一种新型精子洗涤培养液及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种新型精子洗涤培养液，并公开了该精子洗涤培养液的制备方法。按照该方法制备获得的新型精子洗涤培养液，稳定可靠，溶解度良好，使用该新型精子洗涤培养液，按照一定的程序洗涤精子，并可以将精子直接保存在这种精子洗涤培养液中。通过比较样品中精子活力和存活率，证明相比于未添加神经营养因子的洗涤液，使用该种精子洗涤培养液能够明显提高精液样品中的精子活力和存活率，表现为a级精子和b级精子总和的比例增高，6小时后精子存活率提高。此新型精子洗涤培养液的促进生殖的效果，有望为临床辅助生育提供一种更加有效保留男性生育能力的措施。
【专利说明】一种新型精子洗泽培养液及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新型精子洗涤培养液，其特征是含有一定浓度的神经营养因子，并公开了该精子洗涤培养液的制备方法。按照该方法制备获得的新型精子洗涤培养液，稳定可靠，溶解度良好，使用该新型精子洗涤培养液洗涤精液样品后，能够明显加快精子的运动速度，提高精子活力，增加洗涤培养液中精子存活率和存活时间，表现为促进生殖的效果。该精子洗涤培养液可以用于体外精子制备和精子储存的培养液，应用于人工授精等辅助生殖领域。
【背景技术】
[0002]不孕不育是严重影响人类生活质量的疾病，目前全球约有10%~15%的家庭面临生育难题。世界卫生组织预测，在21世纪，不育症将成为仅次于肿瘤和心血管疾病的第三大疾病。男性不育主要由于精子浓度和活力下降引起。现代辅助生殖技术实践证明体外精子洗涤可增加精子的活力促进生殖能力。
[0003]在行宫腔内人工授精时必须行精液洗涤，而精液洗涤的主要作用包括去除精液中的前列腺素及其他可引起子宫痉挛及疼痛的物质，去除精液中可引起感染及其他副作用的细菌和化学物质，同时增加了精子的获能，从而增强其受孕能力，进而有可能去除影响精子功能的抗体。
[0004]精液洗涤方法是使用精子洗涤液，常用的精子洗涤液配方公开，由此多使用商品化的产品，也可自行配置，但是临床实践中发现一些样品使用洗涤液后会降低精子的活力，有的甚至会影响精子的受孕能力。
[0005]此外，在洗涤后有时候还需要精子培养液保存精子，以协助保持精子活力，延长存活时间。如果在洗涤过程中使用的洗涤液不具备培养液的功能，就需要更换为专门的培养液保存精子。如果在洗涤过程中使用的洗`涤液具有一定的培养液的功能，一般不需要更换专门的培养液，直接将精子保存在洗涤液中。因此有些精子洗涤液本身就是培养液，故称精子洗漆培养液。
[0006]本发明公开了一种新型的精子洗涤培养液配方，通过在现有精子洗涤培养液中添加适应浓度的神经营养因子。使用该精子洗涤培养液处理同一批精液样品，结果与现有的精子洗涤培养液比较，证明该精子洗涤培养液能够明显加快精子的运动速度，提高精子的存活率，延长精子活力的时间，有利于受孕。
【发明内容】
[0007]本发明涉及一种含有神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的新型精子洗漆培养液。发明人通过实验证明了在精子洗涤培养液中添加适宜浓度的NGF，在体外对人精子的活力具有促进作用，使精子继续保持直线运动状态，同时公开了这种精子洗涤培养液的制备方法。通过本发明获得的精子洗涤培养液可以用于体外培养条件下精子洗涤和保存，也可用于促进女性受孕能力，进而实现体外治疗由于男性精子活力下降引起的生殖障碍疾病或者用于人工辅助生殖技术，具有较好的经济效益和社会效益。
[0008]该药物组合物包括NGF和其他添加剂。本发明中作为主药的NGF —般为鼠源性，也可以是人源性或者基因工程产品等。它们在组合物中含量可以是0.1 μΜ~100 μΜ(浓度)，优选的是0.ΙμΜ~ΙΟμΜ(浓度)，更优选的是ΙμΜ~50μΜ(浓度)。
[0009]制备方法
[0010]材料
[0011]神经生长因子，鼠颌下腺提取的鼠源性NGF，可以是溶液或者冻干粉，由符合GCP认证的制药厂生产，效期安全。
[0012]基础精子洗涤培养液:可以使用商品化的精子洗涤培养液，由符合GCP认证的制药厂生产，效期安全。也可自行配置，其制备方法如下:F-104.9g，KHCO30.225g,NaHCO30.84g，乳酸钙0.142g，MgSO4.7Η200.062g,青霉素钾0.052mg,上述试剂分别溶于500ml蒸馏水中，测pH值7.3~7.5，调节渗透压为280~290mmoI / L (mOsm / kg) H2O,再用0.22 μ m微孔过滤器过滤，4°C冰箱内备用。洗涤培养液使用前，90ml洗涤培养液加IOml脐血清，37°C预温后使用。
[0013]含NGF的新型精子洗涤培养液的制备:在基础精子洗涤培养液中加入一定量NGF，控制终浓度，使用再用0.22 μ m微孔过滤器过滤除菌，4°C冰箱内备用。使用前90ml洗涤培养液加IOml脐血清，37°C预温后使用。
[0014]效果验证
[0015]采用精子洗涤培养液对精液样品进行洗涤，精液洗涤方法是使用精子洗涤培养液，将用手淫法取精液置消毒容器内，37°C液化，重复常规精液检查。取Iml精液加3ml洗涤培养液，用吸管混匀，离心1000转/分，5分钟，弃上清液，存留精子再加洗涤培养液3ml，重复离心后再弃上清液，加0.8~Iml洗涤培养液混匀，抽吸入连接一细塑料管的针筒内。
[0016]洗涤后检查洗涤培养液中精子的活力和存活率以及存活时间，通过比较不同精子洗涤培养液处理同一批精液样品的结果，评价其能够明显加快精子的运动速度，提高精子的存活率，延长精子活力的时间等方面的效果。
[0017]结果发现，按照本发明公开的制备方法获得的含有NGF的新型精子洗涤培养液，稳定可靠，溶解度良好，使用该新型精子洗涤培养液洗涤精液样品后，与基础精子洗涤培养液比较，能够明显加快精子的运动速度，提高精子的活力，表现为a级精子和b级精子的比例显著提高。
[0018]结论
[0019]本发明所涉及的含有NGF的精子洗涤培养液可以很好保持甚至增加精子的活力，若能推广应用，将有较好的经济效益和社会效益。
[0020]实施实例一:
[0021]含0.1 μ M NGF的精子洗涤培养液与基础精子洗涤培养液对精子活力的影响对比
[0022]1、材料:
[0023](I)神经生长因子，舒泰神(北京)药业有限公司生产的鼠源性NGF干粉，国药准字S20060023，为分子量26.5kD左右的蛋白，效期至2014年09月11日。
[0024](2)基础精子洗涤培养液:以韩国Mariya公司生产的H-MOPS精子培养液，效期至2015年08月10日。[0025](3)精液样品:采用的精液样品为志愿者提供，因此需要健康男性志愿者若干，按照下面的要求提供精液样品:
[0026]I)样品为正常手淫射精的样品，不能为避孕套中获取
[0027]2)样品的获得，必须严格控制在上次射精3~7天内
[0028]3)精液样品直接收集进入专门提供的样品杯中，填上射精时间和志愿者编号，盖紧样品杯盖后，在规定的时间内送到实验室或指定地点
[0029]4) 一次射精后所有样品必须全部收集进样品杯中，不得有遗漏，也不得有任何非精液成份物质混入
[0030]5)精液样品尚开身体后应该在样品杯中完好保存，防止污染。注意:人类精液属于潜在生物危险物品，请按照国际组织和国家相关法律法规处置。建议贴身保温携带，温度过低或过高可能影响精子活力判定结果
[0031]6)确保精液样品已经液化良好:精液样品室温下会在半小时以内完成液化，因此建议精液离开身体后半小时以后开始试验。同时，精液样品不适宜室温长期保存，因此建议精液离开身体后最长24小时内完成试验
[0032](4)0.9%生理盐水:石家庄四药有限公司生产，国药准字H13023200，500ml，效期至2015年I月29日。
[0033](5)人血清白蛋白(HAS):美国0^剛’5公司，六奶-3001，51111，效期至2014年6月I曰
[0034](6)含0.1 μ M NGF`的精子洗涤培养液制备:以韩国Mariya公司生产的H-MOPS精子培养液为基础，加入0.1 μ MNGF
[0035]2、方法:
[0036](I)精子洗涤:取Iml精液加3ml精子培养液(在使用前必须以6%浓度的C02平衡至37°C )，用吸管混匀，离心1000转/分，5分钟，弃上清液，存留精子再加培养液3ml，重复离心后再弃上清液，加0.8~Iml培养液混匀，抽吸入连接一细塑料管的针筒内。
[0037]对于同一个精液样品，分别取Iml平行实验，其中一份用生理盐水洗涤，另一份以韩国精子培养液洗涤，最后一份用含0.1 μ M NGF的精子培养液洗涤。
[0038](2)精子活力分析:
[0039]CASA测定精子活力:将37°C液化后的精液滴入精子计数Marker板上，用全自动精子图像分析系统检测精子的活力，截图保存。按照ABCD等级法，根据显微镜下精子活动性将精子划分为a级精子、b级精子、c级精子和d级精子，以a级精子百分比与b级精子百分比的总和标定精子活力。
[0040]3、结果:
[0041]三种精子培养液洗涤后洗涤培养液中精子如图1。
[0042]活力分析结果如图2。
[0043]可以看出，采用含洗涤后，a级精子和b级精子比例显著增加，相应的C、d级精子的比例降低，说明洗涤培养液中精子活力明显高于基础洗涤培养液组和生理盐水组。
[0044]4、结论
[0045]上述结果证明，含有0.1 μ M NGF的精子洗涤培养液，按照正确的方法洗涤精液样品，具有促进精子活力的作用。[0046]实施实例二:
[0047]10 μ M NGF与精子培养液对精子活力的影响对比
[0048]1、方法:
[0049](I)以韩国Mariya公司生产的H-MOPS精子培养液为基本成分，以0.9%生理盐水作为空白组，以韩国精子培养液作为对照组，以添加10 μ M NGF的精子培养液作为实验组，用CASA法观察不同配方精子培养液对精子活力a级精子、b级精子所占精子总数的百分率、b级精子、c级精子所占精子总数的百分率的影响。
[0050](2)、CASA测定精子活力:
[0051]将37°C液化后的精液滴入精子计数Marker板上，用全自动精子图像分析系统检测精子的活力，截图保存。按照ABCD等级法，根据显微镜下精子活动性将精子划分为a级精子、b级精子、c级精子和d级精子，以a级精子百分比与b级精子百分比的总和标定精子活力。
[0052]2、结果:
[0053]结果显示实验组可显著增加a级活动精子的数量，降低c、d级精子的比例，其对精子活力的促进作用要优于精子培养液组和生理盐水组(P〈0.01)。见图3、图4。
[0054]3、结论
[0055]上述结果表明，添加浓度为10 μ M的NGF精子培养液可改善精子活力，随着培养时间的延长，精子的活力、活率出现差异优于无NGF对照组。
【专利附图】
【附图说明】:`
[0056]图1.三种精子洗涤培养液处理后的精子，A:生理盐水洗涤后的精子；Β:含0.1 μ MNGF的精子洗涤培养液处理后精子；C =H-MOPS精子培养液处理后精子。放大倍数:400倍
[0057]图2:三种精子洗涤培养液处理后的精子活力分析结果，A:a级精子百分比，B:b级精子百分比，
[0058]C:c级精子百分比，D:d级精子百分比。*:P<0.05，与生理盐水组比较，n=12
[0059]图3.三种精子洗涤培养液处理后的精子，A:生理盐水洗涤后的精子；B:含10 μ MNGF的精子洗涤培养液处理后精子；C =H-MOPS精子培养液处理后精子。放大倍数:400倍
[0060]图4:三种精子洗涤培养液处理后的精子活力分析结果，A:a级精子百分比，B:b级精子百分比，C:c级精子百分比，D:d级精子百分比。％P〈0.05，与生理盐水组比较，n=12
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【权利要求】
1.一种用于精液样品洗涤或精子培养保存的精子洗涤培养液，其特征是含有一定浓度的神经营养因子(NGF)。
2.一种含有NGF的精子洗涤培养液的制备方法，其主要过程是在基础精子洗涤液或精子培养液中添加终浓度为0.1 μ M~100 μ M (浓度)的NGF。
3.如权利要求1的精子洗涤培养液，可以单独用于精液样品洗涤，也可以单独应用于精子培养保存，也可以应用于洗涤和后续培养保存。
4.如权利要求1的精子洗涤培养液，可以是液体，也可以是包含主要成分的冻干剂、能够在溶液和水中可快速溶解的片剂等。
5.如权利要求1的NGF，可以鼠源性或人源性组织提取，也可以基因工程产品。
6.如权利要求2的基础精子洗涤液，可以是市场化的商业化产品，也可以是实验室自行配置的非标制剂。
7.如权利要求2的基础精子培养液，可以是市场化的商业化产品，也可以是实验室自行配置的非标制 剂。
【文档编号】A01N1/02GK103805559SQ201410000549
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】林凯, 赵永岐, 范明, 刘淑红, 丁学锋, 吴燕, 吴海涛, 葛学铭, 房涛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所