系PT8S517A-1，-2，-3的有效磷含量都显著高于野生型。[0042]图5是对比例I转基因阳性苗有效磷测定；结果显示转基因阳性株系有效磷没有变化。
[0043]图6是对比例2转基因阳性苗有效磷测定；结果显示转基因阳性株系有效磷没有变化。
【具体实施方式】
[0044]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
[0045]实施例1、0sPT8定点突变
[0046]1、寻找可能的磷酸化位点:从NCBI上下载拟南芥9个PHT家族成员和13个水稻的同源蛋白做序列联配比对(图1)，发现0sPT8(SEQ ID NO:1)氨基酸第517和第512位丝氨酸是与拟南芥PHTl; I的第514位丝氨酸的最可能的同源位点。
[0047]2、定点突变引物设计:由于不同物种蛋白的密码子偏好不同，因此利用DNASTAR公司的Editseq软件对0sPT8中编码丙氨酸的密码子进行统计，发现0sPT8中GCG为主要的丙氨酸密码子，因此选择将PT8Ser-517突变为GCG (Ala)0通过设计带有突变碱基的引物，引物序列如下:
[0048]表1、0sPT8蛋白Ser的点突变引物
[0049]
【权利要求】
1. 改变水稻磷酸盐转运体基因OsPT8磷酸化位点的方法，其特征在于:将OsPT8蛋白序列可能的磷酸化位点进行基因工程修饰；将第517处氨基酸残基丝氨酸(Ser)突变为丙氨酸(Ala);得修饰过的Ospt8基因序列。
2.提高水稻磷吸收能力的方法，其特征在于:将OsPT8蛋白序列可能的磷酸化位点进行基因工程修饰；将第517处氨基酸残基丝氨酸(Ser)突变为丙氨酸(Ala);得修饰过的OsptS基因序列；将修饰过的OsptS基因序列转入水稻，所得转基因水稻对磷的吸收能力增强。
3.根据权利要求2所述的提高水稻磷吸收能力的方法，其特征在于:将所述修饰过的OsptS基因序列，利用自身启动子启动，通过转基因的方法转入水稻。
【文档编号】A01H5/00GK103614384SQ201310513975
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】吴平, 徐纪明, 陈婕妤, 王以锋 申请人:浙江大学