混菌发酵法制海参养殖水体修复剂及其制法和用途
【专利摘要】混菌发酵法制海参养殖水体修复剂及其制法和用途，针对海参的生理习性和养殖特点，应用海洋微生物技术，由海参养殖环境中分离筛选的弯曲芽孢杆菌CGMCC?No.5115、枯草芽孢杆菌CGMCC?No.5116和蜡状芽孢杆菌CGMCC?No.5117所组成，以玉米粉和豆粕粉为主要培养原料，28-37℃发酵24-48h，再以沸石、硅藻土和稻壳作为吸附和悬浮复合载体，加工制得混菌发酵法制海参养殖水体修复剂。本产品对水体环境耐受性强，漂浮性、悬浮性以及沉浮可控性好，有利于海水养殖水体三维立体的净化效果，避免水体酸化和臭底，有效抑制病原微生物，预防海参病害的发生，提高海参养殖的产量和质量。
【专利说明】混菌发酵法制海参养殖水体修复剂及其制法和用途
【技术领域】
[0001]本发明于水产养殖及海洋微生物【技术领域】，具体涉及一种混菌发酵法制海参养殖水体修复剂及其制法和用途。
【背景技术】
[0002]海水是海参等海珍品赖以生存的基本环境条件，俗话说:“三分养鱼，七分养水”。水质的好坏直接影响到海参的生长状况和养殖户的经济效益。随着经济和科学的发展，人们对海参的需求日益增加，在天然捕捞不能满足市场需求的情况下，海参养殖业已由传统的粗放型经营、资源依赖型养殖方式转化为现在的集约化和工厂化的养殖方式，刺参养殖已成为中国水产养殖业的支柱产业之一。然而，随着刺参集约化和规模化养殖迅速的发展，出现了一些严重问题，制约了其产业的发展，比如残存饵料以及排泄物和动物死体在水体中沉积，分解生成很多的有害物质，恶化了水质，病原菌大量繁殖，致使海参产生强烈的应激反应，出现了摇头不食、口肿、身体收缩僵直、排脏、体表溃疡等现象，最后体壁大面积腐烂而死。为了对抗海参病疫，长期和大量滥用抗生素以及化学合成药物，不仅导致了海参对病原微生物的易感性以及细菌病原微生物等的耐药性，还会使抗生素检测超标，并造成整个生态环境的污染，严重影响了节约减排、食品安全和阻碍了无公害刺参养殖业的可持续发展。
[0003]沸石是天然沸石族矿物的总称，是一种含水的碱金属或碱土金属的铝硅酸矿物。沸石具有比表面积大(440~1030m2/g)，孔径均匀，加上特殊的分子结构而形成较大静电引力，使沸石具有相当大的引力场，当沸石内部的孔穴和孔道一旦有“空缺”时，沸石就会表现出很强的吸附能力，对海水养殖水体中S02、NH3, H2S等有害极性气体分子具有很强的亲合力，并可以高效物理吸附养殖海水中的氨氮和亚硝酸盐等有害物质。沸石的空间结构基本单元是由4个氧原子和I个硅或铝原子堆砌成硅(铝)氧四面体。在此四面体，氧原子中有的价键未得到中和，使整个铝氧四面体带有负电，为保护电中和，缺少的正电荷由附近带正电的阳离子来补偿平衡，这 些平衡阳离子和水分子极易与周围水溶液里的阳离子发生交换，交换后的沸石结构不被破坏，沸石的离子交换特性，利于吸附净化水中Hg2+、Pb2+、Cr6+、Cd2+Xu2+等重金属离子等有害物质和吸附置换水体中H+，增加0H—，避免水体酸化和臭底，保证海水养殖过程中的水体环境质量。
[0004]硅藻土是一种生物成因的硅质沉积岩，主要由硅藻遗体组成，中的硅藻有许多不同的形状，如圆盘状、针状、筒状、羽状等，其化学成份主要是SiO2，由于具有空隙率高、t匕表面大、比重小、耐磨、耐酸、吸附性强、热导性低、隔热阻燃、保温隔音等优良特性，被广泛地应用于饮食、建材、化工、能源、水处理等行业中。硅藻土具有比表面积大的特性，比表面积越大吸附量越大；孔径越大，吸附量在孔内的扩散速率越大，则越有利于达到吸附平衡。而且硅藻土的表面及孔内表面分布有大量的硅羟基，这些硅羟基在水溶液中离解出H+，从而使颗粒表现出一定的表面负电性，使得其在水处理过程中，不但能去除颗粒态和胶体态的污染物质，还能有效地降低水体浊度和去除水体富营养化的主要污染物磷与氨氮，以及Hg2+、Pb2+、Cr6+、Cd2+、Cu2+等重金属离子等有害物质。
[0005]稻壳是稻谷外面的一层壳，由内颖及较大的外颖组成。稻壳长5_10mm、2.5_5mm、厚23-30微米，其色泽一般呈金黄色，被粉碎后，堆积密度可达384-400kg/m3，作为本产品的辅料，可以增加产品的漂浮性、悬浮性以及沉浮可控性，有利于海水养殖水体三维立体的净化效果。
[0006]水产微生态制剂，是利用水产动物体内或养殖水体中的有益微生物经特殊加工工艺而形成的活菌制剂，具有氨氧化、硝化、反硝化、解磷、除硫和脱氮等作用，有效地降低水中的C0D、氨氮、亚硝酸氮和硫化物的浓度，从而有效地改善水质。目前，应用于水产养殖的微生态水质调节剂，只限于单纯菌剂或载体化菌剂，前者使用中存在菌群存活繁殖适应性差和数量减少等劣势，后者基本是大部分是沉在池底，对中上层水体净化率低，切池底环境溶解氧低，不利于微生态菌剂的繁殖。所以，急需一种微生态制剂既能三维立体全方位能去除海参养殖水体中C0D、氨氮、亚硝酸氮和硫化物，又能除去水体中重金属离子，并抑制有害微生物的繁殖，达到同时一次完全净化养殖水体的水质修复剂。
【发明内容】
[0007]本发明为了要解决现有技术中养殖水质污染严重、病害频发、海参高死亡率、海参体内重金属、化学残留和抗生素残留超标等现状，提供了混菌发酵法制海参养殖水体修复剂及其制法和用途。混菌发酵法制海参养殖水体修复剂主要由芽孢杆菌混合组成，由海参养殖环境中分离并筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YB-l CGMCC N0.5116、蜡状芽抱杆菌(Bacillus cereus)YB-2 CGMCC N0.5117 和弯曲芽抱杆菌(Bacillus flexus)XH-1 CGMCC N0.5115，以玉米粉和豆柏粉为主要发酵培养基，以沸石、硅藻土和稻壳作为吸附和悬浮载体，加工成固体粉剂。本发明中涉及的微生态制剂，于2011年08月05号送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(中国科学院微生物研究所，邮编100101)，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0008]本发明的主要方面是:混菌发酵法制海参养殖水体修复剂的制法，包括以下操作步骤:`
[0009]①制备益生菌原液
[0010]将在LB琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC N0.5116、蜡状芽孢杆菌YB-2CGMCC N0.5117和弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC N0.5115，分别加入2116E培养基，pH7.0~7.5，33~37°C震荡培养12~16h，再以1:1:1的体积比混合，制备成益生菌原液；
[0011]②液态发酵培养
[0012]向在密闭式发酵反应器中加入发酵液，并按0.1~1%的体积比加入营养物质，再将步骤①制备的益生菌原液，按3-5%的体积比接种，进行发酵，压力为0.1~0.25Mpa，37°C发酵24h，制得发酵产物；
[0013]③喷雾干燥处理
[0014]上述步骤②所得的发酵产物喷雾到吸附载体，干燥处理；
[0015]其中，步骤①所说的海水LB琼脂培养基和2116E培养基，均为《分子克隆实验指南》中培养基配方；[0016]步骤②所说的营养物质由玉米粉:豆柏粉:海水按(1.5~3):(0.5-1.5):100的
重量比组成；
[0017]步骤③所述的吸附载体的组成为:沸石粉、硅藻土粉和稻壳2:2:1的体积比混合。
[0018]在优化条件下:上述的制备方法中，步骤①中菌悬液的菌体浓度均约为lX108cfu/ml。
[0019]在优化条件下:上述的制备方法中，步骤③所述的吸附载体中，沸石粉和硅藻土粉为150~200目；终产物吸附载体和益生菌混合物，载菌含量的终浓度约为IO8~IOltlCfu/g° [0020]在优化条件下:上述的制备方法中，向步骤③制得的产物中加入吸附载体的重量比为I:1~1000。
[0021]在优化条件下:上述的制备方法中，步骤③中发酵产物喷雾干燥到吸附载体的方法为:发酵培养液与载体重量比为1:1~4,干燥时间为12~24h,产物水份含量不高于5%。
[0022]本发明的另外一方面在于，利用上述的方法制备混菌发酵法制海参养殖水体修复剂产品。
[0023]本发明的另外一方面在于，利用上述的混菌发酵法制海参养殖水体修复剂在海参养殖方面的应用。
[0024]本发明的混菌发酵法制海参养殖水体修复剂环境耐受性强，漂浮性、悬浮性以及沉浮可控性好，对海参的养殖水体三维立体的净化效果显著，尤其在海参的育苗期和养成期定期泼洒该混菌发酵法制海参养殖水体修复剂，可以快速去除养殖水体中的重金属离子和降解氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质，避免水体酸化和臭底，有效抑制病原菌，减轻环境对海参的应激反应，有效预防海参病害的发生，提高海参养殖的质量和产量。
【具体实施方式】
[0025]以下结合技术方案详细叙述本发明的实施例。
[0026]实施例中所用原料均由常规方法制备或由商业途径获得。
[0027]LB琼脂斜面培养基:其组成每升中含:胰酶解蛋白胨5g，酵母膏lg，海水晶33g，磷酸高铁0.1g,琼脂15g, 1000mL /K，pH7.6。蛋白胨和酵母膏购于英国Oxoid公司，琼脂粉购于北京奥博星生物技术有限责任公司，其他原料均购于上海生工生物工程股份有限公司。
[0028]2216E液体培养基:其组成每升中含:胰酶解蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高铁
0.lg，陈海水lOOOmL，pH7.6。蛋白胨和酵母膏购于英国Oxoid公司，其他原料均购于上海生工生物工程股份有限公司。
[0029]玉米粉和豆柏粉，均为100-200目，购于山东万得福实业集团有限公司。
[0030]稻壳，购于大连赛姆集团。
[0031]沸石粉，购于浙江省宁波市宁海县嘉和化工有限公司，150-200目。
[0032]硅藻土粉，购于吉林省长白县青山源硅藻土有限公司，150-200目。
[0033]本发明实施例中涉及的微生态制剂包括:由海参养殖环境中分离筛选的芽孢杆菌包括:枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is) YB-1 CGMCC N0.5116、腊状芽抱杆菌(Bacilluscereus)YB-2 CGMCC N0.5117 和弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)XH-1 CGMCC N0.5115。[0034]三株菌株保藏于2011年08月05号送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，邮编100101)，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0035]下面通过实例进一步详细描述本发明。
[0036]实施例1:
[0037]1.制备益生菌原液
[0038]将在LB琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC N0.5116、蜡状芽孢杆菌YB-2CGMCC N0.5117和弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC N0.5115，分别加入2116E培养基，PH7.0~7.5，37°C震荡培养12~16h，再以1:1:1的体积比混合，制备成益生菌原液，菌体浓度约为lX108cfu/ml。
[0039]2.液态发酵培养
[0040]向在密闭式发酵反应器中加入发酵液，并按0.1~1%的体积比加入营养物质，再将步骤①制备的益生菌原液，按3-5%的体积比接种，进行发酵，压力为0.1~0.25Mpa，37°C发酵24h，制得发酵产物；
[0041]上述的营养物质由玉米粉 :豆柏粉:海水按(1.5~3):(0.5-1.5):100的重量比组成。
[0042]3.喷雾干燥处理
[0043]复合物吸附载体由150-200目的沸石粉、硅藻土粉和稻壳按体积比为1:1:1混合配制；
[0044]上述步骤2所得的发酵产物喷雾干燥到上述吸附载体中，发酵产物与载体重量比为1:4，干燥时间为24h，产物水份含量不高于5%，制得混菌发酵法制海参养殖水体修复剂。
[0045]实施例2
[0046]1.制备益生菌原液
[0047]将在LB琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC N0.5116、蜡状芽孢杆菌YB-2CGMCC N0.5117和弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC N0.5115，分别加入2116E培养基，PH7.0~7.5，37°C震荡培养12~16h，再以1:1:1的体积比混合，制备成益生菌原液，菌体浓度约为lX108cfu/ml。
[0048]2.液态发酵培养
[0049]向在密闭式发酵反应器中加入发酵液，并按0.1~1%的体积比加入营养物质，再将步骤①制备的益生菌原液，按3-5%的体积比接种，进行发酵，压力为0.1~0.25Mpa，37°C发酵24h，制得发酵产物；
[0050]上述的营养物质由玉米粉:豆柏粉:海水按(1.5~3):(0.5-1.5):100的重量比组成。
[0051]3.喷雾干燥处理
[0052]吸附载体由150-200目的沸石粉、硅藻土粉和稻壳按体积比为2:2:1混合配制；
[0053]上述步骤2所得的发酵产物喷雾干燥到上述吸附载体中，发酵产物与载体重量比为1:4，干燥时间为24h，产物水份含量不高于5%，制得混菌发酵法制海参养殖水体修复剂。
[0054]使用效果
[0055]选取3处条件相同的海参养殖圈，平均水深1.5-2m，参苗规格30_50头/500g，密度在9-10头/m2。
[0056]I号圈为对照组(未使用混菌发酵法制海参养殖水体修复剂),2、3号圈为实验组(使用混菌发酵法制海参养殖水体修复剂)；实验组除了定期泼洒实施例1、2所述的混菌发酵法制海参养殖水体修复剂之外，饲喂方式和管理方法与对照组一样。
[0057]实验周期为2013年9月到10月，大约45天，实验组每隔3天泼洒I次，泼洒量为5g/m3。
[0058]实验期间，定期检测水质，观察海参摄食情况，每隔15天下水摸探，测量海参体重。盐度为35-38%。，水温为16-23°C, pH为7.6-8.5，溶解氧不低于4mg/L。
[0059]1.使用本实施例1、2后第45天的海参养殖圈的水质指标比较结果
[0060]
【权利要求】
1.混菌发酵法制海参养殖水体修复剂的制备方法，包括以下操作步骤: ①制备益生菌原液 将在LB琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC N0.5116、蜡状芽孢杆菌YB-2 CGMCC N0.5117和弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC N0.5115，分别加入2116E培养基，PH7.0~7.5，33~37°C震荡培养12~16h，再以1:1:1的体积比混合，制备成益生菌原液； ②液态发酵培养 向在密闭式发酵反应器中加入发酵液，并按0.1~1%的体积比加入营养物质，再将步骤①制备的益生菌原液，按3-5%的体积比接种，进行发酵，压力为0.1~0.25Mpa，37°C发酵24h，制得发酵产物； ③喷雾干燥处理 上述步骤②所得的发酵产物喷雾到吸附和悬浮复合载体，干燥处理； 其中，步骤①所说的海水LB琼脂培养基和2116E培养基，均为《分子克隆实验指南》中培养基配方； 步骤②所说的营养物质由玉米粉:豆柏粉:海水按(1.5~3):(0.5-1.5):100的重量比组成； 步骤③所述的复合载体的组成为:沸石粉、硅藻土粉和稻壳按2:2:1的体积比混合。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤③所述的复合载体，沸石粉和硅藻土粉为150~200目。
3.根据权利要求2所述的制`备方法，其特征在于，步骤①中菌悬液的菌体浓度均为lX108cfu/ml。
4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的制备方法，其特征在于还包括:向步骤③制得的产物中加入复合载体，混合并使菌含量的终浓度为约为108-10lclcfu/g。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，向步骤③制得的产物中加入复合载体的重量比为1:1~1000。
6.根据权利要求1、2或5中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤③中发酵产物喷雾干燥到复合载体的方法为:发酵培养液与载体重量比为1:1~4，干燥时间为12~24h，产物水份含量不高于5%。
7.如权利要求1所述的方法制备的混菌发酵法制海参养殖水体修复剂。
8.如权利要求7所述的混菌发酵法制海参养殖水体修复剂在海参养殖方面的应用。
【文档编号】A01K61/00GK103739085SQ201310717946
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】徐永平, 尤建嵩, 李淑英, 李纪彬, 周俊龙, 徐牧, 马欣, 高玉平, 刘士茹 申请人:大连赛姆生物工程技术有限公司