一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂及其制备方法和应用。所述玫烟色棒束孢可湿性粉剂包括如下质量百分比的组分：玫烟色棒束孢分生孢子粉5%～20%、润湿剂3%～5%、分散剂3%～5%、紫外保护剂0.1%～0.5%，余量为载体。所述玫烟色棒束孢为玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02，于2013年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2013526。本发明所述玫烟色棒束孢可湿性粉剂主要用于防治十字花科蔬菜害虫，对小菜蛾等害虫有很好的防治效果。具有杀虫活性高、效果稳定、持效期长、环境影响小、使用方便的优点。
【专利说明】一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及无公害农药制剂领域。更具体地，涉及一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]昆虫病原真菌是杀虫微生物的重要组成部分，约占昆虫病原微生物种类的60%以上。微生物农药的大量开发利用可有效降低和消除目前化学农药普遍存在的残留、毒性和抗药性等诸多负面作用。玫烟色棒束孢(/saria /i/fflosoriosea)是一种重要的可致害虫死亡的昆虫病原真菌，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，寄主范围广，已记载的有25个不同科的昆虫，包括同翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、鞘翅目和膜翅目等多种蔬菜、果树及茶树害虫，特别是小菜蛾、麦双尾蚜和烟粉虱等一些重要农业害虫，是生物防治中极具开发应用潜力的种类。玫烟色棒束孢的致病力强，对人畜作物安全，对环境友好，不易产生抗药性，是研究和应用最广的一类微生物杀虫剂之一。
[0003]用真菌微生物农药防治植物病虫害是无公害农产品可持续生产中的重要手段之一，具有广阔的应用前景。然而真菌制剂化是其微生物农药应用的先决条件，自20世纪60年代以来，国外已有10种玫烟色棒束孢制剂产品被研究出来并获得注册登记，近几年间问世的商品制剂有分生孢子制剂Biocon (荷兰)、AgoBiocontrol Bassiana 50 (哥伦比亚)、Pae-sin (墨西哥)、Bemisin (委内瑞拉)，芽生孢子制剂PFR-97以及芽生孢子与菌丝体的混合制剂PreFeRal。虽然这些现有的玫烟色棒束孢制剂对害虫取得了较好的防治效果，但是，同其他生防真菌一样，这些制剂仍然存在杀虫速度较慢这一缺点，严重制约了其在田间的应用。
[0004]正因为玫烟色棒束孢的寄主范围广，流行性强，以及对人畜和环境安全等特点，长期以来被研究工作者作为防治害虫的主`要手段，但是该菌在使用过程中存在侵染速度慢、防治效果受环境条件影响大、附着力不好，防治效果很不稳定等缺点。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有玫烟色棒束孢农药制剂剂型存在的问题和不足，提供了一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂。
[0006]本发明另一目的是提供上述玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备方法。
[0007]本发明再一目的是提供上述玫烟色棒束孢可湿性粉剂的应用。
[0008]本发明上述目的通过以下技术方案予以实现:
本发明提供了一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂，包括如下质量百分比的组分:玫烟色棒束孢分生孢子粉5%~20%、润湿剂3%~5%、分散剂3%~5%、紫外保护剂0.1%~0.5%，余量为载体。
[0009]优选地，所述玫烟色棒束孢可湿性粉剂，包括如下质量百分比的组分:玫烟色棒束孢分生孢子粉8%~15%、润湿剂3.5%~4.5%、分散剂3.5%~4.5%、紫外保护剂0.2%~0.4%，余量为载体。
[0010]更优选地，所述玫烟色棒束孢可湿性粉剂，包括如下质量百分比的组分:玫烟色棒束孢分生孢子粉10%、润湿剂3%、分散剂3%、紫外保护剂0.1%，余量为载体。
[0011]本发明所述的玫烟色棒束孢为玫烟色棒束孢(J1Saria fumosorosea (Wize) Brown
&Smith)菌株SCAU-1FCF02，最初分离自家白蚁。该菌株于2013年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013526，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
[0012]优选地，本发明所述的玫烟色棒束孢分生孢子粉的孢子含量为124亿/g。
[0013]优选地，所述的润湿剂为辛烷基苯酚聚氧乙烯醚-10 (0P-10)或脂肪醇聚氧乙烯醚(AE0-9)；
所述的分散剂为亚甲基二萘磺酸钠(分散剂ΝΝ0)；
所述的紫外保护剂为抗坏血酸或荧光素钠；
所述的载体为滑石粉或硅藻土。
[0014]更优选地，所述的润湿剂为辛烷基苯酚聚氧乙烯醚-10 ；
所述的分散剂为亚甲基二萘磺酸钠(分散剂ΝΝ0)；
所述的紫外保护剂为抗坏血酸；
所述的载体为滑石粉。
[0015]本发明还提供了所述玫`烟色棒束孢可湿性粉剂在制备防治同翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、鞘翅目或膜翅目害虫药剂方面的应用。
[0016]优选地，所述害虫为十字花科蔬菜害虫。
[0017]更优选地，所述害虫为小菜蛾，红火蚁或烟粉虱。
[0018]本发明上述玫烟色棒束孢分生孢子粉的制备方法如下:
51.一级固体培养，将玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02涂布于SDAY固体培养基培养；
52.二级液体振荡培养，用含有0.03% Tween-80的无菌水洗下上述固体培养基上的孢子，过滤制成I X IO7个孢子/mL的悬浮液，将悬浮液接种于萨氏培养液振荡培养；
53.三级产孢培养。
[0019]更具体地，所述制备方法包括以下操作:
51.一级固体培养，将玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02涂布于SDAY固体培养基(SDAY培养基为最适培养基)，于24°C进行培养，最佳培养时间为15天；
52.二级液体振荡培养，用含有0.03% Tween-80的无菌水洗下上述固体培养基上的孢子，再用灭菌纱布过滤，制成I X IO7个孢子/mL的悬浮液，IOOuL的上述悬浮液接种于200mL的萨氏培养液(简称SDB，为最适接种液)，24°C、170r/min振荡培养72小时；
53.三级产孢培养，低值陈米(普通的大米，购于华南农业大学农贸市场)加等质量蒸馏水，121 °C湿热灭菌30min后冷却备用，将S2得到的含有大量菌丝的菌液接入经蒸汽灭菌的大米上，菌液与低值陈米充分混合后平铺于垫有纱布的托盘中，并用保鲜膜覆盖，24°C黑暗培养6天。待培养基表面长满菌丝时揭去保鲜膜继续培养4天，使菌丝大量产孢，收获孢子粉，真空冷冻干燥24小时，干燥后的孢子粉贮存于无菌容器中，4°C保存备用。获得的孢子粉孢子含量为124亿/g，活孢率为97.8%，含水量为2.56%，外观为淡玫烟色粉末。
[0020]其中，步骤SI所述SDAY固体培养基配制方法如下:
葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸膏20g/L、琼脂15~20g/L、H2O 1L，搅拌混匀，然后分装，灭菌，备用。
[0021 ] S2所述萨氏培养液配制方法如下:
葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸膏20g/L、H2OlL,搅拌混匀,然后分装,灭菌,备用。
[0022]在微生物活体农药开发研究中，其配套制剂的研究是微生物活体农药实际开发和推广应用的重要基础。助剂对农药制剂具有重要影响，其好坏直接影响到农药药效，尤其在真菌孢子制剂中对助剂具有更高的要求，除了要求优良的理化性能外，还必须不能影响真菌孢子的萌发，否则将严重影响制剂的生防效果及贮存稳定性。合适的助剂不仅可以延长真菌制剂产品货架期，也可以降低真菌制剂对外界环境的依赖，提高对靶标害虫的田间防效。因此，筛选与真菌具有优良生物学相容性的助剂对真菌制剂的研制相当重要。害虫亲脂性表皮和兑水使用的药剂之间存在着很高的界面张力，让药剂很难与害虫和植物表面亲和。不合理的制剂，不仅造成部分菌体死亡或孢子失活，而且会将大大降低其效果发挥，从而影响持效性。制备稳定、效果好的新剂型是真菌杀虫剂制备的关键。可湿性粉剂具有成本较低，市场竞争力强，应用范围广等优点，可湿性粉剂的研制是新型微生物农药产业化开发的不可或缺的环节。
[0023]本专利发明人分离得到的玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02，对小菜蛾具有非常低的致死浓度和最快的致死速度，克服了普通真菌微生物农药杀虫速度慢这一制约因素。因此，本发明以玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02的常见侵染体分生孢子为活性成分，制备成玫烟色棒束孢可湿性粉剂，能够为玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02的产业化奠定基础，为该菌株的田间应用提供理论指导，具有良好的应用前景。
[0024]本发明具有以下有益效果:
本发明制备方法获得了一种性能稳定的真菌微生物杀虫制剂，得到的玫烟色棒束孢可湿性粉剂产品性能指标优良:玫烟色棒束孢孢子萌发率> 90% ;润湿性〈lmin ;质量悬浮率为75.28% ;孢子的悬浮率为95.12%，水分含量为2.88% ;细度(过325目标准筛)≥98% ；pH值为6.20 ;所使用的助剂与玫烟色棒束孢具有很好的生物相容性，对玫烟色棒束孢分生孢子的萌发没有影响或影响极小。
[0025]本发明玫烟色棒束孢可湿性粉剂对同翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、鞘翅目或膜翅目害虫，尤其是十字花科蔬菜害虫具有非常好的防治效果，克服了微生物农药速效性差、效果不稳定以及阿维菌素的抗药性、农药残留严重等缺点，具有使用方便、速效、高活性、效果稳定、持效期长，且控制能力强、环境影响小、低毒、低残留等优点，符合当前生物农药研究的趋势，是一种理想的替代高残留农药的新型生物农药，对于我国开发无公害蔬菜，维护生态环境，实现可持续农业具有重要的意义，具有很好的推广应用价值。
【具体实施方式】
[0026]以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试剂、方法和设备。
[0027]以下实施例中涉及的玫烟色棒束孢具体为玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株。以下实施例中所使用的玫烟色棒束孢分生孢子粉为玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02的分生孢子粉，孢子含量124亿/克。
[0028]除特别说明以外，本发明实施例中所用百分比均为质量百分比(w/w)。[0029]实施例1玫烟色棒束孢分生孢子粉的制备
本发明实施例所用玫烟色棒束孢为玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02，该菌株于2013年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013526。
[0030]本发明所述玫烟色棒束孢分生孢子粉的制备步骤如下:
51.一级固体培养，取50uL玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02原始菌液涂布于SDAY固体培养基上(SDAY培养基为最适培养基)，于24°C进行培养，最佳培养时间为15天；
52.二级液体振荡培养，用含有0.03% Tween-80的无菌水洗下SDAY固体培养基上的孢子，再用纱布过滤，制成I X IO7个孢子/mL的孢子悬浮液，IOOuL的上述孢子悬浮液接种于200mL的萨氏培养液(简称SDB，为最适接种液)，24°C、170r/min振荡培养72小时；
53.三级产孢培养，低值陈米(普通的大米，购于华南农业大学农贸市场)加等质量蒸馏水，121 °C湿热灭菌30min后冷却备用，将S2得到的含有大量菌丝的菌液接入灭菌的大米上，菌液与低值陈米充分混合后平铺于垫有纱布的托盘中，并用保鲜膜覆盖，24°C黑暗培养6天。待培养基表面长满菌丝时揭去保鲜膜继续培养4天，使菌丝大量产孢，收获孢子粉，真空冷冻干燥24小时，干燥后的孢子粉贮存于无菌容器中，4°C保存备用。
[0031]获得的孢子粉孢子含量为124亿/g，活孢率为97.8%，含水量为2.56%，外观为淡玫烟色粉末。
[0032]步骤SI所述SDAY固体培养基配制方法如下:
葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸膏20g/L、琼脂15~20g/L、H2O 1L，搅拌混匀，然后分装，灭菌，备用。
`[0033]步骤S2所述萨氏培养液配制方法如下:
葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸膏20g/L、H2OlL,搅拌混匀,然后分装,灭菌,备用。
[0034]以下实施例2~7中孢子萌发率测定方法如下:将孢子悬浮液接种到真菌萌发液(葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、H20 1L)中，24°C，170 r/min，震荡培养18h后镜检统计活孢率。润湿时间按照GB/T5451-2001标准方法测定。悬浮率按GB/T 14825-2006标准方法测定。pH按GB/T1600-93标准方法测定。细度通过激光粒径分布仪测定。数据统计分析:所有实验数据用DPS数据处理系统进行分析，计算均值及标准误，均值差异显著性通过Duncan新复极差法进行多重分析比较。
[0035]实施例2玫烟色棒束孢可湿性粉剂的润湿剂优选实验 1、试验材料
(O实施例1制备的分生孢子粉。
[0036](2)本实施例不能将本发明涉及的润湿剂一一在此赘述，选择以下几种实验过程中总结出的比较典型的润湿剂进行说明=SDBS(十二烷基苯磺酸钠)、SDS(十二烷基硫酸钠)、0P-10 (辛烷基苯酹聚氧乙烯醚-10)、AE0-9 (脂肪醇聚氧乙烯醚)、渗透剂T (Penetratingagent T )和渗透剂JFC。
[0037]2、实验方法
(I)润湿力测定:将各润湿剂按1%、3%和5%的比例、玫烟色棒束孢分生孢子粉10%的比例加入滑石粉中，混合均匀，制成润湿剂含量不同但孢子含量相同的样品。润湿时间按照GB/T 5451-2001标准方法测定，即准确称取样品5 g，从与烧杯口齐平的位置一次均匀倒进盛有IOOmL水的250mL烧杯液面上，不扰动液面，同时立即用秒表记时，直至样品全部润湿为止，记下润湿时间，每个处理重复5次，以不加润湿剂的样品作为对照。
[0038](2)生物相容性测定:将上述各样品加入真菌萌发液(葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、H2O 1L)中，使其终浓度为1父106个孢子/11^，241:，170 r/min振荡培养18小时，取样用血球计数板计算孢子萌发率。每浓度重复5次，以不加润湿剂的样品作为对照。
[0039]3、结果
(I)润湿力比较:润湿剂的润湿力因种类和浓度的不同而异。方差分析表明，润湿力的的极显著差异存在于不同润湿剂之间(F=392.0070,P < 0.01)和同种润湿剂不同浓度之间(F=1609.9990，P < 0.01)。各润湿剂在不同浓度下的润湿时间如表1所示，除十二烷基苯磺酸钠(SDBS)和渗透剂T (Penetrating agent T)在1%浓度与对照无显著差异之外,其余润湿剂各浓度下润湿时间都显著低于对照。在1%浓度下，各润湿剂的润湿时间都大于200S，即使ΑΕ0-9也达286.6 S。在3%浓度下，不同润湿剂的润湿性能表现明显差异，0Ρ-10润湿时间仅为21.36 s，其次是AE0-9的31.8 S。当浓度达到5%，仍是0Ρ-10的润湿时间最短(8.2 s)，ΑΕ0-9 次之(14.6 S)。
[0040]表1不同润湿剂在不同浓度下玫烟色棒束孢孢子可湿性粉剂润湿时间比较
【权利要求】
1.一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂，其特征在于，包括如下质量百分比的组分:玫烟色棒束孢分生孢子粉5%~20%、润湿剂3%~5%、分散剂3%~5%、紫外保护剂0.1%~0.5%，余量为载体。
2.根据权利要求1所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂，其特征在于，包括如下质量百分比的组分:玫烟色棒束孢分生孢子粉8%~15%、润湿剂3.5%~4.5%、分散剂3.5%~4.5%、紫外保护剂0.2%~0.4%，余量为载体。
3.根据权利要求1所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂，其特征在于，包括如下质量百分比的组分:玫烟色棒束孢分生孢子粉10%、润湿剂3%、分散剂3%、紫外保护剂0.1%，余量为载体。
4.根据权利要求1、2或3所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂，其特征在于，所述的玫烟色棒束孢为玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02，于2013年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013526。
5.根据权利要求1所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂，其特征在于，所述玫烟色棒束孢分生孢子粉的孢子含量为124亿/g。
6.根据权利要求1所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂，其特征在于，所述的润湿剂为辛烷基苯酚聚氧乙烯醚-10或脂肪醇聚氧乙烯醚； 所述的分散剂为亚甲基二萘磺酸钠； 所述的紫外保护剂为抗坏血酸或荧光素钠； 所述的载体为滑石粉或硅藻土。
7.权利要求1、2、3、5或6任一所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂在制备防治同翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、鞘翅 目或膜翅目害虫药剂方面的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述害虫为十字花科蔬菜害虫，尤其是小菜蛾，红火蚁或烟粉虱。
9.权利要求1、2、3、5或6任一所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.一级固体培养，将玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02涂布于SDAY固体培养基培养； 52.二级液体振荡培养，用含有0.03% Tween-80的无菌水洗下上述固体培养基上的孢子，过滤制成I X IO7个孢子/mL的悬浮液，将悬浮液接种于萨氏培养液振荡培养； 53.三级产孢培养。
10.权利要求4所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂在制备防治同翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、鞘翅目或膜翅目害虫药剂方面的应用。
【文档编号】A01N63/04GK103749441SQ201310721138
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】何余容, 念晓歌, 吕利华, 谢梅琼, 张伟 申请人:华南农业大学