常绿萱草的组织培养法
【专利摘要】本发明公开了一种常绿萱草的组织培养法，包括以下步骤：1）取常绿萱草植株茎段流水冲洗；2）茎段经消毒后，剥取茎尖接种到诱导无菌苗培养基上进行培养；3）待步骤2）所得的无菌苗长至1.0～2.0cm高时，进行割取，得小苗Ⅰ；将小苗Ⅰ接种到诱导不定芽培养基上进行培养；4）待上述小苗Ⅰ上诱导出的不定芽长到1.0～3.0cm高时，以2～5株为一丛进行割取，得丛生小苗；将上述丛生小苗接种到增殖培养基上进行培养；5）待上述丛生小苗长出的不定芽长到3.0～6.0cm时，进行割取，得小苗Ⅲ；将此小苗Ⅲ接种到生根培养基中培养；6）待上述小苗Ⅲ长出大于2cm的至少5条根时，得可出瓶种植的种苗。
【专利说明】常绿萱草的组织培养法
【技术领域】
[0001]本发明涉及常绿萱草的组织培养法。
【背景技术】
[0002]常绿萱草具有四季常绿、花期长、抗病性强、耐寒、耐半阴等特点，是一种广受欢迎的绿化园林栽培植物。此外，常绿萱草的根可以入药，具利尿、凉血功效，用于治疗水肿、小便不利、淋浊、带下、黄疸、便血、崩漏等症。从常绿萱草分离出来的蒽醌类、二氢呋喃-Y -内酰胺类等化合物具有抗菌、抗癌、杀虫等活性。据生产调查，常绿萱草在自然条件下生长很少能够结籽繁殖，一般采用“分株法”进行繁殖，年繁殖系数一般为4~5倍左右，严重阻碍了常绿萱草的大规模应用。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种常绿萱草的组织培养法，采用该方法能获得大量的常绿萱草组培种苗。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明提供一种常绿萱草的组织培养法，依次包括以下步骤:
[0005]I)、取生长健壮且无病虫害的常绿萱草植株，剥去外面I~2层老叶，取茎尖部位I~2cm长的茎段，放入纱袋中进行流水冲洗；
[0006]2)、将步骤I)所得的流水冲洗后的茎段经消毒(为常规消毒)后，剥取长度为3~5毫米的茎尖，接种到诱导无菌苗培养基上进行培养，得无菌苗；培养条件为:16小时光照，光照强度30~40μOL M-2.S-1，温度为27土 1°C ;8小时暗培养，温度为21 土 1°C ;上述光照和暗培养交替进行；
[0007]3)、待步骤2)所得的无菌苗长至1.0~2.0cm高时，进行割取，得小苗I (为单株小苗)；将所述小苗I接种到诱导不定芽培养基上进行培养，从而使小苗I上诱导出不定芽；培养条件为:16小时光照，光照强度30~40μπιΟ1 m_2 ?s—1，温度为27±1°C;8小时暗培养，温度为21±1°C ;上述光照和暗培养交替进行；
[0008]4)、待上述小苗I上诱导出的不定芽长到1.0~3.0cm高时，以2~5株为一丛进行割取，得丛生小苗；将上述丛生小苗接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为:16小时光照，光照强度30~40μ mol π2.s—1，温度为26~28°C;8小时暗培养，温度为20~22°C;上述光照和暗培养交替进行；
[0009]5)、待上述丛生小苗长出的不定芽长到3.0~6.0cm时，进行割取，得小苗III (为单株小苗)；将此小苗III接种到生根培养基中培养；培养条件为:16小时光照，光照强度40~50 μ mo I π2.s—1，温度为26~28°C ；8小时暗培养，温度为20~22°C ;上述光照和暗培养交替进行；
[0010]6)、待上述小苗III长出大于2cm的至少5条根时，得可出瓶种植的种苗。
[0011]作为本发明的常绿萱草的组织培养法的改进:步骤I)为:将常绿萱草的茎段放入纱袋中，无菌水冲洗0.5~I小时。
[0012]作为本发明的常绿萱草的组织培养法的进一步改进:
[0013]步骤2)中的诱导无菌苗培养基为:1/4MS基本培养基+白砂糖20~30g/L+琼脂4 ~9g/L, pH 为 5.5 ~6.0。
[0014]上述诱导无菌苗培养基的制作方法具体如下:以1/4MS基本培养基(即溶液中大量元素的含量为MS基本培养基的四分之一)为基础，分别加入白砂糖、琼脂均匀混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HCl调节pH为5.5~6.0 ;每IL的1/4MS基本培养基中加20~30g糖、4~9g琼脂。
[0015]步骤3)中的诱导不定芽培养基为:MS基本培养基+TDZ0.05~0.5mg/L+白砂糖20 ~30g/L+ 琼脂 4 ~9g/L, pH 为 5.5 ~6.0。[0016]上述诱导不定芽诱导培养基的制作方法具体如下:以MS基本培养基为基础，分别加入N-苯基-N' -1, 2，3-噻二唑-5脲(TDZ)、白砂糖、琼脂均匀混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HCl调节pH为5.5~6.0 ;每IL的MS基本培养基加入0.05~0.5mg的TDZ、20~30g白砂糖、4~9g琼脂。
[0017]步骤4)中的增殖培养基为:MS基本培养基+TDZ0.05~0.5mg/L+白砂糖20~30g/L+ 琼脂 4 ~9g/L，pH 为 5.5 ~6.0。
[0018]上述增殖培养基的制作方法具体如下:以MS基本培养基为基础，分别加入N-苯基-N' -1, 2，3-噻二唑-5脲(TDZ)、白砂糖、琼脂均匀混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HCl调节pH为5.5~6.0 ;每IL的MS基本培养基加入0.05~0.5mg的TDZ、20~30g白砂糖、4~9g琼脂。
[0019]步骤5)中的生根培养基为:1/2MS基本培养基+白砂糖15~20g/L+琼脂4~10g/L, pH 为 5.5 ~6.0。
[0020]上述生根培养基的制作方法具体如下:以1/2MS基本培养基(即溶液中大量元素的含量为MS基本培养基的一半)为基础，分别加入白砂糖、琼脂均匀混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HCl调节pH为5.5~6.0 ;每1L1/2MS基本培养基中加15~20g糖、4~IOg琼脂。
[0021]依照本发明的方法，只需60~90天即可获得试管苗；因此采用本发明的方法可以长期得到大量的试管苗。
[0022]在本发明中，步骤3)中的诱导不定芽培养基的配方同步骤4)中的增殖培养基的配方。
[0023]本发明的特点在于:
[0024]1、本发明使用了植物激素TDZ，使用效果优于使用激素6-BA ；
[0025]本发明采用“1/4MS基本培养基”作为无菌苗培养基，1/4MS基本培养基中无机盐浓度相对较低，植株长的较快，更有利于诱导无菌苗。
[0026]2)、本发明以2~5株为一丛进行割取，转接该丛生小苗进行继代，丛生小苗有看护作用，利于植株的增殖；单株转接容易损伤不利于植株的增殖。
[0027]3)、本发明对继代增殖次数进行了比较，发现继代周期为2-3次时增殖的倍数和苗的质量为最佳。
[0028]本发明的常绿萱草组织培养法，属于一种离体快速繁殖的组织培养方法。依照植物组织培养中细胞全能性的原理，可以在短时间内生产大量遗传背景相同、长势一致的优质种苗(种子)，而且依靠实验室可以实现周年的长期提供优质种苗。在本发明的方法中，将长势健壮且无病虫害的常绿萱草植株上取得的茎尖进行消毒；再通过合适的诱导培养基进行诱导不定芽以及增殖不定芽，可以获得大量的无菌苗。采用本发明的方法，一般仅需60~90天即可得到可出瓶种植的种苗；因此常绿萱草组培苗一周年内的繁殖系数理论上为81°倍以上。所以，本发明的常绿萱草的组织培养法，是一种不受季节等因素影响，高效、快速提供优质常绿萱草种苗的方法，可以加速良种推广速度，提高田间品种种植产量。
[0029]综上所述，本发明建立的常绿萱草组织培养体系将为良种(常绿萱草)工厂化育苗提供理论依据和技术支撑。 [0030]本发明所得的种苗可采用以下方法进行种植:待种苗高4~8cm、具有至少3条长于2cm的根时，进行炼苗驯化，在室温下(25°C左右)放置2~3d后开瓶，然后在自然光下放置2~3d后取出小苗，用温水(30°C左右)洗净根部琼脂，并晾干，移栽入营养土中，(泥炭:珍珠岩:蛭石=4:3:3的体积比)，于人工气候箱室培养，培养条件:温度20~25°C，湿度85%~90%,光照强度15~25 μ mol m 2 *s 1 ;3~5周后光照强度30~40 μ mol m 2 *s 1 ；2个月后，存活率达到95%以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为实施例1中激素浓度是TDZ0.05mg/L时所诱导出来的常绿萱草芽；
[0032]图2为激素浓度是TDZ0.lmg/L时所诱导出来的常绿萱草芽；
[0033]图3为激素为6-BA时所诱导出来的常绿萱草芽；
[0034]图4为实施例1所得的常绿萱草的生根苗(即，可出瓶种植的种苗)；
【具体实施方式】
[0035]实施例1、一种常绿萱草的组织培养法，依次进行以下步骤:
[0036]I)、取生长健壮且无病虫害的常绿萱草植株，剥去外面I~2层老叶，取茎尖部位I~2cm长的茎段，放入纱袋中无菌水流水冲洗0.5~I小时。
[0037]2)、将上述流水冲洗后的茎段经常规消毒后(即0.l%w/v HgCl2处理6~10分钟后，无菌水冲洗5~8遍，然后用无菌滤纸吸干)，剥取长度为3~5毫米的茎尖，接种到诱导无菌苗培养基上进行培养；培养条件为:16小时光照，光照强度30~40 μ mo I π2.s_1,温度为27±1°C ；8小时暗培养，温度为21±1°C ;上述光照和暗培养交替进行；
[0038]诱导无菌苗培养基为:1/4MS基本培养基+白砂糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.8。
[0039]3)、待上述无菌苗长至1.0~2.0cm高时(约25天)，割取单株小苗，得小苗I ;将上述小苗I接种到诱导不定芽培养基上进行培养，从而使小苗I上诱导出不定芽；培养条件为:16小时光照，光照强度30~40μπιΟ1 π2.s—1，温度为27土1°C ；8小时暗培养，温度为21±1°C ;上述光照和暗培养交替进行；
[0040]诱导不定芽诱导培养基为:MS基本培养基+TDZ0.05mg/L+白砂糖30g/L+琼脂8g/L，pH 为 5.8。
[0041]4)、待上述小苗I上诱导出的不定芽长到2.0cm高时，以2~5株为一丛进行割取，得丛生小苗；将上述丛生小苗接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为:16小时光照，光照强度30~40 μ mo lm2.s—1，温度为26~28°C ；8小时暗培养，温度为20~22°C ；上述光照和暗培养交替进行；
[0042]增殖培养基为:MS基本培养基+TDZ0.05mg/L+白砂糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.8。
[0043]5)、待上述丛生小苗长出的不定芽长到4.0cm时，单株割取，得小苗III ;将此小苗III接种到生根培养基中培养；培养条件为:16小时光照，光照强度50μmol m_2 s—1，温度为26~28°C ；8小时暗培养，温度为20~22°C ;上述光照和暗培养交替进行；
[0044]生根培养基为:1/2MS基本培养基+白砂糖20g/L+琼脂8g/L，pH为5.8。
[0045]6)待上述小苗III长出大于2cm的至少5条根时，得可出瓶种植的种苗(如图4)。
[0046]依照上述方法，只需60天即可获得试管苗；因此采用本发明的方法可以长期得到大量的试管苗。
[0047]备注说明:图1为上述实施例1的激素浓度是TDZ0.05mg/L时所诱导出来的常绿萱草芽(丛生小苗长出的不定芽)。增殖倍数为10~12倍。
[0048]对比例1、
[0049]步骤1)同实施例1的步骤1)。
[0050]将实施例1的步骤2)中的诱导无菌苗培养基改为:1/2MS基本培养基+白砂糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.8。步骤2)中的培养条件同实施例1的步骤2)。
[0051]无菌苗长至1.0~2.0cm高，约需35天。所得到的无菌苗根比较细，无菌苗长势也比较弱。即，该例得到的无菌苗没有实施例1中长的快且好。
[0052]原因是:实施例1中的诱导无菌苗培养基选用的是1/4MS基本培养基，无机盐浓度低，有助于根源基的发育，从而有助于根从培养基中吸取营养，加快了无菌苗的生长。
[0053]对比例2、
[0054]步骤1)~2)同实施例1的步骤1)~2)。
[0055]将步骤3)中的诱导不定芽培养基改为:MS基本培养基+TDZ0.lmg/L+白砂糖30g/L+琼脂 8g/L，pH 为 5.8。
[0056]步骤4)中的增殖培养基改为:MS基本培养基+TDZ0.lmg/L+白砂糖30g/L+琼脂8g/L，pH 为 5.8。
[0057]步骤3)和步骤4)的培养条件对应的同实施例1的步骤3)和步骤4)。
[0058]图2为上述激素浓度是TDZ0.lmg/L时所诱导出来的常绿萱草芽(丛生小苗长出的不定芽)。增殖倍数为5~7倍。
[0059]对比例3、
[0060]步骤1)~2)同实施例1的步骤1)~2)。
[0061]仅仅将步骤3)的诱导不定芽培养基和步骤4)中的增殖培养基中的TDZ用6-BA进行替代(浓度不变)；
[0062]步骤3)和步骤4)的培养条件对应的同实施例1的步骤3)和步骤4)。
[0063]图3为激素为6-BA时所诱导出来的常绿萱草芽(丛生小苗长出的不定芽)。增殖倍数(仅为2~3倍)及苗的长势均不如实施例1。
[0064]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.常绿萱草的组织培养法，其特征是依次包括以下步骤: . 1)、取生长健壮且无病虫害的常绿萱草植株，剥去外面I~2层老叶，取茎尖部位I~.2cm长的茎段，放入纱袋中进行流水冲洗； . 2)、将步骤I)所得的流水冲洗后的茎段经消毒后，剥取长度为3~5毫米的茎尖，接种到诱导无菌苗培养基上进行培养，得无菌苗；培养条件为:16小时光照，光照强度30~.40 μ mo I m_2.s'温度为27±1°C ；8小时暗培养，温度为21±1°C ;上述光照和暗培养交替进行； .3)、待步骤2)所得的无菌苗长至1.0~2.0cm高时，进行割取，得小苗I ;将所述小苗I接种到诱导不定芽培养基上进行培养，从而使小苗I上诱导出不定芽；培养条件为:16小时光照，光照强度30~40 μ mo I um~2.s—1，温度为27± 1°C ；8小时暗培养，温度为21 ± 1°C;上述光照和暗培养交替进行； . 4)、待上述小苗I上诱导出的不定芽长到1.0~3.0cm高时，以2~5株为一丛进行割取，得丛生小苗；将上述丛生小苗接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为:16小时光照，光照强度30~40 μ mo I um~2.s—1，温度为26~28°C ；8小时暗培养，温度为20~22°C ；上述光照和暗培养交替进行； .5)、待上述丛生小苗长出的不定芽长到3.0~6.0cm时，进行割取，得小苗III ;将此小苗III接种到生根培养基中培养；培养条件为:16小时光照,光照强度40~50 μ mo I um~2.s_1,温度为26~28°C ；8小时暗培养，温度为20~22°C ;上述光照和暗培养交替进行； . 6)、待上述小苗III长出 大于2cm的至少5条根时，得可出瓶种植的种苗。
2.根据权利要求1所述的常绿萱草的组织培养法，其特征是:所述步骤I)为:将常绿萱草的茎段放入纱袋中，无菌水冲洗0.5~I小时。
3.根据权利要求1或2所述的常绿萱草的组织培养法，其特征是:步骤2)中的诱导无菌苗培养基为:1/4MS基本培养基+白砂糖20~30g/L+琼脂4~9g/L，pH为5.5~6.0。
4.根据权利要求3所述的常绿萱草的组织培养法，其特征是:步骤3)中的诱导不定芽培养基为=MS基本培养基+TDZ0.05~0.5mg/L+白砂糖20~30g/L+琼脂4~9g/L，pH为.5.5 ~6.0。
5.根据权利要求4所述的常绿萱草的组织培养法，其特征是:步骤4)中的增殖培养基为:MS基本培养基+TDZ0.05~0.5mg/L+白砂糖20~30g/L+琼脂4~9g/L，pH为5.5~.6.0。
6.根据权利要求5所述的常绿萱草的组织培养法，其特征是:步骤5)中的生根培养基为:1/2MS基本培养基+白砂糖15~20g/L+琼脂4~10g/L，pH为5.5~6.0。
7.根据权利要求6所述的常绿萱草的组织培养法，其特征是: 诱导不定芽培养基为:MS基本培养基+TDZ0.05mg/L+白砂糖30g/L+琼脂8g/L，pH为.5.8 ； 增殖培养基为:MS基本培养基+TDZ0.05mg/L+白砂糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.8。
【文档编号】A01H4/00GK103609444SQ201310576929
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月17日 优先权日:2013年11月17日
【发明者】毛碧增, 刘辉辉 申请人:浙江大学