利用交配型对蛹虫草菌株复壮和提高子实体产量的方法
【专利摘要】本发明对蛹虫草分生孢子进行单孢分离，获得两种不同交配型单孢株，并按特定比例接种到柞蚕蛹或者米饭培养基获得高产子实体。同时传代多次的菌株按照mat-alpha与mat-HMG特定比例的量接种到柞蚕蛹上或者米饭培养基上，相对传代多次的混合菌株具有较高子实体产量。
【专利说明】利用交配型对蛹虫草菌株复壮和提高子实体产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用分子生物学方法区分蛹虫草交配型，利用新的接种方法对蛹虫草菌株进行复壮和提高子实体产量的方法。
【背景技术】
[0002]真菌的交配型是控制其交配亲和性和有性生殖的遗传基础。据目前所知真菌交配系统包括同宗配合和异宗配合两种。由同一孢子萌发的菌丝间能通过自体结合而产生有性孢子，这一自交可育的生殖方式称为同宗结合，同宗结合还包括初级同宗结合和次级异宗接合两种。必须由不同性别的菌丝接合产生的双核菌丝才具有结实性，可产生有性孢子，这种自交不育的有性生殖方式称为异宗结合，异宗接合还包括两极性和四极性异宗接合。对真菌交配型的研究及减缓菌株退化，改良菌种具有重要作用。
[0003]蛹虫草(Cordyceps militaris)具有极高的药用价值,是一种异宗配合的子囊菌，异核体所产生的有性后代中具有两种可亲和的交配型，即mat-alpha和mat-HMG两种交配型。研究表明，当菌株只含有其中一类交配型不能够完成有性生活史，只有当同时含有这两种交配型时才能完成有型生活史，具备形成具有子囊壳的子实体。因此，研究蛹虫草菌株在生长过程中所需的两种交配型的最优比例，对提高蛹虫草子实体产量、退化菌株的复壮和减缓菌株菌株退化具有重要 意义。
[0004]近年来，对蛹虫草交配型的报道和研究日益增多，但是有关蛹虫草两种交配型比例与菌株生长状况之间关系的研究报道很少。继2005年Yokoyama等成功获得蛹虫草的mat-alpha和mat-HMG两种交配型基因的全长序列后(序列号分别是AB194982和AB084257)，zhang等2013年利用子囊孢子弹射获得蛹虫草单孢株后，PCR检测单孢株的交配型，将不同交配型单孢菌株混合培养得到的子实体产量是单一交配型(mat-alpha或mat-HMG)菌株的5倍。但是Zhang等利用子囊孢子弹射获得单孢株的方法比较繁琐，且准确度较低，同时Zhang等并没有找到高产子实体的两种交配型菌株的最优比例。
[0005]本发明通过对蛹虫草分生孢子单孢分离获得单孢菌株，PCR检测单孢株的交配型得到mat-alpha和mat-HMG两种交配型菌株，按照mat-alpha与mat-HMG菌株特定比例的量接种于昨蚕蛹上获得高产的子实体，按照mat-alpha与mat-HMG菌株特定比例的量接种于米饭培养基上获得高产的子实体，传代多次的菌株单孢分离获得两种交配型单孢株后，按照mat-alpha与mat-HMG特定比例的量接种到昨蚕蛹上或者米饭培养基上,相对传代多次的混合菌株具有较高子实体产量。
[0006]本发明对蛹虫草分生孢子进行单孢分离，获得两种不同交配型单孢株，并按特定比例接种到柞蚕蛹或者米 饭培养基获得高产子实体，这种方法在国内外未见报道。同时传代多次的菌株按照mat-alpha与mat-HMG特定比例的量接种到昨蚕蛹上或者米饭培养基上，相对传代多次的混合菌株具有较高子实体产量，这一方法在国内外也未见有报道。
【发明内容】
[0007]本发明是提供了一种快速提高子实体产量的方法，同时克服了菌株传代多次导致子实体产量迅速降低的问题。本方法可以直接用于生产，是一种提高子实体产量快速而又简洁的方法。
[0008]本发明通过对蛹虫草分生孢子进行单孢分离获得单孢菌株，利用PCR检测获得mat-alpha和mat-HMG两种交配型单抱株。
[0009]本发明利用对获得mat-alpha和mat-HMG两种交配型单孢株分别接种到摇瓶内，200rpm/min培养5天后测摇瓶菌丝质量体积比，最后换算得到单位体积内两种交配型单孢株菌丝质量比。
[0010]本发明通过按照mat-alpha与mat-HMG菌株1:12的质量比接种于昨蚕蛹上获得高产的子实体。
[0011]本发明通过按照mat-alpha与mat-HMG菌株1:12的质量比接种于米饭培养基上获得高产的子实体。
[0012]本发明通过对传代多次的菌株按照mat-alpha与mat-HMG菌株1:12的质量比接种到柞蚕蛹或者米饭培养基上，相对传代多次的混合菌株具有较高子实体产量。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为孢子在20h刚萌发伸长，箭头所指为孢子。
[0014]图2为对不同 单孢菌株的交配型PCR产物的检测，上面为mat-alpha (180bp)、下面为 mat-HMG(2IObp)。
[0015]图3为蛹虫草菌株接种到柞蚕蛹，从左到右依次为mat-alpha与mat-HMG菌株I二 12的质量比接种、原始蛹虫草混合菌株接种、单交配型菌株接种。
[0016]图4为蛹虫草菌株接种到米饭培养基，接种菌株顺序同图2。
[0017]图5为传代多次的蛹虫草菌株接种到柞蚕蛹，从左到右依次为:对传代多次蛹虫草菌株单孢分离获得的mat-alpha与mat-HMG菌株按照1:12的质量比接种、传代多次的蛹虫草混合菌株接种、传代多次蛹虫草菌株单孢分离后获得的单交配型菌株接种。
[0018]图6为传代多次的蛹虫草菌株接种到米饭培养基，接种菌株顺序同图4。
[0019]图7为按不同mat-alpha与mat-HMG菌丝质量比例接种到柞蚕蛹体后生物转化率(横坐标为mat-alpha与mat-HMG比例,纵坐标为生物转化率)。
【具体实施方式】
[0020]1、蛹虫草单孢株的获得
[0021]a、将蛹虫草原始菌株和传代多次的蛹虫草菌株接种到PPDA培养基上，25°C培养15天，取少量分生孢子于已加入无菌吐温80溶液三角瓶中，剧烈涡旋后过滤，用血球计数板计数孢悬液浓度，梯度稀释成200个孢子/mL的孢悬液。
[0022]b、将直径为5mm的无菌玻璃纸圆片放置于90mm PPDA培养基平板上，用微量移液器取5 μ L孢子悬浮液滴加在5_的圆形玻璃纸中央。
[0023]c、25°C恒温箱培养20h至孢子刚萌发伸长，利用倒置显微镜依次查看圆片上孢子萌发情况，将只带有一个孢子且已萌发出芽管的圆片转接至新的PPDA培养基平板中央，每个平板接I个孢子，25°C恒温箱继续培养至单菌落，即为单孢株。[0024]2、单孢株交配型的PCR检测及两种交配型的液体培养
[0025]a、利用氯化苄方法提取蛹虫草单孢株基因组，PCR检测其交配型，PCR引物参照 2009 年张等专利:mat-alpha (ΜΑΤ-1F CGCATTCAGAAGTGAGTGCA MAT-1RATATACCTTCGCGATCATTG)、mat-HMG (MAT-2F CGACATACGCTTGTCAAGAAAAGC MAT-2RGGGATGCCGTTCGAGGAGAG)。分别取mat-alpha和mat-HMG单孢株接种到摇瓶中，避光25°C、200rpm/min,培养 5d。
[0026]b、利用打散器打散菌液，分别检测两种摇瓶菌丝质量体积比，最后换算得到单位体积内两种交配型单孢株菌丝质量比。
[0027]3、柞蚕蛹活体接种及子实体的培养
[0028]a、按照mat-alpha与mat-HMG菌丝质量比为1: 12将两种菌液混合均匀,用无菌注射器吸取混合菌液注射到柞蚕蛹体内，每个柞蚕蛹注射400uL。
[0029]b、将注射好的柞蚕蛹放到无菌罐头瓶内，每瓶放2个。避光16°C培养15d，然后换做16°C避光7h、22°C光照17h培养5d，最后22°C光照培养45d。
[0030]4、米饭培养基接种及子实体的培养
[0031]a、按照mat-alpha与mat-HMG菌丝质量比为1: 12将两种菌液混合均匀，用移液器吸取混合菌液均匀喷洒到米饭培养基表面，每瓶米饭培养基喷洒5ml。
[0032]b、将接种好的米饭培养基罐头瓶，避光16°C培养15d，然后换做16°C避光7h、22°C光照17h培养5d，最后22°C光照培养40d。
[0033]5、按不同mat-alpha与mat-HMG菌丝质量比例接种到昨蚕蛹体后生物转化率计算
[0034]a、将按不同比例接种获得的子实体及柞蚕蛹分别放到60°C、24h烘干。
[0035]b、参照2012年Shrestha B等方法分别计算出不同接种比例的生物转化率(BE),公式为:生物转化率(BE)=子实体重量/(子实体干重量+蚕蛹干重量)X 100%。
[0036]通过分析不同接种比例获得生物转化率可以看出，mat-alpha与mat-HMG菌丝接种质量比为1:12时，生物转化率值远高于原始菌株和其它接种比例菌株。
[0037]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
【权利要求】
1.利用交配型对蛹虫草菌株复壮和提高子实体产量的方法，其特征在于将蛹虫草菌株按照mat-alpha与mat-HMG菌株1:12的质量比接种于昨蚕蛹上。
2.利用交配型对蛹虫草菌株复壮和提高子实体产量的方法，其特征在于将蛹虫草菌株按照mat-alpha与mat-HMG菌株1:12的质量比接种于米饭培养基。
3.利用交配型对蛹虫草菌株复壮和提高子实体产量的方法，其特征在于通过对传代多次的菌株按照mat-alpha与mat-HMG菌株1:12的质量比接种到昨蚕蛹或者米饭培养基上，相对传代多次的混合菌株具有较高子实体产量。
4.根据权利要求1或2所述的培养方法,其特征在于所述的mat-alpha与mat-HMG菌株通过如下方法得到: a、将蛹虫草原始菌株或传代多次的蛹虫草菌株接种到PPDA培养基上，25°C培养15天，取少量分生孢子于已加入无菌吐温80溶液三角瓶中，剧烈涡旋后过滤，用血球计数板计数孢悬液浓度，梯度稀释成200个孢子/mL的孢悬液； b、将直径为5mm的无菌玻璃纸圆片放置于90mmPPDA培养基平板上，用微量移液器取5 μ L孢子悬浮、液滴加在5mm的圆形玻璃纸中央； c、25°C恒温箱培养20h至孢子刚萌发伸长，利用倒置显微镜依次查看圆片上孢子萌发情况，将只带有一个孢子且已萌发出芽管的圆片转接至新的PPDA培养基平板中央，每个平板接I个孢子，25°C恒温箱继续培养至单菌落，即为单孢株； d、利用氯化苄方法提取蛹虫草单孢株基因组，PCR检测其交配型；分别取mat-alpha和mat-HMG单孢株接种到摇瓶中，避光25°C、200rpm/min,培养5d ； e、利用打散器打散菌液 ， 分别检测两种摇瓶菌丝质量体积比，最后换算得到单位体积内两种交配型单孢株菌丝质量比。
【文档编号】A01G1/04GK103609331SQ201310578734
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】黄勃, 王玉龙, 陈安徽 申请人:安徽农业大学