一个组成型表达启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物生物【技术领域】，具体涉及一个大豆组成型表达启动子SOY001P的功能鉴定和应用。本发明所公开的SOY001P启动子在植物的根、茎、叶和花等组织器官中都有很强的表达活性，在植物转基因领域具有很好的应用前景。
【专利说明】一个组成型表达启动子及其应用
【技术领域】[0001]本发明属于植物生物【技术领域】，具体涉及一个从大豆中分离的组成型表达启动子S0Y00IP的功能鉴定和应用。
【背景技术】
[0002]外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。根据启动子驱动基因表达的不同特点，启动子分为组成型启动子和特异性启动子；组成型启动子能在所有细胞或组织中，不分时间和空间地启动转录；特异性启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子。目前，农业生物【技术领域】广泛应用的主要是一些组成型的强启动子，高活性的组成型启动子在植物基因功能研究和遗传改良中具有很好的应用前景。
[0003]组成型启动子(constitutive promoter)之所以称之为组成型是因为这类启动子控制的基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织部位表达水平没有明显差异，其特点是表达持续、RNA和蛋白表达量相对恒定、不表现出时空和器官特异性、不受外界因素的诱导。目前在植物基因工程改良中使用最普遍的组成型启动子主要有花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、根癌农杆菌Ti质粒的胭脂碱合成酶基因NOS启动子、水稻actin启动子以及玉米泛素蛋白Ubiquitin启动子。CaMV35S启动子和NOS启动子能够驱动外源基因在大部分植物中表达，如在转基因水稻、拟南芥、小麦等植物的研究中均有应用，然而这些启动子毕竟不是来源植物，因此在植物基因工程中应用这些启动子可能会存在潜在的生物不安全性。有研究表明内源型启动子在驱动转基因盐藻外源基因的高效表达中比外源启动子更具有优势。因此，克隆植物内源组成型启动子非常重要。
[0004]组成型启动子为植物基因工程中应用最早、最广泛的一类启动子。在转基因育种或研究基因功能时，为了充分发挥外源基因表达产物的功能一般都使用组成型启动子使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。为了避免同时使用同一个启动子驱动2个或2个以上的外源基因而导致基因沉默或共抑制现象，需要用到不同的启动子分别驱动不同的外源基因、筛选基因和报告基因。虽然在先前的工作中也已经分离得到一些组成型启动子，但这些还远远不够，还需要我们做大量的工作。
[0005]本发明通过实验分析，发现启动子S0Y001P呈现出很强的组成型表达特性，在S0Y00IP转基因拟南芥中，其所驱动的报告基因GUS在转基因拟南芥的根、茎、叶和花等器官中都表现出很强的表达水平，这些数据充分表明S0Y001P是一个很强的组成型表达启动子。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一是提供一种从大豆中分离的组成型表达启动子。
[0007]本发明的目的之二是提供含有上述组成型表达启动子的表达盒、表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。[0008]本发明的目的之三是将所述的组成型表达启动子以及含有该启动子的表达载体应用与调控异源核苷酸序列在植物中的转录或表达。
[0009]本发明提供了一个能在植物各组织器官中驱动组成型表达的启动子核苷酸序列，及克隆并应用该启动子的方法。在一些实施方式中，包括(a)将核苷酸序列可操作地连接于包括SEQ ID No:1的启动子，以产生表达盒jP(b)生成含有该表达盒的转基因植物，由此在植物中表达所述核苷酸。在一些实施方式中，所述“生成”包括用表达盒转化植物细胞并从所转化的植物细胞中再生出植物。
[0010]本发明所提供的组成型表达启动子，含有序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，还包含与SEQ ID No:1中所列核苷酸序列至少具有95%相似性的核苷酸序列，可以驱动操作性连接的核苷酸序列在植物各器官中的组成型表达。
[0011]实施方案中的启动子核苷酸序列可用于从其它生物中分离相应序列，如其它植物(单子叶或双子叶植物等)。根据这些相应序列与本文所列序列间的序列同源性，使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本文所列的完整S0Y001P启动子序列(或其片段)间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。实施方案的启动子区域可从任何植物中分离，包括(但不限于)水稻、芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(Rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(Spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘鹿、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、薯蓣、观赏植物和松类等。
[0012]本文中“启动子” 一 词指DNA调控序列，其中通常含有一个TATA盒，该序列能够指导RNA聚合酶II在合适的转录起始位点上起始特定编码序列的转录。启动子也可另外含有其他识别序列，它们通常位于TATA盒的上游或5’端，被称作上游启动子元件，这些元件能够影响转录速率。应认识到当鉴别了本文所公开的启动子区域的核苷酸序列后，分离并鉴定位于本文所鉴别的特定启动子区域上游的其它调控元件就属于现有技术范围了。因此，本文公开的启动子区域可另外包含上游调控元件，如负责组织特异性和时间特异性表达的元件、调控组成型表达的元件和增强子等。
[0013]本文中的“组成型表达”是指目的基因在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达或变化很小这类基因的表达方式。本发明所提供的S0Y001P启动子就是一个在植物的各个发育阶段的根、茎、叶和花等组织器官中都有较强表达的组成型启动子。
[0014]启动子的活性和强度可以根据其驱动的报告基因的mRNA或蛋白质的表达量来测定。报告基因(importer gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来确定目的基因的表达调控特性。常用的报告基因有(6-葡萄糖苷酸酶基因GUS，和绿色荧光蛋白基因GFP。
[0015]本发明通过⑶S报告基因来检测启动子的活性和表达特性。根据⑶S基因检测所用的底物不同，有三种检测方法:组织化学法、分光光度法和荧光法(灵敏度为分光光度检测法最高)，其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷酸(X-Gluc )作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞转入了 GUS基因，并表达出了 GUS酶蛋白，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使各组织细胞中有⑶S表达活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性的强弱。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。
[0016]本发明的实施案例中也包括DNA载体，该载体含有操作性连接于异源核苷酸序列上的启动子，该启动子含有本发明公开的序列，并可在植物细胞中驱动上述异源核苷酸序列进行表达。本发明的实施方案还提供了表达载体，以及在基因组中稳定包含上述DNA载体的植物或植物细胞。“操作性连接”指使异源核苷酸序列处于启动子作用下的连接方式，也指将两个核苷酸序列连接起来从而使每个DNA片段的编码序列都保持在适当的阅读框内。“异源核苷酸序列”指天然状态下没有与本文所述启动子序列S0Y001P操作性连接的序列，对于植物宿主来说可以是同源的，或是异源的。
[0017]本文所公开的S0Y001P植物组成型表达启动子及其变异体和片段可用于植物基因工程，例如制备转化或转基因植物，以产生目的表型。“转化植物”或“转基因植物”指在基因组内含有异源核苷酸序列的植物。通常转化植物或转基因植物基因组稳定含有这些异源核苷酸序列，可将该异源核苷酸序列稳定地遗传给下一代。这些异源核苷酸序列可单独或与重组DNA载体一起存在于基因组中。这里所述的“转基因事件”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物体部分或完整植物体，只要它们的基因型被外源核酸的存在而改变，包括通过转基因操作而改变的起始宿主，以及通过这些起始宿主进行有性或无性繁殖所得的后代。这里所用的“转基因事件”并不包括通过传统植物种植方法或天然事件(例如随机杂交、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)改变了基因组(染色体或染色体外)的植物。
[0018]“转基因事件”通过以下步骤获得，使用外源DNA载体(含有核酸表达盒，其中含有本发明所提供的启动子序列)转化植物细胞，用基因组插入了外源DNA构建体的植物细胞再培养获得大量植物体，根据插入的外源基因进行筛选获得所需的阳性转基因系。转基因事件的典型表型特征是目的基因的表达。在遗传水平上，“目的基因”是植物基因组组成的一部分。“转基因事件”也指转基因植物体与其它植物体进行杂交所得的含有外源DNA的后代。
[0019]本文的“植物”包括整株植物、植物组织器官(如叶、根、茎等)、种子、植物细胞，以及它们的后代。实施方案中转基因植物的部分植株应理解为包括转基因植物或其后代的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚，及从转基因植物或其后代长出的花、茎、果实、胚珠、叶或根等。
[0020]这里所用的“植物细胞”包括但不限于种子悬浮培养物、胚芽、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子、花粉、孢子体和小孢子。可用于本文所公开方法的植物种类包括所有可进行转化的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物。
[0021]本文所公开的启动子·序列可在宿主植物中调控任何异源核苷酸序列的表达。因此，所述的异源核苷酸序列可以是操作性连接于本文所公开的启动子之上的功能基因(编码目的蛋白)。实施方案中的功能基因包括参与信号传导调控的基因如转录因子、激酶等，持家基因如热休克蛋白基因。更具体地说，转基因的种类包括如，所编码蛋白赋予植物耐受非生物逆境的抗性基因，所述非生物逆境包括干旱、温度、盐和毒素(杀虫剂和除草剂)等。或是所编码蛋白赋予植物耐受生物逆境的抗性基因，如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫的侵害，以及由这些胁迫引起的疾病。表型的编码包括改变植物中某个基因的表达，从而改变植物对病原体或昆虫等的防御机制，或是提高植物对除草剂的抗性，根据环境改变植物的生长发育过程等。这些改变可通过在植物体内表达外源基因或提高内源特定基因的表达来获得。或者是通过降低植物体内一个或多个内源基因的表达产物，如酶、转运蛋白、辅因子等，通过影响植物的代谢机制来获得相应的表型。
[0022]由上可见，可将任何目的基因操作性连接到实施方案中的启动子序列上，并在植物体中进行表达。
[0023]其中根据RNA干扰技术(RNA interference, RNAi ),操作性连接于本文所公开的S0Y001P启动子上的异源核苷酸序列，可以是某些靶基因的反义序列。“反义核苷酸序列”指一段与靶基因核苷酸序列互补的双链DNA分子。当导入到植物细胞中后，反义DNA序列的转录能阻止靶基因DNA序列的正常表达。反义核苷酸序列编码的RNA转录产物可与靶基因转录生成的内源mRNA互补，并可与其杂交，由此，靶基因编码的天然蛋白的合成就受到限制，从而获得相应的表型。
[0024]下面通过【具体实施方式】，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为载体pHPG的结构示意图。
[0026]图2是表达载 体pHPG-S0Y001P的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表不潮霉素抗性基因；Pnos表不nos基因的启动子；Tnos表不nos基因的终止子AUS表示gus蛋白基因；T35s表示35s基因的终止子；KpnI和SpeI分别表示限制性内切酶KpnI和SpeI的酶切位点；启动子即为本发明所分离鉴定的组成型表达启动子S0Y00IP。
[0027]图3是S0Y001P驱动的⑶S基因在拟南芥的幼苗和花器官的表达情况；A、B、C分别代表三个不同的转基因拟南芥的株系。
[0028]图4是转基因拟南芥的S0Y001P表达特性分析；图为转基因拟南芥⑶S基因在不同组织器官中的RT-PCR检测，其中R代表根、S代表茎、L代表叶片、F代表花。
[0029]图5是S0Y001P驱动的⑶S基因在烟草的根、茎和叶中的表达情况。
[0030]图6是转基因烟草的S0Y001P表达特性分析；图为转基因烟草⑶S基因在不同组织器官中的RT-PCR检测，其中R代表根、S代表茎、L代表叶片。
【具体实施方式】
[0031]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成，测序由北京华大基因完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，PEASY-Tl连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4 DNA连接酶购自Promega公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pHPG由本实验改造所得(载体PHPG的结构示意图为图1所示)，基本骨架来自于CAMBIA公司的PCAMBIA1303。
[0032]1.启动子S0Y001P的分离和鉴定 设计克隆启动子S0Y001P所需引物:
引物 1:5’ ggtaccATAATGCATGTGCCTGACCAG 3’
引物 2:5， actagtAGTTGCAGAGAAGAGAATCGAA 3’
引物I中序列ggtacc为KpnI的酶切位点，引物I的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；引物2中序列actagt为SpeI的酶切位点，引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0033]利用启动子的正反向引物(其中带下划线部分的序列为启动子序列)，以植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取的大豆(黑农37)基因组DNA作为模板，进行扩增，反应条件是:950C预变性5分钟；940C变性30秒；55 V退火30秒；72°C延伸I分钟；30个循环；72°C延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入PEASY-T1，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明:所扩增序列为S0Y00IP启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0034]2.构建表达载体
将测序验证已经插入S0Y001P启动子序列的质粒用KpnI和SpeI双酶切，连入同样用KpnI和SpeI双酶切的载体pHPG，挑取菌落PCR结果为阳性的菌落进行测序，测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为pHPG-SOYOOlP。
[0035]所构建的表达载体的T-DNA区的图谱如图2所示，其中:LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表不潮霉素抗性基因；Pnos表不nos基因的启动子；Tnos表不nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白基因；T35S表示35S基因的终止子；KpnI和SpeI分别表示限制性内切酶KpnI和SpeI的酶切位点；启动子即为本发明实施例1中通过PCR克隆出的组成型表达启动子。
[0036]3.农杆菌共转化
利用热激法将质粒PHPG-S0Y001P转入农杆菌AGLO菌株，利用农杆菌介导法对拟南芥和烟草进行共转化。
[0037]4.转基因拟南芥苗的⑶S染色和活性测定
从转基因拟南芥植株中挑选几株幼苗，进行GUS活性检测，将幼苗置于含有GUS染色缓冲液的EP管中，放于37°C温箱温育过夜，然后室温条件下在无水乙醇中脱色保存。
[0038]结果如图3所示，拟南芥幼苗呈现很强的表达活性，幼苗对应株系的花的GUS染色结果也呈现出很强的表达活性，说明S0Y001P启动子驱动的⑶S基因在植物的各个组织器官中都有强的表达，是一个组成型表达启动子
5.转基因拟南芥的RT-PCR分析
为了进一步确定S0Y001P启动子是否呈组成型表达，我们对其转基因苗进行了 RT-PCR分析，收集转基因拟南芥植株纯系的根、茎、叶和花器官，提取RNA，反转录为cDNA作为模板，以拟南芥ACTIN基因作为内参照，分析S0Y001P启动子驱动的GUS报告基因在转基因拟南芥中的表达情况。
[0039]RT-PCR的检测弓丨物是:
引物 3:5’ - TAATGTTCTGCGACGCTCAC -3’
【权利要求】
1.一种分离的组成型表达启动子,其特征在于,所述启动子包含SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列。
2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的组成型表达启动子和待驱动的异源核苷酸序列。
3.—种表达载体,其特征在于,含有权利要求1所述的组成型表达启动子。
4.一种制备转基因植物或其衍生物的方法，其特征在于所述转基因植物中包含权利要求2所述的表达盒。
5.权利要求4所述的方法，其中所述的植物为双子叶植物。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的双子叶植物选自大豆或油菜。
7.权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转基因植物的衍生物为所述转基因植物的种子、组织或者细胞的至少一部分。
8.权利要求4所述的方法，其特征在于，通过农杆菌介导法，在植物的至少一部分中引入权利要求3所述的表达载体。
9.一种启动子的应用，包括用于在植物中组成型表达与其操作性相连的目的基因，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
10.一种用于扩增权利要求1所述的启动子的引物对，其特征在于，包括: 第一引物，所述第一引物包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和 第二引物，所述第二引物`包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
【文档编号】A01H5/00GK103667296SQ201310731017
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年1月5日
【发明者】周君莉, 李早霞, 吴洁芳, 赵静, 卫静 申请人:北京未名凯拓作物设计中心有限公司