一种皱纹盘鮑精优质精子诱导和采集方法
【专利摘要】本发明属海洋生物【技术领域】，具体地讲是一种皱纹盘鮑优质精子的诱导和采集方法。包括：优质雄性亲鲍的选择,亲鲍阴干刺激,臭氧海水的制备,收集、检测精子的活力,受精率、孵化率的测定。该方法选择性腺成熟饱满的3-4龄雄性亲鲍，阴干刺激，置于紫外线照射的海水中，放于安静、黑暗环境，使之排精，采用离心收集高浓度的精子。将采集到的鲍鱼精子进行人工授精，受精率达到95%以上。证明采用这种精液收集方式所收集的鲍鱼精液可应用于生产时间和研究当中。本发明的皱纹盘鮑优质精子的诱导和采集方法对于皱纹盘鮑的人工繁育、种质保存及遗传多样性保护等方面有着重要意义。
【专利说明】一种皱纹盘鮑精优质精子诱导和采集方法
【技术领域】
[0001]本发明属海洋生物【技术领域】，具体地说是一种皱纹盘鮑精优质精子诱导和采集方法。
【背景技术】
[0002]皱纹盘鲍(Haliotis discushannai)属于腹足纲,原始腹足目，鲍科。是藻类食性的海洋大型原始腹足类，我国北方海水养殖贝类的主要品种之一，其个体较大。鲍肉肥美，为海产中的珍品，多供应高级宾馆和出口。除鲜食外，可加工成罐头或鲍鱼干，售价昂贵。鲍贝壳即有名的中药石决明，又是制作贝雕画的重要材料，市场对皱纹盘鮑的需求较大。近年来，由于养殖规模的不断扩大，加之皱纹盘鮑人工育苗的不断扩大，以及科研中大规模家系的构建等，不论在生产中还是科研工作中对皱纹盘鮑优质精液的需求也不断扩大。由于皱纹盘鮑解剖取得的精子活力弱，无法进行人工授精，另外皱纹盘鮑自然排放精液，时间不固定，不易控制，严重制约了皱纹盘鮑的养殖繁育。皱纹盘鮑优质精子的人工诱导和采集方法的建立可以在雄性皱纹盘鲍繁殖期随时诱导促使其排精，并且对亲鲍伤害小，可以多次利用，克服了亲鲍排精时间不固定的缺点，有利于皱纹盘鮑的杂交、选育及基因多样性的保护。同时获得优质高浓度的鲜精是建立其精子超低温冷冻保存方法的前提，建立皱纹盘鲍优质精子的诱导及采集方法为皱纹盘鲍精子冷冻保存奠定基础。因此，建立皱纹盘鮑精液采集方法对海水养殖业的发展以及生物多样性的保护具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种皱纹盘鮑精优质精子诱导和采集方法。
[0004]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:`[0005]一种皱纹盘鮑精优质精子诱导和采集方法:
[0006]a.优质亲鲍的选择，选择自然海区人工养殖的性腺饱满并呈乳白、淡黄色雄性亲鲍或将由自然海区人工养殖的雄性亲鲍经暂养性腺饱满并呈乳白、淡黄色雄性亲鲍；
[0007]b.亲鲍阴干刺激，将雄性亲鲍从暂养池中捞出，腹面朝上避光阴干刺激1.5-2小时；
[0008]c.将上述阴干刺激后的雄性亲鲍置于经紫外线照射过并升温至20-21°C的海水中，于黑暗环境下刺激0.5-1小时，直至排精；
[0009]d.将上述收集的精子离心收集浑浊液，即得皱纹盘鲍精子。
[0010]所述步骤a)是于5-6月份，选择自然海区人工养殖的翻转观察性腺饱满、肿胀，呈现乳白、淡黄色的3-4龄雄性亲鲍；或选择自然海区人工养殖的3-4龄，选择壳高12-15cm的雄性亲鲍于18-19°C下，以每立方米水体20-25个的暂养密度进行暂养，暂养3-7天，待雄性亲鲍性腺饱满、肿胀，呈现乳白、淡黄色并且雄鲍摄食、运动正常。
[0011]所述暂养时每天换水，并投喂海带和/裙带菜，平均每只雄鲍10-15g/天。
[0012]所述步骤b)将雄性亲鲍从暂养池中捞出，腹面朝上放置，浸润拧至半干的毛巾，固定、避光阴干刺激1.5-2小时。
[0013]所述将新鲜海水在15W的紫外灯下照射至海水升温至20_21°C，而后将阴干1.5-2h的雄性亲鲍置于其中。
[0014]进一步的说，取50L新鲜海水用15W的紫外灯下照射2.5h，同时加热棒将水温由18-19°C升至20-21°C，而后将阴干1.5_2h的雄性亲鲍置于其中。
[0015]所述步骤d将收集精子以3000-3500r/min的离心速度处理8_10分钟，弃上清，收集底部浑浊液，即为高浓度的精液，精子密度:106-107，保存于0-4°C。
[0016]将上述收集到的精液经过计算机辅助分析(CASAS)运动率高于95%，平均曲线运动速度高于90.0 μ m/s,且精子曲线运动速度均高于50 μ m/s, 25%以上的精子曲线运动速度高于100 μ m/s。
[0017]所述皱纹盘鲍精液与诱导雌性亲鲍的卵子的个数比为80-100: 1，混合后置于20°C的新鲜过滤海水中混合均匀，2h后取受精卵，检测受精率；其中新鲜过滤海水的量为卵子的体积量的10-15倍。
[0018]本发明具有如下优点:
[0019]1.本发明选择性腺发育良好的成年雄性亲鲍，通过简单的诱导即可获得优良的皱纹盘鮑精子；
[0020]2.通过本发明的诱导方式对亲鲍伤害小，亲鲍可以重复利用，降低了成本；
[0021]3.本发明优质精子诱导所需仪器、设备、简单，方便可行，易于操作；
[0022]4.本发明诱导采集方式不受地点限制，在皱纹盘鮑性成熟期间均可随时随地诱导排精，诱导排出的精子活力高，方便快捷；
[0023]5.通过该方法可以获得高浓度、优质的皱纹盘鲍精子，方便进行大规模人工授精、家系的构建；
[0024]6.受:精的精子质量好，人工授精的受:精率、鮮化率闻；
【具体实施方式】
[0025]实施例1:
[0026]五月份正值皱纹盘鮑生殖期，与黄岛胶南崂东海珍养殖场取得3-4龄人工养殖的底播皱纹盘鮑，选择壳高12-15cm，性腺饱满、肿胀，呈现淡黄色的雄性亲鲍进行暂养；暂养温度18-19°C，暂养密度每立方米水体20个，投喂海带和/或裙带菜，平均每只雄鲍10-15g/天，每天换水一次。并且暂养3-7天，至雄鲍摄食、运动正常，性腺乳白色、淡黄色并且饱满。将雄性亲鲍从暂养池中捞出，腹面朝上放于30CmX20Cm的塑料镂空篮中，将用浸润并拧至半干的毛巾附于雄性亲鲍上面，固定至不能随便晃动。而后放置于避光安静的区域，阴干刺激1.5小时。
[0027]并将事先准备好的经15W的紫外灯下照射2.5h的50L新鲜海水，同时升温2°C，SP水温由18-19°C升为20-21 °C的海水中。
[0028]然后将阴干1.5h的雄性亲鲍置于紫外线照射并升温的海水中，于安静、黑暗环境下诱导0.5小时，雄性鲍鱼陆续排精。
[0029]收集排放的海水里面的精液以3000r/min离心10分钟，收集底部浑浊精液。收集到的精液经过计算机辅助分析(CASAS)密度为2.6 X 107，运动率99%%%，平均曲线运动速度高于97.4.0 μ m/s,且精子曲线运动速度均高于50 μ m/s, 32%的精子曲线运动速度高于100 μ m/s0将诱导排出的雄性亲鲍的精子与诱导雌性亲鲍的卵子按精卵80-100: I的个数比混合，混合于20°C新鲜过滤海水，海水的量约是上述卵子体积的10-15倍。2h后随机每次取100多个卵子，取三次，统计受精率，14h统计孵化率，随机取幼虫每次100多个，取三次。其中受精率指开始分裂的卵子的数量占总共卵子的数量的百分数；孵化率指孵化至担轮幼虫的胚胎数量占总受精卵的百分数。上述收集到的鲍鱼精子受精率达到98.5%, 97.8%,97.0%,平均 97.8% ;孵化率 95.4%, 90.5%, 94.0%,平均为 93.2%。
[0030]实施例2:
[0031]六月份在胶南水产养殖场取得壳高9-12cm，性腺饱满、肿胀，呈现淡黄色的雄性亲鲍，从养殖池中捞出15只雄鲍，腹面朝上放于50cmX20cm的白色塑料泡沫盒中，将用紫外海水浸润拧至半干的毛巾附于雄性亲鲍上面，使之不能随便晃动。放置于避光安静的区域，阴干刺激1.5小时，取功率为15W紫外灯照射3h的50L新鲜海水，将阴干刺激1.5h的雄性亲鲍置于紫外线照射过并升温2°C，即20-21°C的海水中，放于安静、黑暗环境刺激0.5小时，观察到亲鲍陆续排精。收集精液以3000r/min离心10分钟，收集底部浑浊精液。收集到的精液经过计算机辅助分析(CASAS)，密度为5.6 X 106，运动率100%%%，平均曲线运动速度高于98.7 μ m/s,且精子曲线运动速度均高于50 μ m/s, 43%%的精子曲线运动速度高于100 μ m/s。将诱导排出的雄性亲鲍的精子与诱导雌性亲鲍的卵子按精卵个数80-100: I的比例混合(精子:卵子)，混合后加入至20°C新鲜过滤海水，海水的量约是卵子的量的10-15倍。2h后随机每次取100多个卵子，取三次，统计受精率，14h统计孵化率，随机取幼虫每次100多个，取三次。其中受精率指开始分裂的卵子的数量占总共卵子的数量的百分数；孵化率指孵化至担轮幼虫的胚胎数量占总受精卵的百分数。上述收集到的鲍鱼精子受精率达到97.4%, 96.4%, 95.1%,平均 96`.3% ;孵化率 92.4%, 90.3%, 92.7%,平均为 91.8%。
【权利要求】
1.一种皱纹盘鮑精优质精子诱导和采集方法，其特征在于: a.优质亲鲍的选择，选择自然海区人工养殖的性腺饱满并呈乳白、淡黄色雄性亲鲍或将由自然海区人工养殖的雄性亲鲍经暂养性腺饱满并呈乳白、淡黄色雄性亲鲍； b.亲鲍阴干刺激，将雄性亲鲍从暂养池中捞出，腹面朝上避光阴干刺激1.5-2小时； c.将上述阴干刺激后的雄性亲鲍置于经紫外线照射过并升温至20-21°C的海水中，于黑暗环境下刺激0.5-1小时，直至排精； d.将上述收集的精子离心收集浑浊液，即得皱纹盘鲍精子。
2.按权利要求1所述的皱纹盘鮑精优质精子诱导和采集方法，其特征在于:所述步骤a)是于5-6月份，选择自然海区人工养殖的翻转观察性腺饱满、肿胀，呈现乳白、淡黄色的3-4龄雄性亲鲍； 或选择自然海区人工养殖的3-4龄，选择壳高12-15cm的雄性亲鲍于18_19°C下，以每立方米水体20-25个的暂养密度进行暂养，暂养至性腺饱满、肿胀，呈现乳白、淡黄色的3-4龄雄性亲鲍。
3.按权利要求1或2所述的皱纹盘鮑精优质精子诱导和采集方法，其特征在于:所述暂养时每天换水，并投喂海带和/裙带菜，平均每只雄鲍10-15g/天。
4.按权利要求1所述的皱纹盘鮑精优质精子诱导和采集方法，其特征在于:所述步骤b)将雄性亲鲍从暂养池中捞出，腹面朝上放置，浸润拧至半干的毛巾，固定、避光阴干刺激`1.5-2小时。
5.按权利要求4所述的皱纹盘鮑精优质精子诱导和采集方法，其特征在于:所述 将新鲜海水在15W的紫外灯下照射至海水升温至20-21°C，而后将阴干1.5-2h的雄性亲鲍置于其中。
6.按权利要求1所述的皱纹盘鮑精优质精子诱导和采集方法，其特征在于:所述步骤d将收集精子以3000-3500r/min的离心速度处理8_10分钟，弃上清，收集底部浑浊精子，保存于0-4°C。
7.按权利要求1所述的皱纹盘鮑精优质精子诱导和采集方法，其特征在于:所述皱纹盘鲍精液与诱导雌性亲鲍的卵子的个数比为80-100: 1，混合后置于20°C的新鲜过滤海水中混合均匀，2h后取受精卵，检测受精率；其中新鲜过滤海水的量为卵子的体积量的10-15倍。
【文档编号】A01K61/00GK103548730SQ201310517084
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】刘清华, 李军, 韩龙江, 肖志忠, 孔宁 申请人:中国科学院海洋研究所