显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法
【专利摘要】本发明涉及植物快速繁殖【技术领域】，旨在提供显著提高野生百合愈伤组织继代增殖率的培养方法。该培养方法包括步骤：愈伤组织的诱导培养、愈伤组织的继代培养、愈伤组织的扩增培养。本发明以百合愈伤再生体系中的直径0.3～0.5cm的小团块的愈伤组织为对象，其突出的优势在于愈伤组织处理后在较短时间内获得非常高的增殖率，显著高于常规继代的愈伤组织增殖率，并且低温处理期间无需再进行继代，从而在节约人力时间的同时获得较高的增殖率，为以愈伤组织为基础的高效扩繁体系和遗传转化体系准备条件。
【专利说明】显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物快速繁殖【技术领域】，尤其涉及显著提高野生百合愈伤组织继代增殖率的培养方法。
【背景技术】
[0002]百合胚性愈伤组织再生体系对建立遗传转化体系具有重要意义，通过继代培养保持愈伤组织系可以为后期的遗传转化提供可随时获得的原材料，由于转基因技术转化效率目前仍较低，高增殖率的愈伤组织是在短期内获得充足愈伤组织以保证不断进行转基因操作，以取得转基因的必要条件。
[0003]对于百合胚性愈伤组织的继代，现有技术主要是通过在同一种继代培养基及培养条件下培养，以4-8周为周期，将上一次继代的愈伤组织团块分成较小团块后，接种到新鲜培养基上培养，使其进一步增殖；针对现有技术的改良，已有报道主要是围绕继代培养基配方中植物生长调节剂等物质的浓度和比例的改变。但定期扩繁(每4-8周)需要较高的时间人力成本，同时扩繁增殖率相对较低。伴随继代次数增加，愈伤组织胚性退化、再生能力下降。如何能在节约人力时间的同时获得较高的愈伤组织增殖率是技术瓶颈。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法。
[0005]为解决技 术问题，本发明的解决方案是:
[0006]提供显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法，包括以下步骤:
[0007](I)愈伤组织的诱导培养:在超净工作台上，取野生百合组培苗鳞片进行愈伤诱导培养，方法是将组培苗鳞茎的鳞片用镊子或解剖刀剥离，将其鳞片尖端切除0.3cm，并在其近轴面用解剖刀划I~3个创口，接种时以创口朝下接触愈伤诱导培养基表面，愈伤诱导培养20~50天后，获得直径0.3~0.5cm的浅黄色、颗粒状的胚性愈伤组织团块，愈伤诱导率为63.3%~79.1% (其中，鳞片上的创口是产生愈伤组织的关键，创口接触培养基可以使植物充分感应培养基中的激素等物质，以产生愈伤);
[0008]所述愈伤诱导培养是在完全黑暗、25°C的愈伤诱导培养条件下进行；用于接种的愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述愈伤诱导培养基中还含有浓度为0.1~2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2, 4-D)、?~L Omg/L α -萘乙酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA)、浓度为 0.1 ~0.4mg/L 的 6-节氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的蔗糖、6~8g/L琼脂，愈伤诱导培养基的pH值为5.8 (其中，2，4- 二氯苯氧乙酸对愈伤组织的诱导是关键的)；
[0009](2)愈伤组织的继代培养:愈伤诱导培养60~90天后，在超净工作台上用镊子或解剖刀剔除愈伤组织团块中褐色的老化部分，接种到新鲜的继代培养基上；每个装有继代培养基的培养皿中接种20~30块愈伤组织团块，愈伤组织团块的直径在0.3~0.5cm之间，每4周继代一次，每次继代可获得每月2~2.5倍的增殖率，即愈伤组织团块经过一个月的培养，重量增加为接种时的2~2.5倍；
[0010]所述继代培养是在完全黑暗、25 °C的继代培养条件下进行；用于接种的继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述继代培养基中还含有浓度为0.1~2.0mg/L的2，4_D、0~Img/La -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)>0.1 ~0.4mg/L 的 6_ 节氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L的鹿糖、4~8g/L琼脂,继代培养基的pH值为5.8(其中，2，4- 二氯苯氧乙酸对愈伤组织脱分化状态的维持是关键的)；
[0011](3)愈伤组织的扩增培养:
[0012]愈伤组织团块在继代培养基上继代培养I~8个月后，将愈伤组织团块分切成
0.5cm的小块，接种到含继代培养基的培养皿上，依次用经过紫外灭菌的保鲜膜和锡纸包裹，然后进行30~60天的低温处理，低温处理条件为I~4°C，完全黑暗(低温处理能够抑制愈伤组织在继代培养基上出现的分化情况，保持愈伤组织在脱分化状态并有利于愈伤组织的增殖，黑暗条件有利于愈伤组织的诱导和增殖，保持愈伤组织的脱分化状态)；
[0013]再将低温处理后的愈伤组织团块接种到扩增培养基上，进行弱光培养，弱光培养是指在光照100~9001UX、温度25°C的条件下进行，且扩增培养基装在口径为6.35cm,高度为9.20cm的柱形瓶中； [0014]弱光培养60天后，将扩增后的愈伤组织团块分成0.3~0.5cm的小块，转接到新鲜的继代培养基上黑暗培养，黑暗培养是指:完全黑暗，温度25°C，继代培养基装在培养皿中(黑暗条件有利于愈伤组织的诱导和增殖，保持愈伤组织的脱分化状态)；经过低温处理和弱光培养后的愈伤组织团块，即为增殖率15~36.6的愈伤组织；
[0015]所述扩增培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，扩增培养基中还含有浓度为30g/L的蔗糖和4~8g/L琼脂，扩增培养基的pH值5.8。
[0016]在本发明中，步骤(3 )中，包裹培养皿的锡纸和保鲜膜间填充有脱脂棉，脱脂棉用于在低温处理和恢复常温中保护植物材料。
[0017]本发明提供的上述方法可以用于百合愈伤组织再生体系和遗传转化体系中，具体为:对上述方法获得的愈伤组织进行继代培养后分切成小块，接种到相应继代培养基上培养；用该愈伤组织在再生培养基上分化生根，炼苗、移栽即可获得百合的组织培养植株；或将该愈伤组织作为遗传转化体系的受体，经农杆菌转染或基因枪介导转化，经过筛选和鉴定，并在再生培养基上分化生根、炼苗、移栽获得百合的转基因植株。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0019]通过低温处理来源于野生百合鳞片的愈伤组织，再通过弱光常温培养和调整培养基配方，能够保存愈伤组织的活力和胚性、降低定期继代的时间劳力成本，并同时获得15~36.6倍的增殖率。
[0020]本发明以百合愈伤再生体系中的直径0.3~0.5cm的小团块的愈伤组织为对象，其突出的优势在于愈伤组织处理后在较短时间内获得非常高的增殖率，显著高于常规继代的愈伤组织增殖率，并且低温处理期间无需再进行继代，从而在节约人力时间的同时获得较高的增殖率，为以愈伤组织为基础的高效扩繁体系和遗传转化体系准备条件。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为实施例中愈伤组织分化出心形胚的电镜观察图。
[0022]图2为实施例中愈伤组织分化出鱼雷形胚的电镜观察图。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，方便本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0024]实施例1巨球百合继代I次愈伤组织的培养
[0025](I)愈伤组织的诱导培养:取巨球百合(Lilium brownii F.E.Brown ex Miellezvar.giganteum G.Y.Li&Z.H.Chen)组培苗鳞片进行愈伤诱导培养，方法是将组培苗鳞茎的鳞片用镊子或解剖刀剥离，将其鳞片尖端切除0.3cm,并在其近轴面用揭解剖刀划2个创口，接种时以创口朝下接触愈伤诱导培养表面，在完全黑暗、25°C的愈伤诱导培养条件下培养50天后，获得直径0.5cm的浅黄色、颗粒性良好的胚性愈伤组织团块，愈伤诱导率为79.1%。
[0026]用于接种的愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，还含有浓度为lmg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D)、浓度为 0.2mg/L 的 6-节氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L的鹿糖、8g/L琼脂,愈伤诱导培养基的pH为5.8。
[0027](2)愈伤组织的继代培养`:愈伤诱导培养80天后，在超净工作台上用镊子或解剖刀剔除愈伤组织团块中褐色的老化部分，接种到新鲜的继代培养基上，每个培养皿接种30块愈伤组织团块，每块愈伤组织团块直径0.3cm。在完全黑暗、25°C的继代培养条件下进行培养，每4周继代一次，获得每月2.3倍的增值率。
[0028]用于接种的愈伤继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，还含有浓度为lmg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D)、浓度为 0.2mg/L 的 6-节氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的鹿糖、4g/L 琼脂,继代培养基的 pH 为 5.8。
[0029](3)愈伤组织的扩增培养:愈伤组织团块在继代培养基上培养I个月后，获得2.3倍的增殖率，将愈伤组织团块分切成0.5cm的小块，接种到含相同的继代培养基的培养皿上，用无菌滤膜封口后，用紫外消毒后的保鲜膜和锡纸包裹，中间夹少量脱脂棉，进行30天的低温处理，低温处理条件为1°C，完全黑暗。将低温处理后的愈伤组织团块接种到扩增培养基上，扩增培养基装在口径为6.35cm，高度为9.20cm的柱形瓶中，在光照5001ux，温度25°C条件下进行弱光培养。弱光培养60天后，将扩增后的愈伤组织团块分成0.3cm的小块，转接到新鲜的继代培养基上黑暗培养，黑暗培养是在完全黑暗，温度25°C下，继代培养基装在培养皿培中。
[0030]扩增培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，还含有浓度为30g/L的蔗糖和4g/L琼脂，扩增培养基的pH为5.8。
[0031]经过扩增培养，愈伤团块增长迅速，愈伤团块体积大而不规则，接种到扩增培养前相同的含继代培养基的培养皿上，可获得900块直径5mm的愈伤组织团块，增殖率达到1:30。
[0032]实施例2巨球百合短期继代愈伤组织培养
[0033](I)取巨球百合(Lilium brownii F.E.Brown ex Miellez var.giganteumG.Y.Li&Z.H.Chen)组培苗鳞片进行愈伤诱导培养，方法是将组培苗鳞茎的鳞片用镊子或解剖刀剥离，将其鳞片尖端切除0.3cm,并在其近轴面用解剖刀划I个创口，接种时以创口朝下接触愈伤诱导培养表面，在完全黑暗、25°C的愈伤诱导培养条件下培养40天后，获得直径0.4cm的浅黄色、颗粒性良好的胚性愈伤组织团块，愈伤诱导率为63.3%。
[0034]用于接种的愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，还含有浓度为2mg/L的2，4-二氯苯氧乙
酸(2，4-dichlorophenoxyacetic，2，4-D)、0.5mg/Lα -萘乙 酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA)、浓度为 0.4mg/L 的 6-节氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的鹿糖、7g/L琼脂，愈伤诱导培养基的pH为5.8。
[0035](2)愈伤组织的继代培养:愈伤诱导培养90天后，在超净工作台上用镊子或解剖刀剔除愈伤组织团块中褐色的老化部分，接种到新鲜的继代培养基上，每个培养皿25块愈伤组织团块，每块愈伤直径0.4cm。在完全黑暗、25°C的继代培养条件下进行培养，每4周继代一次，可获得每月2倍的增值率。
[0036]用于接种的愈伤继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培 养基添加4.43gMS粉，含有浓度为2mg/L的2，4-二氯苯氧乙M.(2,4-dichlorophenoxyacetic,2, 4-D)>0.5mg/L α -萘乙 酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA)、浓度为 0.4mg/L 的 6-节氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的鹿糖、6g/L琼脂，愈伤继代培养基的pH为5.8。
[0037](3)愈伤组织的扩增培养:愈伤组织团块在继代培养基上培养3个月后，获得每月2倍的增殖率，将愈伤组织团块分切成0.5cm的小块，接种到含相同的继代培养基的培养皿上，用无菌滤膜封口后，用紫外消毒后的保鲜膜和锡纸包裹，中间夹少量脱脂棉，进行60天的低温处理，低温处理条件为3°C，完全黑暗。将进过低温处理后的愈伤组织团块接种到扩增培养基上，扩增培养基装在口径为6.35cm、高度为9.20cm的柱形瓶中，在光照lOOlux，温度25°C条件下进行弱光培养60天后，将扩增后的愈伤组织团块分成0.4cm的小块，转接到新鲜的继代培养基上黑暗培养，黑暗培养是指完全黑暗、温度25°C的条件，继代培养基装在培养皿培中。
[0038]扩增培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，还含有浓度为30g/L的蔗糖和6g/L琼脂，扩增培养基的pH为5.8。
[0039]经过扩增培养，愈伤团块增长迅速，愈伤团块体积大而不规则，接种到扩增培养前相同的含继代培养基的培养皿上，可获得450块直径5mm的愈伤组织团块，增殖率达到1:15。
[0040]实施例3巨球百合长期继代愈伤组织的培养
[0041](I)取巨球百合(Lilium brownii F.E.Brown ex Miellez var.giganteumG.Y.Li&Z.H.Chen)组培苗鳞片进行愈伤诱导培养，方法是将组培苗鳞茎的鳞片用镊子或解剖刀剥离，将其鳞片尖端切除0.3cm,并在其近轴面用揭解剖刀划3个创口，接种时以创口朝下接触培养基表明为宜，在完全黑暗、25°C的愈伤诱导培养条件下培养20天后，获得直径0.3cm的浅黄色、颗粒性良好的胚性愈伤组织团块，愈伤诱导率为78.1%。
[0042]用于接种的愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog，1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，还含有浓度为0.lmg/L的2，4-二氯苯氧乙M.(2, 4-dichlorophenoxyacetic,2, 4~D)>1.0mg/L α -萘乙 酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA)、浓度为 0.lmg/L 的 6-节氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的鹿糖、6g/L琼脂，愈伤诱导培养基的pH为5.8。
[0043](2)愈伤组织的继代培养:愈伤诱导培养60天后，在超净工作台上用镊子或解剖刀剔除愈伤组织团块中褐色的老化部分，接种到新鲜的继代培养基上，每个培养皿20块愈伤组织团块，每块愈伤组织团块直径0.5cm。在完全黑暗、25°C的继代培养条件下进行培养，每4周继代一次，可获得每月2.5倍的增殖率。
[0044]用于接种的愈伤继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基即每升培养基添加4.43gMS粉，还含有浓度为0.lmg/L的2，4-二氯苯氧乙M.(2,4-dichlorophenoxyacetic,2, 4~D)>1.0mg/L α -萘乙 酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA)、浓度为 0.lmg/L 的 6-节氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的鹿糖，8g/L琼脂，愈伤继代培养基的pH为5.8。
[0045](3)愈伤组织的扩增培养:愈伤组织团块在继代培养基上继代培养8个月后，将愈伤组织团块分切成0.5cm的小块，接种到含相同的继代培养基的培养皿上，用无菌滤膜封口后，用紫外消毒后的保鲜膜和锡纸包裹，中间夹少量脱脂棉，进行45天的低温处理，低温处理条件为4°C，完全黑暗。将进过低温处理后的愈伤组织团块接种到扩增培养基上，扩增培养基装在口径为6.35cm、高度为9.20cm的柱形瓶中，在光照9001ux，温度25°C条件下进行弱光培养60天后，将扩 增后的愈伤组织团块分成0.5cm的小块，转接到新鲜的继代培养基上黑暗培养，黑暗培养是指完全黑暗、温度25°C的条件，继代培养基装在培养皿培中。
[0046]扩增培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，还含有浓度为30g/L的蔗糖、8g/L琼脂，扩增培养基的pH为5.8。
[0047]经过扩增培养，愈伤团块增长迅速，愈伤团块体积大而不规则，接种到扩增培养前相同的含继代培养基的培养皿上，可获得1100块直径5_的愈伤组织团块，增殖率达到1:36.6。
[0048]最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)愈伤组织的诱导培养:在超净工作台上，取野生百合组培苗鳞片进行愈伤诱导培养，方法是将组培苗鳞茎的鳞片用镊子或解剖刀剥离，将其鳞片尖端切除0.3cm，并在其近轴面用解剖刀划I~3个创口，接种时以创口朝下接触愈伤诱导培养基表面，愈伤诱导培养20~50天后，获得直径0.3~0.5cm的浅黄色、颗粒状的胚性愈伤组织团块，愈伤诱导率为63.3% ~79.1% ； 所述愈伤诱导培养是在完全黑暗、25°C的愈伤诱导培养条件下进行；用于接种的愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述愈伤诱导培养基中还含有浓度为0.1~2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2, 4-D)、0 ~1.0mg/L α -萘乙酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA)、浓度为 0.1 ~0.4mg/L 的 6-节氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的蔗糖、6~8g/L琼脂，愈伤诱导培养基的pH值为5.8 ; (2)愈伤组织的继代培养:愈伤诱导培养60~90天后，在超净工作台上用镊子或解剖刀剔除愈伤组织团块中褐色的老化部分，接种到新鲜的继代培养基上；每个装有继代培养基的培养皿中接种20~30块愈伤组织团块，愈伤组织团块的直径在0.3~0.5cm之间，每4周继代一次，每次继代可获得每月2~2.5倍的增殖率，即愈伤组织团块经过一个月的培养，重量增加为接种时的2~2.5倍； 所述继代培养是在完全黑暗、25 °C的继代培养条件下进行；用于接种的继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述继代培养基中还含有浓度为0.1~2.0mg/L的2，4_D、0~Img/La -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)>0.1 ~0.4mg/L 的 6_ 节氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L的鹿糖、4~8g/L琼脂,继代培养基的pH值为5.8 ； (3)愈伤组织的扩增培养: 愈伤组织团块在继代培养基上继代培养I~8个月后，将愈伤组织团块分切成0.5cm的小块，接种到含继代培养基的培养皿上，依次用经过紫外灭菌的保鲜膜和锡纸包裹，然后进行30~60天的低温处理，低温处理条件为I~4°C，完全黑暗； 再将低温处理后的愈伤组织团块接种到扩增培养基上，进行弱光培养，弱光培养是指在光照100~9001ux、温度25°C的条件下进行，且扩增培养基装在口径为6.35cm，高度为9.20cm的柱形瓶中； 弱光培养60天后，将扩增后的愈伤组织团块分成0.3~0.5cm的小块，转接到新鲜的继代培养基上黑暗培养，黑暗培养是指:完全黑暗，温度25°C，继代培养基装在培养皿中；经过低温处理和弱光培养后的愈伤组织团块，即为增殖率15~36.6的愈伤组织； 所述扩增培养基以MS培养基(Murashige and Skoog, 1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，扩增培养基中还含有浓度为30g/L的蔗糖和4~8g/L琼脂，扩增培养基的pH值5.8。
2.根据权利要求1所述的显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，包裹培养皿的锡纸和保鲜膜间填充有脱脂棉，脱脂棉用于在低温处理和恢复常温中保护植物材料。
【文档编号】A01H4/00GK103798140SQ201410037346
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】夏宜平, 张琳 申请人:浙江大学